Wir danken Kymberlee O&#39;Brien, Celia Moore, und Edward Tronick (Department of Psychology, University of Massachusetts, Boston) für die Bereitstellung der menschlichen Haarproben in dieser Studie analysiert und Stephen Suomi und Amanda Dettmer (Labor für Vergleichende Verhaltensforschung, NICHD) für Bereitstellung der Rhesusaffen Haarproben. Anfängliche Entwicklung und weitere Nutzung dieser Methode wurde von NIH RR11122 MAN unterstützt

1. Entnahme und Lagerung <ol><li> Menschliches Haar <ol><li> Sichern die gesamte Länge der Haare (bis zu einem Stift-Breite im Durchmesser) mit einem Gummiband oder Clips abgetastet werden. Haare schneiden so nah an der Kopfhaut wie möglich (dabei nicht zu nick der Haut) mit einer sauberen Schere. Hinweis: Die Standard-Probenentnahmebereich ist der hintere Scheitelpunkt des Schädels. </li><li> Einige Forscher haben einen Rückgang in den Menschenhaar CORT Ebenen mit der Entfernung von der Kopfhaut 6, die aufgrund von wiederholten Kontakt mit Wasser und Shampoo 7 Auswaschen sein kann, wenn auch sehen Manenschijn et al. 8 Thomson et al. 9 zum Gegenteil führt berichtet (und die kein Segment Rückgang beobachtet wurde) Um die Auswirkungen dieses Potenzial &quot;Washout-Effekt&quot; zu minimieren, empfehlen wir die proximalen Segmente sammeln Haare auf der Kopfhaut mit einer Länge von nicht mehr als 3 cm (bei ​​einer durchschnittlichen Wachstumsrate von 1 cm / Monat 10, eine 3 cm Segment enthält CORT, die etwa über die letzten 3 Monate hinterlegt wurde). Um dies zu erreichen, verwenden Sie ein Lineal, um 3 cm vom ersten Schnitt messen und wieder geschnitten, um die 3 cm Probe zu erhalten. Hinweis: Sobald das Haar auf Länge geschnitten wurde, ist es nicht mehr notwendig, um die Stränge in Ausrichtung zu halten, es sei denn die Studie beinhaltet das Schneiden der Probe in separate 1 cm lange Segmente eine Retrospektive Kalender CORT Abscheidung über den Zeitraum vor der Probenahme zu etablieren 6. </li><li> Platzieren Sie die Haarprobe in einem Beutel aus Aluminiumfolie, einem sauberen Papierumschlag oder ein 15 ml-Schraubdeckel-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen des Typs zur Proben Waschen verwendet wird. Als Cort im Haar 2 extrem stabil, Proben unbegrenzt bei -20 ° C gelagert werden, falls erforderlich, über Nacht bei Raumtemperatur versandt. </li><li> Das Haar Sammlung Verfahren sollte an Freiwilligen durchgeführt werden und die Praxis Proben sollten vor Antritt einer vollständigen Studien abgewogen werden. Hinweis: Haarproben, wie small 5-10 mg können mit den hier beschriebenen Verfahren analysiert werden, obwohl es wünschenswert ist, um Proben&gt; 10 mg sammeln, um die Wahrscheinlichkeit zu erhalten EIA-Ablesungen unter der niedrigsten CORT Standard minimieren. </li></ol></li><li> Affe Haar <ol><li> Shave Haar (100-250 mg) aus dem Nacken mit einem Standard-Tierschermaschine. Rasieren Sie so nah an der Haut wie möglich, darauf achtend, nicht nick die Haut und verursachen Blutungen, weil das Blut der Kortikosteroid-Konzentration im Vergleich zu denen in der Haar gefunden werden, sind extrem hoch. Hinweis: Die Hals-Bereich wurde für die routinemäßige Stichproben gewählt, weil es in der Regel eine gute Quelle der Haare und kann leicht für das Nachwachsen der Haare vor dem Resampling beobachtet werden. </li><li> Legen Sie die Haarprobe in einem Beutel aus Aluminiumfolie oder einer 15 ml mit Schraubverschluss Polypropylen-Zentrifugenrohr. Affenhaar Proben gespeichert und in der gleichen Weise wie oben für den menschlichen Haarproben beschrieben versendet. </li><li> Da Affen Haare, im Gegensatz zu menschlichen Kopfhaar wächst zu einer bestimmten Länge und dann stops wachsenden 11, ist es im Allgemeinen nicht möglich ist in diesem Fall, um Abstand von der Haut als Kalender für CORT Abscheidung zu verwenden. Allerdings, wenn ein Tier mehr als einmal (zum Beispiel während der regelmäßigen Routinegesundheitsprüfungen) abgetastet werden, ist es wünschenswert, eine erste Rasur durchführen, um eine Grundlinie Zeitpunkt festzulegen und dann reshave den gleichen Bereich, nachdem die gewünschte Zeit abgelaufen ist. CORT in der zweiten Probe wurde während der Rasur-reshave Intervall, das eine genaue