Die Autoren möchten an das Department of Biology an der Syracuse University und Dr. Marilyn Kerr anerkennen für ihre Rollen in der Verwaltung des Comparative Biology Wirbeltiere natürlich. Die Albertson Labor ist durch Zuschüsse R21DE019223 von den National Institutes of Health / National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung sowie zu gewähren R01AG031922 von den National Institutes of Health / National Institute on Aging unterstützt.

1. Plasmid Transformation von Target-cDNA Teil I: Die Transformation von Plasmid (Zeitaufwand: 3 Stunden plus Inkubation über Nacht) <ol><li> Warm SOC Nährlösung in einem 42 ° C Wasserbad (500 ul pro Reaktion) </li><li> Thaw kompetenten Zellen auf Eis </li><li> Add 1 ul Plasmid auf 25 ul kompetenten Zellen </li><li> Auf Eis für 20 Minuten </li><li> Hitzeschock-Zellen in 42 ° C Wasserbad für 45 Sekunden </li><li> Unmittelbar Ort Zellen auf Eis für 2 Minuten </li><li> Add 500 ul von 42 ° C Nährbouillon in jedes Fläschchen von Zellen </li><li> Schütteln bei 37 ° C für 2 Stunden bei 255 Umdrehungen pro Minute (rpm) </li><li> Tafel 75 ul Transformation Mix auf Luria Bertani (LB) Agarplatten </li><li> Die Platten bei 37 ° C über Nacht invertiert </li></ol> Teil II: E. coli Kultur (Zeitaufwand: 15 Minuten plus Inkubation über Nacht) <ol><li> Für jede Reaktion Aliquot 3 ml LB-Bouillon und 3 ul 50 mg / mL Ampicillin in einer Kultur Rohr </li><li> Scrape 1 Bakterien Kolonie von der Agarplatte und fügen Sie jede Kultur Rohr </li><li> Schütteln Sie Kulturröhrchen bei 37 ° C bei 255 rpm über Nacht </li></ol> Teil III: Plasmid Prep (Zeitaufwand: 1,5 Stunden) <ol><li> Isolieren von Übernacht-Kulturen mit dem 5 Prime FastPlasmid Mini Kit (Katalog Nr. 2300000) Plasmid </li><li> Um zu überprüfen, auf die Anwesenheit von Plasmid vorbereitet, führen Sie die DNA aus dem Kit auf einem 1% Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Gel mit Ethidiumbromid gefärbt eluiert </li></ol> 2. In Situ DIG-markierten RNA-Sonde Synthese Teil I: Linearisierung der Plasmid (Zeitaufwand: 2,5 Stunden) <ol><li> In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren: <table border="1"><tbody><tr><td> Vorbereitet Plasmid </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> Restriction Enzyme * </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Buffer ** </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> 10X Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Diethylpyrocarbonat (DEPC) Wasser </td><td> 58 mL </td></tr><tr><td></td><td> 100 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Bei 37 ° C für 2 Stunden * Variiert mit Plasmid ** Variiert mit dem Restriktionsenzym </li></ol> Teil II: Transkription (Zeitaufwand: 3 Stunden) <ol><li> In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren: <table border="1"><tbody><tr><td> Linear Plasmid </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> 10X Transcription Buffer ** </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Digoxigenin Label Mix </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Polymerase * </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> RNase-Inhibitor </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> DEPC Wasser </td><td> 24 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Bei 37 ° C für 1 Stunde </li><li> Add 2 ul der Polymerase * </li><li> Bei 37 ° C für 1 Stunde </li><li> Add 2 &amp;mgr; l DNase </li><li> Bei 37 ° C für 20 Minuten * Variiert mit Plasmid ** Variiert mit Polymerase </li></ol> Teil III: Niederschlag (Zeitaufwand: 5 Minuten plus 2 Stunde Inkubation über Nacht, 1 Stunde, um Zentrifuge und resuspendieren) <ol><li> Add 4 ul 0,2 M EDTA </li><li> Add 5 ul 4M Lithiumchlorid </li><li> Fügen Sie 150 ul eiskaltem 100% Ethanol </li><li> Inkubation bei -80 ° C für 2 Stunden bis über Nacht </li><li> Zentrifuge bei 14.000 rpm für 30 Minuten bei 4 ° C, Dekantieren entfernt Überstand </li><li> Dry Pellet für 7 Minuten </li><li> In 20 ul DEPC-Wasser Re-suspend </li><li> Bei 37 ° C für 5 Minuten </li></ol> Teil IV: Die Fraktionierung - Führen Sie nur, wenn Sonde größer ist als 0,6 kb (Zeitaufwand: variiert je nach Sonde Größe, in der Regel nicht mehr als 20 Minuten) <ol><li> In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren: <table border="1"><tbody><tr><td> RNA-Sonde </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> DEPC Wasser </td><td> 12 mL </td></tr><tr><td> Natriumbikarbonat </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Sodium Carbonate </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Inkubieren in einem 60 ° C Wasserbad. Basis der Inkubationszeit auf die Gleichung: Dauer (Min.) = (ab kb - gewünschte kb) / (.11 x beginnend kb x gewünschte kb) Durchschnittliche gewünschte Größe = 0,6 kb </li></ol> Teil V: Final Niederschlag (Zeitaufwand: 5 minnuten plus 2 Stunde Inkubation über Nacht, 1 Stunde, um Zentrifuge und wieder auszusetzen, 1 Stunde für die Gel-Elektrophorese) <ol><li> Zugabe von 40 ul DEPC-Wasser </li><li> Add 8 &amp;mgr; l Natriumacetat </li><li> Add 1,04 ul Eisessig </li><li> Add 240 &amp;mgr; l eiskaltem 100% Ethanol </li><li> Inkubation bei -80 ° C für 2 Stunden bis über Nacht </li><li> Zentrifuge bei 14.000 rpm für 30 Minuten bei 4 ° C, Dekantieren entfernt Überstand </li><li> Dry Pellet für 7 Minuten </li><li> In 20 ul DEPC-Wasser Re-suspend </li><li> Vortex mischen </li><li> Um zu überprüfen, auf das Vorhandensein von Ribosonde, führen Sie den resuspendierten Lösung auf einem 1% TAE-Gel mit Ethidiumbromid angefärbt </li></ol> 3. Whole mount in situ Hybridisierung Teil I: Fixation des Embryos und Proteinase K Verdau (Zeitaufwand: Fix Nacht plus 4 Stunden am nächsten Tag für die Lagerung, 2,5 Stunden von der Lagerung bis Part II) <ol><li> Sammeln Sie inszeniert Zebrafischembryonen und fix in 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht bei 4 ° C </li><li> Wash festen Embryonen in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Tween-20 (PBST) 3 mal für jeweils 10 Minuten </li><li> Um das Risiko der Embryonen in die experimentelle Reagenzien, manuell dechorionate Embryonen (falls erforderlich) mit spitzen Pinzette zu gewährleisten </li><li> Entwässern Embryonen durch Waschen in einer abgestuften Reihe von 25% und 50% Methanol in PBST für jeweils eine Stunde zu waschen, dann in 100% Methanol bei -20 ° C </li><li> Wenn Sie bereit sind zu verwenden, rehydrieren Embryonen in PBST durch Waschen in 50% (2 mal) und 25% (1 Mal) Methanol in PBST für jeweils 10 Minuten. Schließlich waschen 2 mal für jeweils 10 Minuten in 100% PBST. Der genaue Zeitablauf ist nicht für PBST / Methanol wäscht wichtig </li><li> Bleach Embryonen in einer 10% igen Wasserstoffperoxid-Lösung in PBST, wenn nötig, dunkle Pigmente zu entfernen. Embryonen sollten in Wasserstoffperoxid-Lösung für 10-20 Minuten inkubieren, je nach Alter des Embryos, und die Kappe der Mikrozentrifugenröhrchen sollte offen bleiben, um zu verhindern den