Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der National Cancer Institute, CA131967 unterstützt.

Ein. BrdU Incorporation (Terminal Labeling) <ol><li> Platte Zellen auf etwa 70% Konfluenz in einer 150 mm Gewebekulturplatte 24 h vor der Zugabe von BrdU. </li><li> Ersetzen Medien mit frischem Komplettmedium, enthaltend 20 ug / ml BrdU (Sigma) zu geeigneten Zeitpunkten vor der Ernte. Die Länge der Zeit Zellen werden in Medien mit BrdU wird mit Zelltyp und Spezies variieren, typischerweise der G2 Phase dauert zwischen 2 und 5 h (Figur 1) kultiviert. </li></ol> 2. Chromosome Harvest of Monolayer-Zellkulturen <ol><li> Entfernen Kulturmedien von der Platte und sammeln 10 ml in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Verbleibende Medien. </li><li> Spülen Zellen einmal mit 10 ml Pfeilhöhe [oder HBSS (Sigma)]. </li><li> 5 ml 0,25% Trypsin in Pfeilhöhe (oder HBSS) an der Platte. Bei Raumtemperatur inkubieren, bis Zellen von der Platte abgelöst werden. </li><li> Hinzufügen trypsinisierte Zellsuspension in das Röhrchen mit dem 10 ml Medium aus Schritt 2.1. &lt;/ Li&gt; <li> Zentrifuge bei 400 × g für 10 min die Zellen zu pelletieren. Absaugen des Überstandes, so dass 0,5 ml Medium plus Zellpellet. </li><li> Resuspendieren Zellen gründlich durch Pipettieren mit einer Pasteurpipette. </li><li> 3 Tropfen hypotonen Lösung (0,075 M KCl (Sigma) erwärmt auf 37 ° C); mischen die Zellsuspension mit einer Pasteurpipette. 0,5 ml hypotonische Lösung und nochmals mit einer Pasteurpipette. Bringt Volumen hypotonischen Lösung auf 5 ml und mischen wieder. Bei 37 ° C für 20 bis 45 min, je nach Zelltyp. </li><li> Zentrifugation bei 400 xg für 10 min. Absaugen des Überstandes, so dass 0,5 ml Medium plus Zellpellet. </li><li> Zellpellet durch leichtes Ausklopfen des Rohres. Die osmotisch geschwollenen Zellen werden an dieser Stelle zerbrechlich, so sollte darauf geachtet werden, nicht die Cytoplasmamembranen stören. </li><li> 3 Tropfen Fixativ Carnoys (1:3 Eisessig: Methanol); Mischung durch vorsichtiges Pipettieren mit einer Pasteur pipettE. 0,5 ml Fixiermittel und Mischung durch vorsichtiges Pipettieren mit einer Pasteurpipette. Bringt Volumen Fixiermittelpartikel auf 5 ml und nochmals durch sanftes Pipettieren mit einer Pasteurpipette. Fixierten Zellen können im Dunkeln bei -20 ° C für mehrere Monate gelagert werden. </li><li> Zentrifuge und saugen wie in Schritt 2.8. </li><li> Zellpellet in frischem Fixativ; schätzen das Volumen des Pellets und Add ~ 10x das Volumen der Carnoys Fixativ. </li><li> Fügen Sie die Zellsuspension tropfenweise auf nassen, eiskalten Objektträger, halten die Folie bei einem ~ 45 °-Winkel und erlauben die Zellsuspension über die Oberfläche der Folie fließen. Legen Sie die Folie flach auf Papierhandtücher und Flut der Schieber mit Fixiermittel und an der Luft trocknen. Prüfen Dias auf die Anwesenheit von mitotischen Aufstriche mit einem inversen Mikroskop. </li></ol> 3. RNase Behandlung und Ethanol Dehydration <ol><li> Platz 200 ul von 10 pg / ml RNase A (Sigma) in 2x SSC zu jeder Folie; inkubieren bei 37 &amp; deg, C für 1 Stunde. </li><li> Wasch gleitet 3 mal mit 2x SSC, pH 7,0 bei Raumtemperatur für 3 min pro. </li><li> Dehydratisieren Dias durch eine EtOH (Sigma) (70%, 90% und 100%) bei Raumtemperatur für 3 min pro. </li><li> An der Luft trocknen Dias bei Raumtemperatur. </li></ol> 4. Vorbereitung der Probe Cocktails für BAC Plus-Chromosom-spezifischen Zentromer Enumeration Probe (CEP) oder für Whole Chromosome Paints In-situ-Hybridisierung <ol><li> Für die BAC / CEP gleichzeitige Hybridisierung, bereiten zwei separate Sonde Cocktails für pre-Hybridisierung. Wir haben festgestellt, dass pre-Hybridisierung der BAC-und KEP-Sonden separat unter verschiedenen Stringenz Ergebnisse in weniger Hintergrund und größere Signalintensitäten. Wir haben auch gefunden, dass einzelne Fosmide kann auch anstelle von BAC-Klonen verwendet werden. Die Cocktail-Zubereitung beschrieben stellt die Volumina für eine einzelne Folie. Wenn die Bearbeitung mehrere Folien mit den gleichen Sonden erhöhen Sie einfach die Volumina appropr<html> iately. * BAC DNA-Sonde Cocktail: 11,5 ul Hybridisierungspuffer (50% Formamid (Sigma) / 2x SSC / Dextransulfat (Sigma)) 2 ul dH 2 O 2,5 ul BAC/Cot1 DNA in dH 2 O (siehe unten für die Etikettierung Protokoll) 15 ul Gesamtvolumen * CEP-Sonde Cocktail: 7 ul CEP Hybridisierungspuffer (65% Formamide/2x SSC / Dextransulfat) 2 ul dH 2 O 1 ul CEP/Cot1 DNA (gekauft prelabeled mit Spectrum Orange/Cy3/Texas Red) 10 ul Gesamtvolumen * Nach Denaturierung und pre-Hybridisierung (Schritt 5,1) Mix BAC Sonde mit CEP-Sonde bei einem 3:2-Verhältnis 25 ul / Dia-und Mix-Sonde Cocktails. OR </li><li> Aliquot 20 ul / slide von Whole Chromosome Paint-Sonde (Cy3/Texas Red) in ein Rohr. Gehen Sie zur Denaturierung und pre-Hybridisierung. </li></ol>&quot;&gt; 5. Slide-und Probe-Denaturierung und In-situ-Hybridisierung <ol><li> Denaturieren Sonde Cocktail (s) bei 75 ° C für 10 min. Bei 37 ° C prä-Hybridisierung für 30 Minuten, damit das DNA Cot1 zu repetitiven Sequenzen hybridisieren und anschließende Hybridisierung verhindern, um Chromosomen Metaphase. </li><li> Denaturieren Folien in Coplin Gläser in 70% Formamide/2x SSC, pH 7,0 bei 72 ° C für 3 min. </li><li> Unmittelbar dehydratisieren Dias durch eine EtOH (70%, 90% und 100%) in Coplin Gläser bei 4 ° C für 3 min pro. </li><li> Die Objektträger an der Luft bei Raumtemperatur trocknen. </li><li> Vorwärmen gleitet bis 45 ° C auf dem Objektträger wärmeren zu den letzten 10 min der Sonde vor hybridzation (Schritt 5.1). Mix Pre-hybridisierten Sonde Cocktails, wenn nötig, und fügen Sie 25 ul zu jeder Folie, sanft Ein Deckglas auf jeder Folie und Dichtung an allen Kanten mit Gummi Zement. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer, um Verdunstung zu verhindern. </li></ol><ol><li> Waschen Folien in Coplin Gläser 3 mal in 50% formamide/2x SSC, pH 7,0 bei 38 bis 40 ° C für 3 min pro. Die Temperatur kann zwischen den Waschvorgängen Sonden variieren. Bei hoher Hintergrund-Hybridisierung können Sie erhöhen die Temperatur der Wäschen. Umgekehrt, wenn das Signal schwach ist, und es gibt keinen Hintergrund, dann können Sie verringern die Temperatur dieser Wäschen. </li><li> Wash gleitet 1 Mal in PN-Puffer bei Raumtemperatur für 3 min, und die Detektion BrdU Schritt fort. </li></ol> 7. BrdU-Erkennung <ol><li> Block Folien mit PNM-Puffer für 10 min (200 ul / Objektträger) bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Lassen Sie gleitet durch Drehen am Rand auf einem Papiertuch. Je 100 ul Anti-BrdU-FITC (50 ug / ml Roche oder Millipore) im PNM-Puffer für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Waschen Folien 3 mal in PN-Puffer bei Raumtemperatur für 3 min pro. </li><li> AbtropfenÜberschuß PN Puffer auf gleitet nacheinander durch Einschalten Kante auf einem Papiertuch. Fügen Sie 20 ul DAPI / antifade Montage-Lösung (Invitrogen). Decken Sie die Folie mit einem Papiertuch und drücken Sie auf dem Deckglas zu verdrängen Luftblasen und überschüssige Montagelösung. Gehen Sie zur Bildanalyse. </li></ol> 8. Aufnehmen von Bildern und Quantifizierung BrdU Incorporation <ol><li> Die Bilder werden mit einer Olympus BX61 Fluoreszenzmikroskop und Olympus CCD-Kamera, 100x Objektiv, automatischer Filter-Rad und CytoVision Software (Applied Imaging) erfasst. BrdU eingefangen wird mit einem FITC-Filter; Chromosom Farben (Texas Red, Metasystems oder Cytocell) werden BAC (Cy3) und CEP (Vysis Spectrum Orange) Sonden wurden mit einer Texas Red oder Cy3-Filter; DAPI wird mit einem DAPI Filter (siehe erfasst Abbildungen 2 und 3). </li><li> Einzelnen Chromosomen von Interesse sind mit BAC / CEP oder Chromosom-spezifischen Farbe Sonden (2B und 3B) identifiziert. Mit Hilfedie CytoVision Software, jedes Chromosom von Interesse ist &quot;cut-out&quot; von der Metaphase Ausbreitung als Ganzes wird eine Gerade durch die entlang der Länge des Chromosoms aus kurzen Arm zu langen Arm (2C und 3C) gezogen. Die CytoVision Software wird verwendet, um die Pixel-Intensität entlang der Länge jedes Chromosoms zu quantifizieren. Die CytoVision Software berechnet die Fläche durch die Pixel besetzt und quantifiziert die Intensität der Pixel von den BrdU oder DAPI Signale zu jeder isolierte Chromosom repräsentiert. Die durchschnittliche Pixelintensität von jedem Chromosom dargestellt wird dann durch den Bereich durch diejenigen Pixel besetzt, um die Gesamtzahl von Pixeln (Tabelle 1 und Abbildung 4) zu erhalten, multipliziert. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll für die Visualisierung von der jeweils replizierende Regionen der Chromosomen. Dementsprechend gestattet die bandförmig des BrdU-Einbaus zum Nachweis von aktiv replizierenden Regionen der Chromosomen, und Unterschiede in der Replikation Timing zwischen chromosome Paare werden als Unterschiede in diesem Bandenmuster (Abbildungen 2 und 3) zu sehen. Schließlich können diese Unterschiede im Bindungsmuster zu bekannten Replikation Zündungsmaps für jedes Chromosom 6,7, die für eine Schätzung der Replikation Zeitdifferenz zwischen homologen Chromosomen oder Chromosomen-Arme 4 ermöglicht verglichen werden. Zum Beispiel ist in den beiden Chromosom 6 in 3A angezeigt einen Unterschied in Bandenmuster von&gt; 2 h, wenn die normale Timing Replikation des Chromosoms 6 4 verglichen. Darüber hinaus wurde ein ähnliches Verfahren wie hier beschrieben wurden erfolgreich für die Untersuchung des asynchronen Replikation Timing zwischen den inaktiven und aktiven X-Chromosomen 8,9 verwendet. Die aktiven und inaktiven X-Chromosomen wurden mit Hilfe X-Chromosom Farben. Bilder wurden aufgenommen mit Quips MFISH Software (Vysis) und die Anzahl der Pixel von den Chromosomen X besetzt und die Anzahl der Pixel, die durch Fluoreszenz-la besetztbeschriftete BrdU wurden dann unter Verwendung NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html</a> ). </li></ol> 9. Nick Übersetzung von BAC-DNA für Fluoreszenzmarkierung (Vysis) <ol><li> Fügen Sie den folgenden Sondenmischung zu kühlenden ein Mikrozentrifugenröhrchen: 70 ul (4 ug DNA) in dH 2 O 10 ul 0,2 mM dUTP-Orange oder Grün 20 ul 0,1 mM dTTP 20 ul 10x Nick Translation Buffer 40 ul NT dNTPs (minus dTTP) 40 ul nick Translation Enzym 200 ul Gesamtvolumen Inkubieren bei 16 ° CO / N. Die Reaktion durch Erhitzen auf 70 ° C für 10 min. Chillen auf Eis für 5 min. </li><li> Fällung der DNA mit Ethanol, indem Sie die folgenden Zeilen in die Sondenmischung: 200 ul Probenlösung 48 ul 3 M NaOAc 160 ul Cot1DNA (.25 g / ul) 1.200 ul 100% EtOH </li><li> Bei -80 ° C für 10 min auf O / N. </li><li> Spin in cold bei 12.000 xg für 20 min. Abdekantieren EtOH. Waschen 1 mal mit 70% EtOH. Spin wie zuvor. Abdekantieren EtOH. Air nur bis EtOH verdunstet trocknen. Resuspendieren in 40 ul dH 2 O für Endkonzentration von 100 ng / ul BAC-DNA. </li></ol>