Zuordnung der CORT-Gehalt der Probe zu HPA-Aktivität über dieses Intervall 5 ermöglicht abgeschieden. </li></ol></li></ol> 2. Beispiel Waschen und Trocknen <ol><li> Wasch <ol><li> Platzieren Sie jede Haarprobe in eine 15 ml mit Schraubverschluss Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. </li><li> 5 ml der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)-grade Isopropanol zu jedem Röhrchen, gefolgt von wiederholten Umkehrung für 3 min unter Verwendung eines Rotors. </li><li> Dekantiert die Isopropanol in einen Abfallbehälter, wobei cnicht zu einem Proben verlieren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 und 2.1.3 noch einmal. </li></ol></li><li> Die Trocknung <ol><li> Trocknen Sie das Haar für mindestens 2-3 Tage, um komplette Isopropanol Verdunstung zu gewährleisten. </li></ol></li></ol> 3. Beispiel Schleifen und CORT Extraktion - Methode 1 für große Proben <ol><li> Probenschleifen <ol><li> Legen Sie bis zu 250 mg getrocknetes Haar in einen 10 ml Mahlbecher aus rostfreiem Stahl mit einem einzigen 12-mm-Edelstahlschleif Kugel. </li><li> Mahlen die Probe für 6 Minuten bei einer Geschwindigkeit von 25 Hz unter Verwendung einer Kugelmühle. </li><li> Wiegen bis zu 50 mg Pulver Haar auf einer Analysenwaage und übertragen sie auf eine saubere 2,0 ml Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen für die anschließende Extraktion CORT dann. </li></ol></li><li> CORT Extraktion <ol><li> 1,0 ml HPLC-Methanol zu dem Mikrozentrifugenröhrchen pulverförmige Probe enthält. </li><li> Verschließe das Röhrchen und Inkubation der Probe für 18-24 h bei Raumtemperatur mit COnStant Inversion mit einem Rotator. </li><li> Zentrifugieren der Röhrchen bei 14.000 Upm für 1 min bei Raumtemperatur, um das pulverförmige Haarpelletieren. </li><li> Übertragen Sie 0,6 ml der Überstand in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, kümmert sich nicht um das Pellet von pulverförmigen Haare stören. </li></ol></li></ol> 4. Beispiel Schleifen und CORT Extraktion - Methode 2 für kleine Proben <ol><li> Probenschleifen <ol><li> Platzieren von bis zu 60 mg des Haares in eine vorgewogene 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen für Korn Schlagen verstärkt. </li><li> Erneut wiegen, das Fläschchen, um die Probengewicht zu erhalten. </li><li> Fügen Sie drei 3,2 mm Chromstahlkugeln in jedes Fläschchen und dann mahlen die Probe für mindestens 2 min in einer Kugelmühle. Bei der Sichtprüfung zeigt, dass die Probe nicht ausreichend pulverisiert, dann führen weitere Schleif für 0,5 oder 1 min. Hinweis: Keine Übertragung der Masse Haar ist in diesem Fall erforderlich, da CORT Extraktion wird in der gleichen Gefäß wie das Schleifen durchgeführt wird. </li></ol&gt; </li><li> CORT Extraktion <ol><li> 1,5 ml von HPLC-Qualität von Methanol zu dem Mikrozentrifugenröhrchen pulverförmige Probe enthält. </li><li> Verschließe das Röhrchen und Inkubation der Probe für 18-24 h bei Raumtemperatur unter konstantem Inversion unter Verwendung eines Rotators. </li><li> Zentrifugieren der Röhrchen bei 10.000 rpm für 5 min bei Raumtemperatur, um das pulverförmige Haarpelletieren. Hinweis: Die Chromstahlkugeln verbleiben in dem Rohr mit dem Haar während der Extraktion und Zentrifugation Schritte, die für den unteren Drehzahlkonten Zentrifugieren im Vergleich zu Verfahren 1. </li><li> Übertragen Sie 1,0 ml der Überstand in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, kümmert sich nicht um das Pellet von pulverförmigen Haare stören. </li></ol></li></ol> 5. Lösungsmittelverdampfung und Proben Rekonstitution <ol><li> Trocknen Sie die Methanol unter Verwendung entweder eines Vakuumverdampfers oder eines Stroms von Stickstoffgas bei einem Vakuumverdampfer ist nicht verfügbar. Wenn ein Vakuumverdampfer verwendet wird, kann der Methanoldampf mittels eingeschlossen werdeneiner Kühlfalle oder einem chemischen Falle mit einer Aktivkohlepatrone ausgestattet. </li><li> Nach Entfernung des Methanols rekonstituieren Cort Extrakt in einem geeigneten Volumen von EIA-Assay-Puffer (Assayverdünnungsmittel). Wenn relativ hohen CORT Werte zu erwarten sind, dann verwenden Sie ein Puffervolumen von 0,4 ml oder mehr. Wenn relativ niedrige Werte zu erwarten sind, dann