Aufbau von Luftdruck </li><li> Digest Embryonen mit 50 mg / mL Proteinase K 1:5000 verdünnt in PBST für 3-15 Minuten, je nach dem Alter des Embryos </li><li> Re-fix Embryonen in 4% PFA für 30 Minuten, und dann 3 x waschen in PBST für jeweils 5 Minuten </li></ol> Teil II: Die Hybridisierung der Ribosonden (Zeitaufwand: 3 Stunden plus Übernachtung für die Hybridisierung, 1,5 Stunden am nächsten Tag an Teil III) <ol start="9"><li> Prehybridize Embryonen mit Prähybridisierungslösung (PHS) in eine vorgewärmte 70 ° C Wasserbad für 2-3 Stunden </li><li> Entfernen PHS, 0,5 mL Hybridisierungslösung und 1,5 ul zuvor synthetisierten Digoxigenin markierte Ribosonden, bei 70 ° C über Nacht inkubieren. Die Temperatur kann innerhalb von ein paar Grad in Abhängigkeit von der Ribosonde Ziel schwanken </li><li> Am nächsten Tag waschen Embryonen bei 70 ° C in abgestuften Lösungen von 75%, 50% und 25% PHS in 2X Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) für jeweils 10 Minuten, dann in 0,2 X SSC waschen und 30 Minuten bei 68 ° C </li><li> Wash in Maleinsäure-Puffer (MAB) 2 mal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur </li></ol> Teil III: Anti-Digoxigenin (α-DIG) Antikörper Inkubation (Zeitaufwand: 3 Stunden plus Übernachtung zu blockieren, zu 2,5 Stunden am nächsten Tag zum Teil IV) <ol start="13"><li> -Embryonen zu einem 12-Well-Platte </li><li> Pre-Block Embryonen in 1-2 ml Blocking-Lösung für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur </li><li> Gleichzeitig pre-Block der Antikörper hergestellt, indem ein zweiter Band der Blockierungslösung und Verdünnen der anti-Digoxigenin-Antikörper 1:2000 in dieser Lösung </li><li> Entfernen Sie vor Block und fügen 1-2 ml pre-blocked α-DIG-Lösung über Nacht inkubieren bei 4 ° C </li><li> Am nächsten Tag waschen Embryonen in MAB. Lassen Sie die Embryonen in MAB für 5 Minuten Uraufführung inkubieren, dann führen Puffer Änderungen und inkubieren für zwei 10 Minuten, eine 30 Minuten und einem 60 Minuten Intervall. Der genaue Zeitablauf ist nicht notwendig </li><li> Wash Embryonen 3 mal für jeweils 5 Minuten in alkalische Phosphatase (AP)-Puffer </li></ol> Teil IV: Die Färbung und Endbearbeitung (Zeitaufwand: 1 Stunde oder über Nacht zur Färbung, je nach Ribosonde verwendet wird, kann 4 Stunden, um von Glycerin wäscht, 6-10 Stunden pro Waschglycerinphase, beginnend in Glycerin aufbewahrt werden) <ol start="19"><li> Fügen Sie 1-2 mL Färbelösung, die Embryonen, wickeln Sie die Platte in Folie, und überprüfen Färbung in regelmäßigen Abständen (ca. alle 20 Minuten) bis zur Färbung reicht </li><li> Wash Embryonen mit PBST 2 Mal für jeweils 5 Minuten, um die Farbreaktion zu stoppen </li><li> Entwässern Embryonen mit 10 Minuten wäscht in 25% (1 Mal) und 50% (2 mal) Methanol in PBST, dann in 100% Methanol, um die Hintergrundfärbung zu entfernen </li><li> Lassen Embryonen in 100% Methanol für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren </li><li> Rehydrieren in PBST mit 10 Minuten wäscht in 50% (2 mal) und 25% (1 Mal) Methanol in PBST, dann in 100% waschen PBST 2 Mal </li><li> Transfer gebeizt embryos um eine 80% ige Glycerin-Lösung in PBST mit einer abgestuften Reihe von Waschungen und lagern bei 4 ° C. </li></ol> Rezepte: <ul><li> LB-Agar-Platten-10 g LB-Agar + 250 ml destilliertem Wasser, Autoklaven, wenn kühl an add 250 ul Ampicillin, pour 15-20 ml warme Lösung in jede Petrischale, damit Agar zur Verfestigung </li><li> LB-Medium-12.5 g LB