Diese Arbeit wurde unterstützt (teilweise) der Israel Science Foundation (Grant 399/11), von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des deutsch-israelischen Projektkooperation (DIP), und durch die Rappaport Family Institute for Research in der Medizinischen Wissenschaften.

Ein. Generation der induzierbaren Zelllinien <ol><li> Vor dem Experiment muss man die minimale Konzentration des Wirkstoffs G418, die alle Zellen zur Herstellung der gewünschten verwendeten Zelllinien tötet finden. Hierzu Platte, die Zellen der Wahl in mehreren doppelten Platten bei 70% Konfluenz in dem Medium, das während des Experiments verwendet wird und fügen steigenden Konzentrationen von G418 (0-1.000 pg pro ml). Überwachen Sie die Zellen täglich die minimale G418-Konzentration, die die Zellen abtötet effizient zu bestimmen. Zelltod wird innerhalb von 3-7 Tagen beobachtet. </li><li> Vor der Erzeugung von Zelllinien es empfehlenswert, durch transiente Transfektion Assays zu überprüfen, dass das Plasmid Exprimieren des shRNA kann in gewissem Maße die Expression des Gens in Untersuchung zu reduzieren. Dies kann in jeder Zelllinie, die transfiziert werden können effizient durchgeführt werden. </li><li> Platte T-Rex-293 Zellen in einer Dichte von etwa 5x10 6 Zellen pro 10 cm Platte in 8 ml DMEM-Medium (enthaltend 10% Tet syStamm zugelassenen FBS, 2mM L-Glutamin, 100 Einheiten pro ml Penicillin und 0,1 mg pro ml Streptomycin, 5 ug pro ml Blasticidin). Die Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Am folgenden Tag, ändern Sie die mittel-bis 8 ml frisches Medium vor der Transfektion. </li><li> Transfizieren die Zellen unter Verwendung von 10 ug pSuperior.neo + GFP-Plasmid (Abbildung 1) bzw. kodierenden Acf1 SNF2h shRNA durch ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor H1 sowie das Neomycin-Resistenz-Gen fusioniert an GFP und angetrieben durch einen konstitutiven Promotor PGK angetrieben. Fügen Sie die DNA zu 500 ul 150 mM NaCl. Fügen Sie den jetPIE Reagenz zu einem anderen Aliquot von 500 ul 150 mM NaCl bei 2 ul pro ug DNA. Fügen Sie den jetPIE Lösung der DNA und gut mischen durch Vortexen. Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur. Gently pipettieren DNA-Komplexe auf die 10 cm-Platten mit 70-80% konfluenten Zellen. Bringen Sie die Platten in den Inkubator. </li><li> Am nächsten Tag ersetzt des Mediums mit einem selektiven Medium (DMEM Mediumoben beschrieben mit einer zusätzlichen 500 ug pro ml G418). </li><li> Für die nächsten zwei Wochen zu überwachen, die Zellen und ersetzen die selektive Medium mit einem ähnlichen frisches Medium alle 3-4 Tage bis Kolonien erscheinen und kann ohne Mikroskop sichtbar gemacht werden. </li><li> Vor der Isolierung von Kolonien, bereiten 24-Well-Platten mit selektivem Medium. </li><li> Identifizieren Kolonien durch Auge und markieren ihre Lage an der Unterseite der Platte mit einer farbigen Markierung. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass die Kolonien gut getrennt sind. </li><li> In der sterilen Haube, saugen das Medium von der Platte, sanft mit warmem PBS spülen und absaugen auch alle restliche Flüssigkeit. Add 3 ul von 0,25% Trypsin / EDTA, um eine Kolonie auf dem Teller. Pipettieren Sie die Trypsin wiederholt, bis die Zellen lösen und fügen Sie sie in einem der Brunnen in der 24-Well-Platte. Wiederholen Sie dies für einige andere Kolonien auf der Platte. </li><li> Wachsen die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2, bis sie die gut zu füllen. Dann teilen Sie die Zellen, abgeleitet ausjedes der ursprünglichen Kolonien in drei Vertiefungen, die jeweils in einem separaten 12-Well-Platte, und über Nacht inkubieren. </li><li> Am folgenden Tag, ersetzen Sie das Medium in einer Platte mit Medium mit 1 g pro ml Doxycyclin aus einer Stammlösung in doppelt destilliertem Wasser (1-5 mg pro ml) hergestellt. Ersetzen des Mediums in einer Steuerplatte mit Medium ohne Doxycyclin. Inkubieren der Zellen für 72 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Ernte Zellen von einer behandelten und unbehandelten auch ein jedes Zellklon zur Herstellung von Protein-Extrakten und Western-Blot-Analyse, um die Effizienz bzw. Acf1 SNF2h Knockdown bestimmen. Verwenden Antikörper gegen Acf1 oder SNF2h sowie Antikörper gegen alpha-Tubulin, dient als Ladekontrolle. Mit den Zellen in der dritten Wanne, unbehandelt, zum Ausbau der ausgewählten Zellklone, in denen Doxycyclin neben mindestens 50% ige Reduktion im Niveau des Proteins unter Studie führte. Einfrieren Aliquots dieser Zellen in 90% FBS, 10% DMSO zur weiteren Verwendung. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Induktion von Knockdown und Transfektion <ol><li> Platte Zellen in dem selektiven Medium in 10 cm-Platten. Fügen Doxycyclin bei 1 ug pro ml, die Hälfte der Platten und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48-72 h (siehe Abbildung 4). </li><li> Nach 48-72 h, trypsinieren die Zellen aus jeder Gruppe von Zellen, die zähle, und die Platte 1.5x10 6 Zellen pro 6 cm Platte in dem gleichen Medium, mit oder ohne Doxycyclin. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 über Nacht. Planen Sie so, dass jede Gruppe von Platten aus Abschnitt 2.1 werden die Zellen für zwölf 6 cm Platten, darunter zwei Duplikate für die DAPI-Assay für jeden Punkt als auch eine Platte für Western-Blot-Analyse jeder Probe (siehe Abbildung 4) liefern. </li><li> Am folgenden Tag transfizieren die Zellen in 6 cm Platten mit den folgenden Kombinationen von Plasmiden: 1 ug eines leeren Plasmid oder eine identische Menge des Plasmids kodiert E4orf4 zusammen mit 4 g eines Vektorsexprimieren Acf1-GFP oder SNF2h-GFP resistent gemacht zur shRNA in der Zellklone durch Einführen stiller Mutationen oder 3 ug des entsprechenden leeren Vektor und 1 ug Plasmid GFP exprimieren (Abbildung 4). Verwenden des jetPIE Reagenz, wie oben beschrieben (10 ul pro 5 ug DNA), die Transfektionsgemisch vorzubereiten. Für jede Probe, bereiten eine Transfektion Mix für drei Platten. </li><li> Nach einer 15 min Inkubation mit dem DNA jetPIE Reagenz bei Raumtemperatur sanft pipettieren gleiche Mengen an DNA-Komplexe aus jeder Transfektion Masse auf drei 6 cm Platten und Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 über Nacht. </li></ol> 3. DAPI Assay in transfizierten Zellen <ol><li> Am nächsten Tag extrahieren Proteinen aus einer Platte pro Probe für die Western Blot-Analyse, um zu bestimmen, dass Acf1 oder SNF2h wurden effizient abgerissen und daß E4orf4 wurde gleichmäßig in den verschiedenen Proben exprimiert. </li><li> Absaugen Medium aus den Platten für die DAPI bestimmtAssay, waschen Sie die Platten vorsichtig mit PBS und 1 ml 4% Paraformaldehyd in PBS hergestellt, um die Zellen zu decken. Herstellung der Paraformaldehydlösung und Behandlung der Zellen mit diesem chemischen sollte in einer chemischen Haube erfolgen. Inkubation: 15 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln. </li><li> Saugen Sie die Paraformaldehyd und dreimal mit PBS, Schütteln bei Raumtemperatur für jeweils 5 min. Fügen Sie 80% Ethanol bei -20 ° C und inkubieren bei -20 ° C für mindestens 1 h gehalten. Die Platten können unter Ethanol bei -20 ° C für einige Tage solange sie gut zu Ethanol Eindampfen und Trocknen verhindern abgedichtet gehalten. </li><li> Absaugen Ethanol und wäscht die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und einmal mit PBS-BT (PBS mit 0,5% BSA und 0,05% Tween-20), Schütteln bei Raumtemperatur für jeweils 5 min. </li><li> Um unspezifische Antikörperbindung zu verhindern, blockiert die Zellen in 1 ml PBS-BT-Puffer enthaltend 10% Ziegen-Serum für 20 min unter Schütteln bei Raumtemperatur. Dann waschen ter die Zellen zweimal in PBS-BT, jeweils 5 min waschen. </li><li> Inkubieren der Zellen mit dem primären Antikörper (ein E4orf4-spezifischen Antikörpers in unserem Fall) in 1 ml PBS-BT während 1 h Schütteln bei Raumtemperatur. Dann zweimal waschen in PBS-BT und einmal in PBS, enthaltend 0,1% BSA, jeweils 5 min waschen. </li><li> Inkubieren der Zellen in 1 ml PBS-BSA 0,1% mit der entsprechenden sekundären fluoreszenzmarkierten Antikörper und 0,5 ug pro ml Endkonzentration von DAPI für 40 min unter Schütteln bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dann mit PBS für 5 min waschen, trocknen und durch Absaugen und halten die Platten auf den Kopf für