Dieses Protokoll basiert auf Techniken, die in dem Labor von Francis-André Wollman am Institut de Biologie Physikalisch-Chimique, Paris, Frankreich gelernt basiert. Die Autoren schulden Dank Jacqueline Girard-Bascou, die ursprünglich eingeführt DBS zu Chlamydomonas genetischen Techniken. Chlamydomonas Forschung in der Autoren-Labor von der National Science Foundation Award MCB-0646350 wird unterstützt.

Teil 1: Vorbereitung der Stämme für Gametogenese Hinweis: Alle Manipulationen sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Höhere oder niedrigere Temperaturen beeinträchtigen die Geschwindigkeit der Zygote Keimung und können sich negativ auf die Lebensfähigkeit. Wichtige Überlegung: Es ist wichtig, dass die Stämme zu paaren sind robust wachsen und sind frei von verunreinigenden Pilze oder Bakterien. Wenn die Stämme nicht regelmäßig übertragen worden sind, sollten Passage auf Vollmedium vorausgehen Generation von Keimzellen. <ol><li> Strains zu verpaart werden auf TAP-Platten (100 × 15 mm), 1-2 Stämme pro Platte übertragen. Die Zellen sollten in eine konzentrierte Streifen ca. 1 cm in der Breite angebaut werden. </li><li> Inkubation auf TAP Platten sollte bis eine dicke Schicht robust wachsenden Zellen vorhanden ist, mit Zwischen-Transfers, wenn nötig. Stämme, die nicht kürzlich passagiert eventuell ein Durchgang und insgesamt 1 Woche, während Wildtyp-Stämme in regelmäßigen Gebrauch nur kann ein paar Tage und keine Passagen. Mutanten, die lichtempfindlich sind eventuell zusätzliche Zeit. </li><li> Übertragen Sie alle Zellen aus der TAP Platten N10 Platten, die noch unzureichend für Stickstoff und beginnt zu Gametogenese induzieren. Übertragen Sie die Zellen als eine dicke Platte, so wie sie auf dem TAP-Platte wurden. Dies erleichtert die anschließende Sammlung der Zellen. Nach 3 Tagen auf N10 werden die Zellen bereit, Gametogenese unterziehen. Die Zellteilung wird langsam auf N10, jedoch Zellen sollten dunkelgrün bleiben. Jede kontaminierte Stämme zu verwerfen als lebensfähig Zygoten nicht erreicht werden wird. </li></ol> Teil 2: Mating <ol><li> Jeder Stamm wird in einen 50 ml Erlenmeyerkolben überführt und erneut in ca. 2,5 ml sterilem destilliertem Wasser. Dies kann entweder mittels einer Drahtschlinge oder einer sterilen Stick sein, was wichtig ist, dass die Zellen gut suspendiert sind und nicht in Klumpen. Die genaue Menge Wasser sollte so eingestellt sein, dass die Zellkonzentration, wie mit dem Auge abschätzen, etwa die gleiche für jeden Stamm ist. </li><li> Die Zellen werden unter starkem Licht (1,260 μ E / m 2 / sec) für 2 Stunden gerührt, während welcher Zeit die Zellen beweglich Gameten werden. Motilität sollte unter einem Lichtmikroskop überprüft werden. Wenn die Gameten schlecht schwimmen, ist Paarung wahrscheinlich ineffizient. Allerdings wird auch schlecht bewegliche Stämme Kumpel eine verminderte Häufigkeit. </li><li> Next gleiche Volumen von mt + und mt-Gameten sind in einem einzigen 50 ml Flasche kombiniert. Gameten werden unter starkem Licht (1,260 μ E / m 2 / sec) ohne Bewegung nach links. </li><li> Mating sofort unter dem Lichtmikroskop überprüft werden. Paare von Gameten bilden sich rasch, und erscheint so schnell bewegenden Zellen trat bei der Geißeln. Wenn Paarung zu sein scheint extrem schnelle, sollten die Proben innerhalb von 30 min -1 hr für die Erzeugung von Zygoten genommen werden. Wenn nicht, können Paarung jede Stunde überprüft werden, obwohl dies optional. Seit Zeiten geben die optimale Dichte von Zygoten stark variieren wird zwischen kreuzt, ist es am besten, Aliquots der Paarung Mischung zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Vereinigung Gameten, z. B. nach 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden und 4 Stunden. 