wird das Volumen auf 0,2 ml oder weniger verringert werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Hinweis: 0,2 ml ausreichend Volumen, um doppelte Aliquots der Probe mindestens zweimal im Falle laufen eine Wiederholung der Probe erforderlich ist. </li><li> Entweder testen die rekonstituierte Probe sofort oder frieren sie bei -20 ° C für spätere Analysen. Hinweis: Falls die rekonstituierte Probe eingefroren ist, ist es wichtig, Sublimation während des Gefrier Zeitraum seit einer Änderung in Probenvolumen zu vermeiden, wird zu einem falschen Wert CORT, wenn die endgültigen Berechnungen durchgeführt werden führen. </li></ol> 6. CORT Assay und Datenkonvertierung <ol><li> Assay die Haar Extrakte fürCORT mit einem hochempfindlichen Enzym-Immunoassay (EIA)-Kit. Hinweis: Bei Verwendung eines handelsüblichen Speichel CORT EIA-Kit, folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers als im Kit Einsatz angegeben, außer dass die Testproben werden doppelte Aliquots jeder wiederhergestellt Haar-Extrakt anstelle von Speichelproben sein. </li><li> Bereiten Sie eine Qualitätskontrolle (QC) Haar-Extrakt für den Einsatz bei jedem Test. <ol><li> Sammeln Sie eine Reihe von zusätzlichen Haarproben und verarbeiten sie entweder einzeln wie in den Schritten 4.1 und 4.2 oder bündeln sie für große Probenverarbeitung wie in den Schritten 3.1 und 3.2. </li><li> Das Lösungsmittel verdampft und rekonstruieren die Extrakte wie in den Schritten 5.1 und 5.2, dann bündeln die wiederhergestellten Extrakten aus mehreren Einzel-oder Sammelproben. </li><li> Aliquot ein geeignetes Volumen der gepoolten rekonstituierte Extrakt (zB 0,10 ml) in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen und für die spätere Verwendung einfrieren. </li><li> Auftauen und führen ein QC aliquoten in zweifacher Ausfertigung auf jeder Mikro Immunoassay, ein Refe bietenRenče CORT Wert für die Überprüfung der Qualität von jedem Lauf. </li><li> Eine Intra-Assay-Variationskoeffizienten (CV, definiert als Standardabweichung dividiert durch den Mittelwert aus einer Reihe von Abtastwerten) kann durch Analysieren 10-12 QC Vertiefungen im gleichen Durchlauf berechnet werden, während ein Inter-Assay-CV berechnet werden Verwendung der QC-Werte auf eine Gruppe von Auflagen. Wenn man den Mikroplatten-Reader-Software berechnet einen Lebenslauf für die Doppel, die jedes Haar-Extrakt, dann eine alternative Methode zur Bestimmung der Intra-Assay-CV ist, um den Mittelwert dieser einzelnen CV-Werte über die gesamte Platte zu berechnen. </li><li> Wenn eine Probe Extrakt ergibt ein Lese größer als der höchste Standard CORT im EIA, dann ein weiteres Aliquot des Extrakts mit einer geeigneten Menge an Testpuffer verdünnt, und das anschließende Lesen EIA ist für den Verdünnungsfaktor korrigiert. Die Proben werden auch routinemäßig erneut analysiert, wenn der Lebenslauf für die Doppel ist&gt; 10%. </li><li> Da CORT EIA Kits sind so konzipiert, CORT va messenLues in flüssigen Proben wie Speichel oder Plasma, das Ausgangssignal des Mikroplatten-Lesesoftware muss CORT Menge pro Gewichtseinheit des pulverförmigen Haar umgewandelt werden. Die folgende Formel konvertiert Assay Ausgabe in g / dl auf CORT pg pro mg Haar: (A / B) * (C / D) * E * F = 10.000 A = g / dl von Assay-Ausgang; B = Gewicht (in mg) der Haare, um die Extraktion unterzogen, C = vol. (In ml) von Methanol zu dem pulverförmigen Haar zugegeben, D = vol. (In ml) Methanol aus dem Extrakt gewonnen und anschließend getrocknet unten, E = vol. (In ml) der Testpuffer verwendet, um den Trockenextrakt zu rekonstituieren, und F = Endwert der Haare CORT Konzentration in pg / mg. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Die oben beschriebenen Haar CORT Verfahren ist einfach durchzuführen, ist relativ preiswert, macht Gebrauch von frei verfügbaren Chemikalien, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien und Geräte benötigt, die, mit einer Ausnahme, wird wahrscheinlich in einem typischen analytischen Labor vorhanden sein. Die Ausnahme ist eine Schleifvorrichtung, wie einer Kugelmühle oder Mini BeadBeater. Wir stellen fest, dass einige Forschungsgruppen Hackfleisch Haarproben in kleine Fragmente etwa 1 mm in der Länge 12, aber a...