Broth + 200 ml destilliertem Wasser, Autoklaven, erlauben, bevor Sie mit kaltem </li><li> 1% TAE-Gel-0.4 g Agarose, 40 ml 1X TAE, 2 ul Ethidiumbromid; Last 7 ul Plasmid (Plasmid Transformation von Target cDNA) oder 3 ul Ribosonde und 4 ul DEPC Wasser (In-situ-DIG-markierten RNA-Sonde Synthesis) + 1 ul loading Farbstoff, 5 ul DNA-Leiter </li><li> Prähybridisierungslösung-50% Formamid, 5x SSC, 9,2 mm Zitronensäure, 1% Tween-20 </li><li> Hybridisierungslösung-Prähybridisierungslösung plus 500 ug / ml tRNA und 50 pg / mL Heparin </li><li> MAB-100mm Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,2 M NaOH, 0,1% Tween-20, pH auf 7,5 </li><li> Blocking Solution-3 Teile MAB, 1 Teil 10% Boehringer Blockierungsreagenz in MAB, 1 Teil Wärme Lamm Serum deaktiviert </li><li> AP-Puffer-60mm Tris-HCl pH 9,5, 60 mM NaCl, 30 mM MgCl 2, 0,1% Tween-20 </li><li> Färbelösung-5-Bromo-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (BCIP) und Nitro-Tetrazolium (NBT) in AP-Puffer </li></ul> 4. Repräsentative Ergebnisse Wenn richtig ausgeführt, wird die Reaktion zwischen dem NBT, BCIP und alkalische Phosphatase bilden einen violetten Niederschlag, der auf der Zebrafisch-Embryos als violetter Fleck erscheinen soll. Ribosonden sollte vorher aus cDNA entsprechend dem Gen von Interesse synthetisiert werden. Daher kann gefolgert werden jeden Fleck sichtbar repräsentiert Bereichen der Zebrafisch, in denen das Gen von Interesse an diesem speziellen Entwicklungsphase wurde transkribiert werden. Fgf8a (Reifers et al, 1998;;. Abbildung 2); deltaC (Oates et al, 2005.) Für die Zwecke dieses Kurses wurden Ribosonden aus aldh1a2 (; Begemann et al, 2001;. Abbildung 1 zuvor raldh2) synthetisiert; MyoD1 (Weinberg et al, 1996.); shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Abbildung 3) und myl7 (bisher cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. Die Färbung wurde in der Mittellinie und in anatomischen Strukturen einschließlich der Somiten, tailbud, Myotom, Gehirn und Herz zu erwarten. Ace/fgf8a Mutanten erwartet wurde, Mängel in viele dieser Strukturen haben. Die Färbung war einfach visualisiert mit Hilfe eines Standard-Binokular. Weitere Quellen enthalten weitere Informationen und Fehlersuche an WISH Techniken ähnlich denen hier beschriebene (Clark, 2003;. D&#39;Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Ein Zebrafisch-Embryos 24 Stunden nach der Befruchtung, die mit Ribosonden spezifisch für aldh1a2 wurde hybridisiert. Die spezifische Markierung kann in den Augen, Hinterhirn, Brustflosse Knospe Primordien und Somiten zu sehen. Anterior ist oben, ist hinten auf den Boden. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Ein Zebrafisch-Embryos in den 13 Somiten Stadium der Entwicklung, die mit einer Sonde spezifisch für fgf8a wurde hybridisiert. Die spezifische Markierung in der Telencephalon, dorsalen Zwischenhirn, Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze, Somiten und tailbud gesehen. Ventral ist auf der linken Seite, ist dorsal nach rechts. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. A 22 Stunden nach der Befruchtung Zebrafischembryo, die mit einem Ribosonde spezifisch für pax2a, einem robusten Marker nützlich für die Visualisierung des Nervensystems wurde hybridisiert. Die spezifische Markierung kann in der Aderhaut Fissur, Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze, Ohr-Vesikel und Rückenmarksneuronen gesehen werden. Dorsalansicht mit anterior der linken Seite.