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	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Herstellung von Chromosom ausbreitet ist ein entscheidender Schritt für die erfolgreiche Replikation-Timing-Assay beschrieben. Der Einschluss eines Colcemid Vorbehandlungsschritt vor dem hypotonische Behandlung kann in der Frequenz und Ausbreiten des mitotischen Zellen zu unterstützen. Wir typischerweise freizulegen Zellen für 1-3 h colcemdi vor der Ernte und in einer Endkonzentration von 10 ug / ml Colcemid benutzen. Jedoch kann die Einbeziehung eines Colcemid Vorbehandlungsschritt verändern die Länge der G2 u...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> Roche Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 ug / ul </td></tr><tr><td> Nick Translation Kit </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrum Orange dUTP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> Variiert </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP Hybridisierungspuffer </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP Hybridisierungspuffer </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> Chromosome paints </td><td> MetaSystems Gruppe </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> Olympus BX61 Fluoreszenzmikroskop </td><td> Olymp </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope Imaging-Software-System </td><td> Applied Imaging </td><td> CytoVision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> Digital Camera </td><td> Olymp </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> In situ Hybridisierung REZEPTE Formamid Lösungen 70% Formamide/2x SSC 35 ml Formamid * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 pH-Wert auf 7,0 mit HCl (Sigma) * Es ist wichtig zu Formamid bedienen, dass ist bei -20 ° C gelagert wurde Längerer Lagerung bei Raumtemperatur generiert Ameisensäure und den pH-Wert wkrank zu niedrig sein. 50% Formamide/2x SSC 25 ml Formamid (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O pH-Wert auf 7,0 mit HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na Citrate (Sigma) dH 2 O zu Volumen PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Einen 0,1 M Lösung von Natriumphosphat jedes (Filter sterilisiert und speichert in 500 ml Aliquots). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O zu Volumen 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L </strong&gt; 14,2 g NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O auf Volumen. PN: Der pH-Wert von 0,1 M Na 2 HP0 4 bis pH 8,0 mit 0,1 M NaH 2 P0 4. Filtern sterilisieren und 1 ml NP-40. PNM 50 ml 1,25 g Fettfreie Trockenmilch (Sigma) 25 ml PN-Puffer (Rezept siehe oben) Mix für 15-20 min unter ständigem Rühren. Spin 2 mal bei 400 × g für 10 min. Verwenden Überstand, und stellen Sie sicher nicht zu ausgefallene Milchproteine ​​stören. </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