3-4 Punkte pro Platte; Dies ist durch die Übertragung von 300 ul Proben TAP-3% Difco-Agar 60 × 15 mm-Platten durchgeführt. Achten Sie darauf, nicht auf die Paarung Mischung rühren, als dieser Paarung Paare stören können. Difco-Agar wird verwendet, weil sie weniger Schadstoffe als preisgünstigere Agars hat, und es wird einfacher sein, Zygoten unter dem Mikroskop zu sehen. Die nicht verwendeten Paarung Mischung kann in der Flasche über Nacht stehen gelassen werden, und die Qualität der Paarung Reaktion wird offensichtlich am nächsten Tag. Beim Stecken effizient ist, werden die Zygoten an der Wand oder Boden des Kolbens haften und das Medium erscheint klar. Auch Bewegung der Kolben wird nicht die Zygoten zu entfernen. Wenn nichts haftet an Glas, wenn die Mischung mit hinreichender Kraft bewegt wird, dann Paarung war ineffizient oder gar nicht stattfinden. </li><li> Die TAP-Difco-Platten, die Paarung Mischung in eine sterile Haube getrocknet, mit dem Deckel offen, bis jeder Oberfläche Flüssigkeit aufgesogen ist. Die Platten sind in der Regel in das Licht (700 nE / m 2 / sec) für 18 Stunden belassen, dann in Folie verpackt, da Zygospore Reifung nur stattfinden wird in der Dunkelheit. Die Stämme gekreuzt, Paarung Uhrzeit und Datum werden auf beiden Platten und die Folie geschrieben. Platten gespeichert sind 5 bis 7 Tage und länger gehalten werden, obwohl Zygote Keimung Effizienz sinkt schrittweise. </li></ol> Teil 3: Tetrad Dissection <ol><li> Vegetative Zellen sollten ausgeschaltet werden getrocknet Flecken der Paarung Mischung mit einer stumpfen Klinge, wie ein Skalpell abgekratzt. Die Klinge kann verwendet werden, um eine Fläche von Zygoten, die dicht halten wird, die 3%-Agar freizulegen. Dieser Schritt ist in der Regel nachmittags durchgeführt, so dass die Zygoten haben am nächsten Morgen gekeimt, aber nicht eine zweite, vegetative Teilung, die würde unterzogenAusbeute 8 Nachkommen. Chlamydomonas Biologen lernen schnell, Zygoten unter dem Mikroskop zu erkennen, da sie größer als vegetative Zellen, und verfügen über einen dicken Zygospore Wand, die eine schwarze Kontur verleiht. Zygosporen oft gelb erscheinen, kann aber auch etwas grün. Die wichtigste Zeichen ist, dass sie auf Agar-Stick, während vegetative Zellen leicht bewegt werden beiseite. Allerdings sind, wenn die Platten zu trocken wird dies nicht der Fall sein. Auch, wenn die Paarung Mischung zu dicht wurde, kann Zygoten Form einer Matte, die machen Übertragung einzelner Zygoten schwierig oder unmöglich wird. Entsprechende Dichten sind in Schritt 2.1 etabliert und wird schnell mit der Erfahrung gelernt werden. </li><li> Glass Nadeln sind für die Sammlung und Trennung Zygoten Tetrade Nachkommen vorbereitet. Diese werden durch Ziehen 3 mm Glasstäbe in einer kleinen Flamme zu einem langen, dünnen Faden, der auch scheitern kann generieren vorbereitet. Die Spitzen dieser verjüngten Enden geglättet oder in die Haken gebogen, durch kurzes Erhitzen in einer kleinen Flamme (z. B. Alkohol oder ein brennendes Zündholz). Bereiten Sie 3 oder mehr Glasnadeln, da sie relativ leicht zu brechen, vor allem für unerfahrene