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	<li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton.">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li><li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7,+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome.">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li><li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. 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Wunsch wurde in einer vergleichenden Wirbeltiere Biology Laboratory natürlich verwendet werden, um die Schüler verstehen die Rolle der Genetik in der anatomischen Entwicklung durch die Visualisierung von bekannten Genexpressionsmuster. Für den ersten Teil des Kurses, durchgeführt Studenten Sezieren von Organismen aus verschiedenen chordate Taxa, so dass sie genügend Zeit, um zu studieren, zu verstehen, Vergleichen und Gegenüberstellen Wirbeltiere Anatomie. Als Einführung in den zweiten Teil des Kurses wurden die Schüler eine formelle Vortrag beschreibt Zebrabärblingentwicklung und Anatomie gegeben. Die Methoden und die erwarteten Ergebnisse des Wunsches Experiment wurden ebenfalls diskutiert. Die Schüler wurden dann leben Zebrafisch auf Somitogenese und prim-6 Stufen der Entwicklung gegeben, und bei 2 und 5 Tage nach der Befruchtung (dpf) unter dem Binokular untersucht. Das war es, den Studierenden ein besseres Verständnis von dem, was Zebrafischembryonen aussehen und welche Arten von morphologischen Veränderungen, die über Ontogenese auftreten. In den nächsten Labor Sitzung wurden die SchülerInnen Zebrafischembryonen in die WISH zuvor hatte ausgeführt gegeben. Sie wurden gebeten, zu studieren und beschreiben die Genexpressionsmuster für jedes Gen von Interesse (Ribosonde verwendet). Embryonen für WISH wurden aus Paarungen zwischen den Mitgliedern einer heterozygoten ace/fgf8a Linie abgeleitet. Basierend auf Mendelschen Vererbung, waren 25% der Embryonen aus der ace/fgf8a Paarungen erwartet, um homozygote Mutanten zu sein und Mängel in vielen der anatomischen Strukturen auf die in diesem Kurs konzentriert aufweisen. Basierend auf den veröffentlichten Berichten und unveröffentlichte Beobachtungen in der Albertson Labor wurden Defekte im Gehirn und unsachgemäße Herzen looping erwartet, aber auch Mängel in den Somiten (Brand et al, 1996;. Albertson und Yelick, 2005; persönliche Beobachtungen). Die Schüler wurden gebeten, alle Proben, Wildtyp (heterozygote Tiere sind nicht von Wildtyp-Geschwister in frühen Stadien der Entwicklung) und homozygote Mutanten zu untersuchen, für jeden Genexpressionsmuster vorgestellt. Sie wurden dann gebeten, Laborberichte beschreiben ihre Ergebnisse zu schreiben, und auf der Grundlage ihrer Kenntnisse der Anatomie und Genetik, wie defekte Gen-Expression kann anatomische Fehlbildungen gefällt haben. Die Schüler schienen diese Laborübung mit Spannung und Neugier zu erhalten. Die meisten hatten noch nie verwendet WISH vor und waren sehr in diesem Teil des Kurses interessiert. Die Schüler fanden die unterschiedlichen Muster der Genexpression in der Zebrafisch-Embryos faszinierend, visualisiert einige sogar beschrieb die Färbungsmuster indem man sie mit bekannten Designs und Symbole, wie ein Smiley-Gesicht. Die daraus resultierende Laborberichte zeigten die Schüler hatten ein allgemeines Verständnis für den Wunsch-Protokoll und die Expression von Genen in bestimmten anatomischen Strukturen. Die Studierenden wurden auch erforderlich, um die spezifischen Funktionen der Gene zu verstehen studierte mit WISH während des Labor (Stickney et al, 2000;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;.. Geetha-Loganathan et al, 2008b ). Es war offensichtlich, aber dass bestimmte