Säuger-DNA-Replikation initiiert an mehreren Stellen entlang Chromosomen zu verschiedenen Zeiten während der S-Phase, nach einer zeitlichen Replikationsprogramm. Die Spezifikation der Replikation Zeitpunkt wird angenommen, dass ein dynamischer Prozess, durch Gewebe-spezifische und Entwicklungsstörungen Cues, die als Reaktion auf epigenetische Modifikationen geregelt werden. Allerdings bleibt die Regulationsmechanismen, wo und wann die DNA-Replikation initiiert zusammen Chromosomen kaum verstanden. Homologen Chromosomen in der Regel synchron replizieren, aber es gibt Ausnahmen von dieser Regel. Zum Beispiel in weiblichen Säugerzellen eines der beiden X-Chromosomen wird späten replizierende durch einen Prozess als X-Inaktivierung 1 bekannt. Zusammen mit dieser Verzögerung bei der Replikation Timing, schätzungsweise 2-3 Stunden sein, werden die Mehrzahl der Gene transkriptionell auf einem X-Chromosom zum Schweigen gebracht. Darüber hinaus regelt eine diskrete cis-wirkende Locus, als die X-Inaktivierung Zentrum bekannt, diese X-Inaktivierung, einschließlich the Induktion verzögerte Replikation Timing auf dem gesamten inaktiven X-Chromosom. Darüber hinaus können bestimmte Chromosomenveränderungen in Krebszellen und Zellen gefunden Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zeigen eine signifikante Verzögerung bei der Replikation Timing von&gt; 3 Stunden, wirkt sich auf die gesamte Chromosom 2,3. Neuere Arbeiten aus unserem Labor zeigt, dass Störungen von diskreten cis-wirkenden autosomal loci Ergebnis in einem extrem spät replizierende Phänotyp, die das gesamte Chromosom 4 beeinflusst. Weitere &#39;Chromosom Engineering &quot;Studien zeigen, dass bestimmte Chromosomenumlagerungen die viele verschiedene Chromosomen Ergebnis in diesem abnormen Replikation-Timing Phänotyp, was darauf hindeutet, dass alle Säugetiere Chromosomen diskrete cis-wirkenden Loci, die die Replikation ordnungsgemäß Zeitpunkt der einzelnen Chromosomen 5 zu steuern enthalten. Hier stellen wir ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Chromosomenreplikation Timing mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung kombiniert. DiesVerfahren ermöglicht einen direkten Vergleich der Replikation Timing zwischen homologen Chromosomen innerhalb der gleichen Zelle, und wurde aus 6 angepasst. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren für die eindeutige Identifizierung von chromosomalen Umordnungen, die mit Veränderungen in der Replikation Timing, das das gesamte Chromosom beeinflusst korrelieren. Diese Methode hat Vorteile gegenüber kürzlich entwickelten Hochdurchsatz-Mikro-Array oder Sequenzierung Protokolle, die nicht zwischen Allele unterscheiden präsentieren auf neu und Chromosomen un-umgeordnet können. Darüber hinaus, weil das hier beschriebene Verfahren wertet Einzelzellen kann Ermittlung von Änderungen in Chromosomenreplikation Timing auf chromosomale Rearrangements, die nur in einer Fraktion der Zellen in einer Population sind.