Mess Cort im Plasma, Speichel, oder gelegentlich in Urin oder Kot wurde als Index der physiologische Stress Selye seit Entdeckung der Rolle der HPA-Achse in Stress 1 verwendet. Obwohl zahlreiche Arbeiten veröffentlicht worden über HPA Aktivität akut belastenden Situationen hat das Feld, das durch das Fehlen einer einfachen und zuverlässigen Index der chronischen physiologischen Stress behindert. Dieses Problem entsteht, weil Plasma und Speichel sowohl Ausbeute als &quot;Punkt&quot; Schätzungen der HPA Tätigkeit, die einer zirkadianen Variation sind und können durch Umweltstörungen verwechselt werden. Harn-und Stuhlproben ergeben Messungen von CORT und / oder Metaboliten-Ausscheidung, die eine Anzahl von Stunden bis zu einem ganzen Tag in einigen Fällen zu überspannen. Sammlung mehrerer Proben mit einer dieser Matrizen können eine grobe Composite-Index der Kortikosteroid-Konzentration im Laufe der Zeit zur Verfügung stellen, jedoch bietet keiner dieser Ansätze einen wirklich langfristigen Index der HPA-Aktivität und die Reaktionsfähigkeit dieser syStammzellen zu chronischen Stressfaktoren. Mess CORT im Haar hat damit begonnen, diesen wichtigen Bedarf in der Stress-Literatur zu füllen. Erste Studien von verschiedenen Laboratorien zeigte die Anwesenheit von CORT in menschliches Haar, aber nicht untersuchen, ob Haare CORT Stufen in Abhängigkeit von Stress 2 geändert. Als unser Labor hat in der Regulation des Rhesusaffen HPA-Achse durch verschiedene Sozial-und Verhaltensfaktoren 3 interessiert seit vielen Jahren, machten wir uns auf Verfahren zur Extraktion und Analyse von Rhesusaffen Haar 4 zu etablieren und zu validieren. Basierend auf der Annahme, daß Blut übertragbaren Cort langsam und kontinuierlich wachsende Haar eingearbeitet, deren Zweck dieses neuen Verfahrens wurde auf ein Niveau von Haar abgeleitet CORT als integrierte Index von HPA-Aktivität über einen Zeitraum von Wochen bis Monaten zu verwenden. Mehrere methodischen Herausforderungen in der Entwicklung der vorliegenden Protokoll aufgetreten. Zunächst hatten frühere Studien, dass kleine Mengen o gezeigtf zirkulierenden CORT in Schweiß und Talg ausgeschieden wird und daher Beschichtung der Außenseite der Haarschaft 2. Um dieses Potenzial zu verwechseln eliminieren, entwickelten wir eine milde Waschverfahren, die auf externe CORT entfernen, während eine minimale Auswirkung auf CORT innerhalb der wachsenden Haarschaft vorhanden erscheint. Somit Affenhaar diesem Verfahren (dh zwei 3-minütiges Waschen mit Isopropanol) unterworfen verloren etwa 7-8% der gesamten Haar CORT Gehalt und eine dritte Waschschritt entfernt von weniger als 1% Steroid aus der Probe 4. Es scheint mehrere externe CORT in menschlichen Haaren, da dasselbe Verfahren entfernt einen Durchschnitt von 27% Gesamtgehalt CORT aus den Proben (K. Rosenberg und J. Meyer, unveröffentlicht). Wie Affenhaar, enthielt jedoch eine zusätzliche Wasch weniger CORT (etwa 7%) als die ersten zwei Waschungen. Daher ergibt sich aus beiden Affen-und Menschenhaar unterstützt die Behauptung, dass die meisten (wenn nicht alle) externe CORT entfernt werden kann, während ein Hauptfraktionention von CORT innerhalb der inneren Haarmatrix. Zweitens unsere Pilotstudien zeigten auch, dass die Schleif Haar vor signifikant erhöht CORT Erholung von der Probenextraktions, vermutlich durch Aufbrechen des Komplexes proteinartigen Matrix des Haares sowie die Erhöhung der Oberfläche für das Eindringen von Lösungsmitteln zur Verfügung. Wurden zwei verschiedene Schleifverfahren entwickelt, die jeweils Vor-und Nachteile. Verfahren 1, die eine Kugelmühle verwendet, hat den Vorteil der Herstellung von feinstem Pulver. Allerdings ist eine Kugelmühle eine relativ teure Geräte und Artikel, wenn mit Standard-Mahlbecher und Kugeln verwendet wird, in der Lage, Schleifen nur zwei Proben gleichzeitig ist es. Kleine Proben sind auch schwierig zu verarbeiten unter Verwendung einer Kugelmühle mit Standard Mahlbecher. Methode 2, welche eine BeadBeater verwendet, ist weniger effektiv in ihrer Schleiffähigkeit. Als Ergebnis beträgt die durchschnittliche Rückgewinnungs