Teilnehmer beschränkt Hintergrundwissen über die Signalwege und Gene von Interesse war. Weitere Informationen zu diesen Konzepten in dem Wunsch Einführungsvortrag kann eine willkommene Ergänzung für die Verwendung von WISH in Zukunft Comparative Biology Vertebrate Kurse. Da das Protokoll dauert in der Regel vier aufeinander folgenden Tagen, je nach dem Zeitplan des Kurses können die Schüler nur in der Lage sein, einen Teil des Experiments in der Klasse und der Lehrer muss für den Rest abgeschlossen. In unserem Comparative Biology Wirbeltiere Klasse abgeschlossen Studenten die Färbung Reaktionen im Labor, während die Teaching Assistant durchgeführt alle vorangegangenen Schritte. Wenn es bevorzugt ist, den Schülern durchführen wollen in der Klasse haben, kann das Protokoll in Untereinheiten, die über mehrere Sitzungen Labor durchgeführt werden, können je nach den zeitlichen Rahmen für die Klasse geteilt werden. Wenn es nicht machbar ist für Studenten das gesamte Protokoll durchführen, um, wie es hier war aufgrund der Labor-Sitzung nur einmal in der Woche können die Schüler die Färbelösung zu Beginn der Klasse hinzu, und, je nach Ribosonde verwendet werden, haben die Färbung komplett innerhalb einer Stunde. Die Zeit, die für den Fleck zu entwickeln variiert stark mit jedem Ribosonde und eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen und sollten vor der Klasse vorgegeben werden. Bemerkenswert ist, wenn die Schüler nur dann entwickeln Sie den Fleck in Labor, wird Trainer ist verantwortlich für alle vorhergehenden Schritte, die viel Zeit und Aufwand außerhalb des Klassenzimmers erfordert. Falls gewünscht, könnte eine kürzere Alternative zu wünschen Immunhistochemie mit Antikörper Etiketten Proteinlokalisierung visualisieren, aber in dieser Zeit, sind Zebrafisch-spezifische Antikörper für Entwicklungsbiologie Gene nicht ohne weiteres verfügbar. Eine weitere Möglichkeit wäre, WISH auf verschiedenen Wirbeltierarten durchführennd haben die Schüler vergleichen die Expressionsmuster der gleichen Gene in verschiedenen Organismen (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. Schwellenländer Modellorganismen, 2008; Schwellenländer Modellorganismen, 2010). Das übergeordnete Ziel der Verwendung von WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology Kurses war es, die Studierenden, wie molekularbiologische Techniken verwendet, um anatomische Entwicklung Studie zu demonstrieren. Es bot auch Gelegenheit für Studenten, wie veränderte Genexpression kann nicht nur zu Missbildungen, sondern auch auf evolutionären Wandel führen zu spekulieren. Formalisiert als evolutionäre Entwicklungsbiologie (oft als &quot;Evo-Devo&quot; genannt), soll mit diesem schnell wachsenden Bereich der Studie zur Genotyp und Phänotyp durch die Entwicklung zu verknüpfen und potenzielle mechanistischen Grundlagen der evolutionären Wandel zu erläutern. Mit dem Aufstieg der auf diesem Gebiet sind mehr Ökologen, organismal Biologen und Physiologen Einsatz molekularbiologischer Techniken in ihre Forschung. Wir behaupten, dass die Verwendung von WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology natürlich wird dazu beitragen, den Lehrplan halten, um mit der derzeitigen technologischen und konzeptionellen Fortschritte in der Forschung bisher und eine bessere horizontale Ausrichtung der oberen Ebene der Biologie Kurse durch die Kombination von biologischen Teilfelder zu erleichtern. Darüber hinaus wird diese integrative Ansatz bieten den Studierenden die Möglichkeit, eine Auswahl an biologischen Forschung Techniken in einem Kurs lernen, was zu einer stärker diversifizierten Bildung und die Förderung der Zukunft interdisziplinäre wissenschaftliche Forschung.