Ein Beispiel für die Replikation Timing-Analyse für den menschlichen Chromosoms 6 ist in Abbildung 2 dargestellt. Zellen, die eine Deletion des Gens ASAR6 4, bei 6q16.1 angeordnet wurden, um BrdU für 5 Stunden ausgesetzt werden, für mitotische Zellen geerntet und verarbeitet FISH mit einem Chromosom 6 Lack Sonde (Vysis) und für BrdU-Inkorporation. Beachten Sie, dass es einen signifikanten Unterschied in der BrdU Bandenmuster zwischen zwei 6 ist, ist die Übereinstimmung mit einer Verzög...

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Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Ein quantitatives Verfahren zur Analyse von Chromosomenreplikation Timing beschrieben. Das Verfahren nutzt BrdU Inkorporation in Kombination mit fluoreszierenden<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH), um die Replikation des Säuger-Chromosomen Timing zu beurteilen. Diese Technik ermöglicht den direkten Vergleich von neu geordnet und un-neu Chromosomen innerhalb der gleichen Zelle.

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

chromosome-replicating-timing-combined-with-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

13.9K Aufrufe.  Oregon Health & Science University. Ein quantitatives Verfahren zur Analyse von Chromosomenreplikation Timing beschrieben. Das Verfahren nutzt BrdU Inkorporation in Kombination mit fluoreszierenden In situ Hybridisierung (FISH), um die Replikation des Säuger-Chromosomen Timing zu beurteilen. Diese Technik ermöglicht den direkten Vergleich von neu geordnet und un-neu Chromosomen innerhalb der gleichen Zelle.

Serie: Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...