CORT etwa 10% niedriger mit diesem Verfahren im Vergleich zu der Kugelmühle (unveröffentlichte Daten). Andererseits ist ein BeadBeaterist wesentlich billiger als eine Kugelmühle, kann 16-24 Proben gleichzeitig, je nach Modell gemahlen werden, und das Verfahren ist für kleine Proben gut geeignet. Aufgrund der oben erwähnten Differential Erholung ist es ratsam, das gleiche Schleifverfahren für alle Proben innerhalb einer bestimmten Studie verwendet. Nachdem die Haarproben verarbeitet worden sind, werden sie mit Methanol und CORT der Extrakte mittels einer sensitiven und spezifischen kommerziellen EIA-Kit ursprünglich zur Speichel CORT Messung analysiert. Die Extraktions-und Testverfahren wurden zum Teil durch die zeigen, dass serielle Verdünnungen der Extrakte aus Affenhaarproben ergab UVP-Messwerte, die die aus authentischen CORT-Standards erhalten Lesungen eng parallel validiert. Wir haben dann gezeigt, dass Haare CORT (zusätzlich zu Plasma-und Speichel CORT) war empfindlich auf die großen Lebens Stressor einer verwaltungs beauftragt Umzug der Affen zu neuen Wohnviertel 4,5. Die Präsentationt Papier liefert eine detaillierte Darstellung der in unserem Labor routinemäßig verwendet werden, um Menschen und Affen Haarproben zu verarbeiten und aus solchen Proben zu extrahieren und zu analysieren, CORT Methoden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade isopropanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A451</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">HPLC-grade methanol</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Salivary cortisol assay kits</td>
			<td style="width:116px;">Salimetrics</td>
			<td style="width:119px;">1-3002</td>
			<td>See manufacturer&#39;s kit insert for information on assay sensitivity and specificity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Max Scientific</td>
			<td>10-9151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">05-402-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.0-ml XXTuff reinforced microvials</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>330TX</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.2-mm chrome-steel beads</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>11079132c</td>
			<td>Use with mini-beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10-ml stainless steel grinding jars</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">02.462.0061</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-mm stainless steel grinding balls</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">05.368.0037</td>
			<td>Use with mixer mill</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant activated carbon cartridge</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DTK120R</td>
			<td>Use with Savant chemical trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for 15-ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>S02135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rotator for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>NC9854190&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">MM 200 mixer mill</td>
			<td style="width:116px;">Retsch</td>
			<td style="width:119px;">20.746.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Beadbeater 16&#160;</td>
			<td style="width:116px;">BioSpec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant DNA Speedvac</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>DNA120-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant refrigerated vapor trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>RVT400-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Savant chemical trap</td>
			<td style="width:116px;">Fisher</td>
			<td>SCT120</td>
			<td>Alternative to refrigerated vapor trap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate washer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microplate mixer</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Multichannel pipetter</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Analytical balance</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair

Das Stresshormon Cortisol (CORT) wird langsam in die wachsende Haarschaft von Menschen, nichtmenschliche Primaten und anderen Säugetieren aufgenommen. Wir entwickelten und validierten ein Verfahren zur Extraktion und Analyse CORT von Rhesusaffen Haar und anschließend angepasst diese Methode für die Verwendung mit der menschlichen Kopfhaare. Im Gegensatz zu CORT &quot;point samples&quot; aus Plasma oder Speichel erhalten, bietet Haar CORT eine integrierte Messung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-System (HPA)-Aktivität und damit physiologischen Stress, während der Zeit der Hormon Gründung. Da die menschliche Kopfhaar wächst mit einer durchschnittlichen Rate von 1 cm / Monat, CORT Stufen von Haar Segmente erhalten einige cm in der Länge kann potenziell als Biomarker von Stress über eine Anzahl von Monaten erlebt zu dienen. In unserem Verfahren wird jede Haarprobe wird zunächst zweimal in Isopropanol gewaschen, um CORT von außerhalb des Haarschaftes, der von Schweiß oder Talg abgelagert hat, zu entfernen. Nach dem Trocknen derProbe wird zu einem feinen Pulver zu brechen das Haar die Proteinmatrix und vergrößern die Oberfläche für die Extraktion zu erden. CORT vom Innenraum des Haarschaftes in Methanol extrahiert wird das Methanol abgedampft, und der Extrakt wird in Assaypuffer rekonstituiert. Heraus CORT zusammen mit Standards und Qualitätskontrollen, wird dann mittels eines sensitiven und spezifischen kommerziell erhältlichen Enzym-Immunoassay (EIA) Kit analysiert. Auslesen von der EIA ist mit CORT pg pro mg pulverisierte Haargewicht umgewandelt. Diese Methode wurde in unserem Labor verwendet worden, um Haar CORT beim Menschen zu analysieren, verschiedene Arten von Makaken-Affen, Krallenaffen, Hunde und Eisbären. Viele Studien sowohl aus unserem Labor und von anderen Forschungsgruppen haben die breite Anwendbarkeit des Haar CORT zur Beurteilung der chronischen Stressbelastung in natürlichen als auch Labor-Einstellungen demonstriert.