<ul><li> Autoclave </li><li> Micro-Zentrifuge </li><li> 37 ° C Inkubator (mit Schüttler) </li><li> 4 ° C Mikro-Zentrifuge </li><li> Wasserbad </li><li> Wirbel </li><li> Gel-Elektrophorese Apparat </li><li> -20 ° C Gefrierschrank </li><li> -80 ° C Gefrierschrank </li><li> Rocker / Schüttler </li><li> 4 ° C Kühlschrank </li><li> Präpariermikroskop (vorzugsweise mit einem Lehr-Bildschirm oder Kamera) </li></ul>

using whole mount in situ hybridization to link molecular and organismal biology

Whole mount in situ Hybridisierung (WISH) ist eine verbreitete Technik in molekularbiologischen Laboratorien verwendet werden, um die Genexpression durch die Lokalisierung von spezifischen mRNA-Transkripte innerhalb der gesamten Probe aufsetzen zu studieren. Diese Technik (in Anlehnung an Albertson und Yelick, 2005) wurde in einer oberen Ebene Bachelor Vergleichende Wirbeltiere Biology Laboratory Klassenzimmer an der Syracuse University verwendet. Die ersten zwei Drittel des Comparative Biology Vertebrate Praktikum gab Studenten die Möglichkeit, der Embryologie und der makroskopischen Anatomie von mehreren Organismen, die verschiedene chordate Taxa in erster Linie über traditionelle Sezieren und die Verwendung von Modellen zu studieren. Der letzte Teil des Kurses beteiligt einen innovativen Ansatz zur Lehre Anatomie durch Beobachtung der Entwicklung von Wirbeltieren beschäftigt molekulare Techniken, bei denen Wunsch auf Zebrafisch-Embryos durchgeführt wurde. Eine heterozygote Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 a (fgf8a) Mutantenlinie, ace, verwendet wurde. Aufgrund Mendelschen Vererbung, Kreuzungen ace produziert Wildtyp, heterozygot und homozygot ace/fgf8a Mutanten in einer 1:2:1-Verhältnis. RNA-Sonden mit bekannten Expressionsmuster in der Mittellinie und in der Entwicklung anatomischen Strukturen wie Herz, Somiten, tailbud, Myotom und Gehirn verwendet. WISH wurde mit Zebrafisch auf den 13 Somiten und prim-6 Stufen, mit Studenten der Durchführung der Farbreaktion in der Klasse. Die Studie des Zebrafisch-Embryos in verschiedenen Stadien der Entwicklung gab den Studierenden die Fähigkeit zu beobachten, wie diese anatomischen Strukturen über Ontogenese verändert. Darüber hinaus zeigten einige ace/fgf8a Mutanten unsachgemäße Herzen Looping und Mängel in Somiten und die Entwicklung des Gehirns. Die Schülerinnen und Schüler in diesem Labor beobachtet die normale Entwicklung der verschiedenen Organsysteme mit beiden äußeren Anatomie sowie Genexpressionsmuster. Darüber hinaus identifiziert und Embryonen Anzeige falsche anatomische Entwicklung und Genexpression (dh, putative Mutanten) beschrieben. Für Lehrer an Institutionen, die nicht bereits über die erforderlichen Geräte oder wo die Mittel für Labor-und curriculare Innovation beschränkt sind, können die finanziellen Kosten für die Reagenzien und Geräte ein Faktor zu betrachten, da wird die Zeit und Mühe auf den Teil der benötigten Lehrer unabhängig von der Einstellung. Trotzdem behaupten wir, dass die Verwendung von WISH in dieser Art von Unterricht im Labor Einstellung kann ein wichtiges Bindeglied zwischen Entwicklungsgenetik und Anatomie bieten. Die Entwicklung schreitet voran und die Fähigkeit zur organismischen Entwicklung auf molekularer Ebene Studie wird einfacher, billiger und immer beliebter, viele Evolutionsbiologen, Ökologen und Physiologen Forschungsstrategien im Bereich der Molekularbiologie drehen. Mit WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology Laboratory Klassenzimmer ist ein Beispiel dafür, wie Moleküle und Anatomie kann in einem einzigen Kurs zusammen. Dies gibt oberen Ebene College-Studenten die Möglichkeit, moderne biologische Forschung Techniken, was zu einer stärker diversifizierten Bildung und die Förderung der Zukunft interdisziplinäre wissenschaftliche Forschung der Praxis.

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Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (WISH) wurde in einer oberen Ebene Bachelor Vergleichende Wirbeltiere Biology natürlich zusätzlich zu Dissektionen Wirbeltiere eingesetzt. Dies gab den Studierenden die Möglichkeit zu Genexpressionsmuster sowie grobe Anatomie zu studieren und verbindet das Studium der molekularen und organismischen Biologie in einem Kurs.

Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link-

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

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Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

21.5K Aufrufe.  Syracuse University. Whole mount In situ Hybridisierung (WISH) wurde in einer oberen Ebene Bachelor Vergleichende Wirbeltiere Biology natürlich zusätzlich zu Dissektionen Wirbeltiere eingesetzt. Dies gab den Studierenden die Möglichkeit zu Genexpressionsmuster sowie grobe Anatomie zu studieren und verbindet das Studium der molekularen und organismischen Biologie in einem Kurs.

Serie: Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Verfahren zur Whole Mount Antikörper-Färbung in Küken

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...