Anwender. </li><li> Zygoten auf die 3%-TAP-Difco Platte mit einem Glas Nadel in einen kleinen Haufen versammelt. Ein Quadrat von Agar (bis 0,5 cm 2) mit den Zygoten gebildet und ausgeschnitten mit einem stumpfen Skalpell. Dann wird der Agar-Block Gesicht nach unten auf eine 15 mm 1,5% TAP-Difco Platte, und rutschte entlang einer horizontalen Linie ca. 1,5 cm von der Oberseite der Platte, auf die Zygoten zu verteilen. Die obere horizontale Linie, und ein Gitter mit ca. 1,5 cm horizontal und 0,5 cm vertikalen Abstand in die Rückseite der Platten geätzt. Das Raster wird verwendet am folgenden Tag als Leitfaden für die Trennung der Tetrade Nachkommen (das Netz kann auch der Tag der Dissektion geätzt werden). Schließlich sind einzelne Zygoten auf die Schnittpunkte der oberen horizontalen Linien mit jeweils vertikalen Linie bewegen, mit etwa 20-30 Zygoten pro Platte. Obwohl nur 12 oder so wird seziert, nicht jede Zygote keimt, und einige werden zweimal teilen vor dem Bersten sind so zusätzliche Zygoten benötigt. </li><li> Nach der Verteilung der Zygoten und vegetativen Zellen, die versehentlich von der 3%-Agar-Platte übertragen werden, indem die umgekehrte Platte für 30 Sekunden bei einem Glas Schale mit einer dünnen (1-2 mm) Schicht aus Chloroform getötet. Der Abstand zwischen der Platte und Chloroform sollte etwa 5 cm betragen. Wenn zu viel Chloroform verwendet wird, oder wenn der Abstand zu klein oder groß, riskiert man entweder die Tötung der Zygoten, oder nicht die Tötung der vegetativen Zellen. Die Chloroform-Behandlung muss sofort erfolgen, nachdem die Zygosporen auf die Keimung Platte verteilt worden sind, um die Selektivität zu gewährleisten. </li><li> Die Keimung dauert 16-20 Stunden für die meisten Stämme, sondern wird mit Genotyp und mit dem Alter der Zygoten variieren. Für die Keimung werden die Platten unter schwachem Licht (239 nE / m 2 / sec) platziert oder in Medium Licht durch das Abdecken der Platte mit einem Gewebe abgeblendet. </li><li> Gekeimten Zygoten können unter dem Mikroskop als geschwollen oder manchmal platzen Zellen mit Tochterzellen in ihnen identifiziert werden. Wenn die Zygospore nicht gebrochen hat, wird sanft berührte mit einem Glas Nadel brechen die Wand, wenn die Keimung erfolgt ist. Daughter Zellen werden vorsichtig auf die Rasterpunkte unterhalb der Zygote gezogen. Am einfachsten ist es, diese durch die Erfassung der Zelle in eine kleine Menge flüssigen Medium aus dem Agar durch den Druck des Glases Nadel freigesetzt, und ziehen diese &quot;Pfütze&quot; hinter der Nadel zu tun. Eine Form der &quot;Versicherung&quot;, dass man eine Zygote und nicht um eine vegetative Zelle, die zweimal geteilt hat seziert, ist, dass abgesehen von den vier Tochter-Zellen, die &quot;Haut&quot; der Zygospore Wand bleiben. </li><li> Die seziert Nachkommen sind unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, bis sichtbare clonies für die anschließende Analyse ausgewählt werden können. Die Platten sollten täglich auf Verschmutzungen kontrolliert werden. </li></ol> Hinweis: Generation des vegetativen Diploiden wird hier nicht behandelt, aber im Wesentlichen um Ausplattieren der Paarung Mischung auf Medium, das nicht unterstützt wird das Wachstum der beiden elterlichen Stammes, sondern wird das Wachstum des diploiden (zB zwei verschiedene auxotrophen Marker) zu unterstützen. Die Platten werden in das Licht, um die Bildung von Zygoten vermeiden gehalten.