Abbildung 1 zeigt den Ausdruck aus einer repräsentativen Reihe von menschlichen Haarproben (erwachsenen männlichen und weiblichen Probanden) nach der Methode 2 Schleifen und Extraktion verarbeitet. Computersoftware wurde verwendet, um den Datenausgang zu erzeugen und eine 4-Parameter-sigmoiden Kurve an die CORT Standards (Fig. 2) zu passen. Die zwischen-und Lebensläufen von dieser Platte reichte von 0,01 bis 5,73% bei einer durchschnittlichen Intra-Assay-VK von 1,34%. Die Inter-Assay...

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Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

Cortisol (CORT) reichert sich in der wachsenden Haarschaft von Menschen und nicht-menschlichen Primaten. Wir beschreiben Methoden zur Extraktion und Analyse von Haar CORT mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit. Messung von CORT Haar ist besonders für die Beurteilung chronischer Stress über einen Zeitraum von Wochen bis Monaten geeignet.

Extraktion und Analyse von Cortisol aus Menschen-und Affen-Haar

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

extraction-and-analysis-of-cortisol-from-human-and-monkey-hair

Research

JoVE Journal

Biology

28.1K Aufrufe.  University of Massachusetts, Amherst.  Cortisol (CORT) reichert sich in der wachsenden Haarschaft von Menschen und nicht-menschlichen Primaten. Wir beschreiben Methoden zur Extraktion und Analyse von Haar CORT mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit. Messung von CORT Haar ist besonders für die Beurteilung chronischer Stress über einen Zeitraum von Wochen bis Monaten geeignet. 

Serie: Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Internal organs such as the heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for their normal functions1. Motile cilia are involved in establishing LR asymmetry in vertebrate embryos, including mouse, frog, and zebrafish2-6. These 'LR cilia' generate asymmetric fluid flow that is necessary to trigger a conserved asymmetric Nodal (TGF-&beta; superfamily) signaling cascade in the left lateral plate mesoderm, which is thought to provide LR patterning information for developing organs7. Thus, to understand mechanisms underlying LR patterning, it is essential to identify genes that regulate the organization of LR ciliated cells, the motility and length of LR cilia and their ability to generate robust asymmetric flow.
In the zebrafish embryo, LR cilia are located in Kupffer's vesicle (KV)2,4,5. KV is comprised of a single layer of monociliated epithelial cells that enclose a fluid-filled lumen. Fate mapping has shown that KV is derived from a group of ~20-30 cells known as dorsal forerunner cells (DFCs) that migrate at the dorsal blastoderm margin during epiboly stages8,9. During early somite stages, DFCs cluster and differentiate into ciliated epithelial cells to form KV in the tailbud of the embryo10,11. The ability to identify and track DFCs&mdash;in combination with optical transparency and rapid development of the zebrafish embryo&mdash;make zebrafish KV an excellent model system to study LR ciliated cells.
Interestingly, progenitors of the DFC/KV cell lineage retain cytoplasmic bridges between the yolk cell up to 4 hr post-fertilization (hpf), whereas cytoplasmic bridges between the yolk cell and other embryonic cells close after 2 hpf8. Taking advantage of these cytoplasmic bridges, we developed a stage-specific injection strategy to deliver morpholino oligonucleotides (MO) exclusively to DFCs and knockdown the function of a targeted gene in these cells12. This technique creates chimeric embryos in which gene function is knocked down in the DFC/KV lineage developing in the context of a wild-type embryo. To analyze asymmetric fluid flow in KV, we inject fluorescent microbeads into the KV lumen and record bead movement using videomicroscopy2. Fluid flow is easily visualized and can be quantified by tracking bead displacement over time.
Here, using the stage-specific DFC-targeted gene knockdown technique and injection of fluorescent microbeads into KV to visualize flow, we present a protocol that provides an effective approach to characterize the role of a particular gene during KV development and function.

Cilia-generated fluid flow in Kupffer&#x2019;s Vesicle (KV) controls left-right patterning of the zebrafish embryo. Here, we describe a technique to modulate gene function specifically in KV cells. In addition, we show how to deliver fluorescent beads into KV to visualize fluid flow.

Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional characterization of venom proteins has important biomedical applications, including the identification of drug leads or probes for cellular receptors. Spiders are the most species rich clade of venomous organisms, but the venoms of only a few species are well-understood, in part due to the difficulty associated with collecting minute quantities of venom from small animals. This paper presents a protocol for the collection of venom from spiders using electrical stimulation, demonstrating the procedure on the Western black widow (Latrodectus hesperus). The collected venom is useful for varied downstream analyses including direct protein identification via mass spectrometry, functional assays, and stimulation of venom gene expression for transcriptomic studies. This technique has the advantage over protocols that isolate venom from whole gland homogenates, which do not separate genuine venom components from cellular proteins that are not secreted as part of the venom. Representative results demonstrate the detection of known venom peptides from the collected sample using mass spectrometry. The venom collection procedure is followed by a protocol for dissecting spider venom glands, with results demonstrating that this leads to the characterization of venom-expressed proteins and peptides at the sequence level.

This article provides a protocol for the extraction of venom from spiders using electrical stimulation in order to 1) conduct proteomic characterization, 2) stimulate venom gland gene expression, and 3) perform functional studies of venoms. This is followed by a description of venom gland microdissections for gene expression studies.

Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Eine neue Technik zur quantitativen Analyse von Haarausfall in Mäuse mit Graustufen-Analyse

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...