<ol>
	<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+Sourcebook:+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use.">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 119-273 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Genetische Analyse ist einfach in Chlamydomonas, aber es erfordert spezielle Techniken, um Gameten und separate Tetrade Nachkommen zu erzeugen. Mit gesunder Stämme sind die Techniken leicht erworben. Bei einigen Mutanten, wird es eher eine Kunst, und der Leser sollte Band 1 der kürzlich veröffentlichten Chlamydomonas Sourcebook für historische Anmerkungen und praktische Hinweise beziehen. Darüber hinaus ist anzumerken, dass es viele Variationen über das Grundthema oben beschrieben, von der Method...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CC-125</td>
<td>Mating type plus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC-124</td>
<td>Mating type minus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-Acetate-Phosphate (TAP) </td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N10</td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Stainless-Steel Blades</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-916-5B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Surgical Blade Handles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-914-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Metal Scalpels</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-920A</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mating and tetrad separation of chlamydomonas reinhardtii for genetic analysis

Die einzellige Grünalge<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt; (<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;) Hat sich zu einem beliebten Organismus für die Forschung in den verschiedensten Bereichen der Zellbiologie und Genetik wegen seiner einfachen Lebenszyklus, Leichtigkeit des Wachstums und der Manipulation der genetischen Analyse genomischer Ressourcen und Wandelbarkeit des Kerns und beide Organellen. Mating-Stämme ist eine gängige Praxis, wenn genetische Ansätze in werden<em&gt; Chlamydomonass</em&gt;, Um vegetative Diploiden für die Analyse von Dominanz zu erstellen, oder folgende Tetrade Dissektion feststellen nuklearen vs Organellen Erbe, auf Allelietest, um epistasy analysieren, oder die Bevölkerung zum Zwecke der map-basierte Klonen zu erzeugen. Darüber hinaus sind genetische Kreuze routinemäßig verwendet, um Organellen Genotypen mit bestimmten nuklearen Genotypen zu kombinieren. Hier zeigen wir Standard-Methoden zur Gametogenese, Paarung, Zygote Keimung und Tetrade Trennung. Dieses Protokoll besteht aus einem einfach zu folgen Reihe von Schritten, um genetische Ansätze zugänglich Wissenschaftler, die weniger vertraut sind werden<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;. Key-Parameter und Krisenherde sind erläutert. Schließlich werden die Ressourcen für weitere Informationen und alternative Methoden zur Verfügung gestellt.

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Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Paarung und Tetrade Trennung sind für die genetische Analyse benötigt<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em&gt;. Hier zeigen wir Standard-Methoden zur Gametogenese, Paarung, Zygote Keimung und Tetrade Dissektion. Dieses Protokoll besteht aus einem einfach zu folgen Reihe von Schritten, um genetische Ansätze zugänglich Wissenschaftler, die weniger vertraut sind werden<em&gt; Chlamydomonas</em&gt;.

Paarung und Tetrad Trennung von Chlamydomonas reinhardtii Für genetische Analysen

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

mating-tetrad-separation-chlamydomonas-reinhardtii-for-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

19.8K Aufrufe.  Cornell University. Paarung und Tetrade Trennung sind für die genetische Analyse benötigt Chlamydomonas reinhardtii. Hier zeigen wir Standard-Methoden zur Gametogenese, Paarung, Zygote Keimung und Tetrade Dissektion. Dieses Protokoll besteht aus einem einfach zu folgen Reihe von Schritten, um genetische Ansätze zugänglich Wissenschaftler, die weniger vertraut sind werden Chlamydomonas.

Serie: Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Hell / Dunkel Transition Test für Mäuse

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Forschung

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection der hippocampalen von erwachsenen Maus

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...