eine weitere Stunde bis über Nacht, um eine vollständige Trocknung zu erzielen. Dann montieren Deckgläser auf die Zellen, unter Verwendung Fluoromount-G-Lösung. Halten Platten bei 4 ° C im Dunkeln, bis bereit, den apoptotischen Kernen rechnen. </li><li> Stellen Sie eine Kollegin, die verschiedenen Platten durch neue Zahlen zu identifizieren, so zählen apoptotischer Kerne in den verschiedenen Proben können in eine unvoreingenommene Weise geschehen. </li><li> Visualisieren Sie die Zellen unter einem upright Fluoreszenzmikroskop bei einer Vergrößerung von 400X (in Luft) oder 630X (in Immersionsöl). Identifizieren transfizierten Zellen, die für die verschiedenen Proteine ​​in jeder Probe, ausgedrückt gefärbt sind, und die Anzahl der kondensierten oder fragmentierte Kerne visualisiert durch DAPI-Färbung innerhalb der transfizierten Zellpopulation. Überwachung mehrerer Felder und zählt insgesamt mindestens 200 transfizierten Zellen. </li><li> Der prozentuale Anteil von apoptotischen Kernen mit Morphologie innerhalb der transfizierten Zell-Population. Wiederholen des Versuchs, mit Dubletten, um 2-3 mal berechnen die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den verschiedenen Proben. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die Effizienz der Gewinnung Kolonien in dem bedingte Knockdown der Genexpression erfolgreich gewesen ist variabel, abhängig von dem Gen beteiligt. In unseren Händen, erhalten wir 7 erfolgreiche Kolonien von 12 für Acf1 und 6 von 18 für SNF2h getestet. Abbildung 2 shows einen Vertreter Platte des ausgewählten Zellklone (2A) als auch einer einzelnen Kolonie (2B). Abbildung 3 zeigt eine repräsentative Blot mit Proteinen aus Zellen verschiedener Klone in Gegenwart oder Abwesenheit von Doxycyclin für 72 Stunden gezüchtet extrahiert hergestellt. Der Blot wurde mit Antikörpern gegen SNF2h und alpha-Tubulin angefärbt, die als eine Ladesteuerung. Zwei der Klone (Nr. 4 und 5) zeigte eine starke Verringerung SNF2h Ebenen auf Doxycyclin Induktion. Es sollte angemerkt werden, dass obwohl die pSuperior.neo + GFP-Plasmid (Abbildung 1) zur Erzeugung von den Zellinien kodiert ein neo-GFP-Fusionsprotein verwendet, war das grüne Fluoreszenz in den stabilen Zelllinien sehr gering und Expression von anderen GFP-Fusionsproteine transient in diese Zellen eingeführt konnte leicht über dem Hintergrund grüne Fluoreszenz detektiert werden. Eine schematische Darstellung der durchgeführten Versuche in der Zellklone meadass die Wirkung der Acf1 oder SNF2h Knockdown auf E4orf4-induzierten Zelltod ist in Abb. 4. Die Zeit für Knockdown der Genexpression durch Doxycyclin Behandlung erforderlich kann variieren in Abhängigkeit von der Stabilität des Proteins, dessen Pegel reduziert werden sollte. Für Acf1 und SNF2h wurde eine 72 h Behandlung für effiziente Knockdown auf Proteinebene erforderlich. Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für Zellen, die GFP und E4orf4 und durchläuft Zelltod durch das Auftreten von DAPI-gefärbten Kerne mit einem kondensierten oder fragmentierte Morphologie manifestiert. Abbildung 6 zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments zeigen, dass Doxycyclin-induzierte Acf1 Knockdown an eine LED Erhöhung E4orf4-stimulierten Zelltod (Figur 6A). Dieser Anstieg nicht von einer Erhöhung der E4orf4 Ebenen (6B) führen. Ferner vermindert Wiederherstellung Acf1 den Doxycyclin-induzierte Zellen die Steigerung E4orf4 Toxizität für den Pegeln<html> beobachtet in nicht induzierten Zellen (Abb. 6). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1highres.jpg"/> Abbildung 1. Karte der pSuperior.neo + GFP-Plasmid. Die Karte zeigt das Tetracyclin-induzierbaren H1-Promotor, der shRNA Expression und den PGK-Promotor die Expression eines neo-GFP-Fusionsprotein. Die Karte wurde von der OligoEngine pSuperior manuelle angepasst. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig2.jpg" /> Abbildung 2. Identifizierung von Neomycin-resistente Kolonien. Bilder einer Platte mit Kolonien (A) und einer einzelnen Kolonie (B) gezeigt. Die Kolonien wurden durch Kultivierung der Zellen für 14 Tage in einem selektiven Medium, das Neomycin erhalten. ys &quot;&gt; <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig3.jpg" /> Abbildung 3. Untersuchung der Effizienz Knockdown in ausgewählten Kolonien. Zellen von mehreren Kolonien in Gegenwart von Neomycin selektiert wurden in zwei Vertiefungen ausplattiert. Ein gut jeder Probe wurde durch Doxycyclin (+) induziert und eine Vertiefung wurde unbehandelt gelassen (-). Proteine ​​wurden 72 Stunden nach der Induktion entnommen und chromatographiert auf SDS-PAGE. Der Western-Blot wurde nacheinander mit Antikörpern gegen SNF2h und alpha-Tubulin (dient als Ladungskontrolle) gefärbt und zeigt SNF2h Ebenen induzierten und Kontrollzellen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig4.jpg" /> Abbildung 4. Planen Sie einen typischen knockdown-DAPI-Assay Experiments. Aufeinanderfolgende Schritte des Experiments gezeigt, einschließlich Doxycyclin Behandlung Acf1 oder SNF2h knockdown, eine Transfektion Acf1 oder SNF2h Ausdruck wiederherzustellen oder um eine emp einzuführen erreichenty Vektors und E4orf4 oder ihrer entsprechenden leeren Vektor in die Zellen eingeführt, und die Analyse der Ergebnisse. Doxycyclin-behandelten Platten werden in rot dargestellt (Dox) und Betätigungsplatten sind blau markiert. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4442/4442fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig5.jpg" /> Abbildung 5. Nachweis von E4orf4-induzierten Zelltod durch die DAPI-Assay. Zellen, die die verschiedenen Behandlungen in 4 beschrieben unterzogen wurden fixiert und mit Antikörpern E4orf4 und DAPI, um die Kerne von transfizierten Zellen sichtbar zu machen. Diese spezifische Bild wurde aus einer Probe, die der Steuerung und E4orf4 GFP-Proteins entnommen. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) Zusammengeführte Bilder. Die weißen Pfeile markieren GFP-und E4orf4-transfizierten Zellen mit Kernen mit apoptotischen Morphologien. Rote Pfeilemarkieren Kerne mit unregelmäßigen Formen, die nicht als apoptotischen Kernen gezählt. Sternchen markieren mitotischen Kerne oder Kerne, die gerade geteilt haben. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig6.jpg" /> Abbildung 6. Acf1 Knockdown verbessert E4orf4-induzierten Zelltod. (A) Zellen der T-Rex-293-abgeleitete Zelllinie Acf1-shRNA von einem Tetracyclin-induzierbarer Promotor wurden mit Doxycyclin (+ Dox) oder unbehandelt (-Dox) induziert. Drei Tage später wurden die Zellen mit Plasmiden, E4orf4 (+ E4orf4) oder einen leeren Vektor (-E4orf4) zusammen mit einem leeren Vektor oder ein Plasmid, die GFP-markierten Acf1, die resistent gegen die shRNA wurde gemacht durch die Einführung stiller transfiziert Mutationen. Die Zellen waren vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion fixiert und mit Antikörpern gegen E4orf4 und mit DAPI fixiert. Induktion des Zelltods wurde durch das DAPI oben beschriebenen Test und dem Prozentsatz o gemessenf transfizierten Zellen mit kondensierten oder fragmentierte Kerne bestimmt. Ein repräsentatives Experiment mit drei Wiederholungen gezeigt und Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. (B) Zellen von parallelen Platten wurden für Western Blot-Analyse geerntet. Der Blot wurde mit Antikörpern gegen E4orf4, GFP und Acf1 angefärbt. Die endogene Acf1 und Acf1-GFP in zwei getrennten Platten gezeigt.

<ol>
	<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference.">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li><li>Czauderna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+shRNA+expression+for+application+in+a+prostate+cancer+mouse+model.">Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.</a> Nucleic acids research. 31, e127 (2003).</li><li>Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditional+vectors+for+hairpin+siRNA+knockdowns.">Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.</a> Nucleic acids research. 31, e77 (2003).</li><li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+suppression+of+cellular+genes:+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference.">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> Journal of. 77, 8957-8961 (2003).</li><li>Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+targets+PP2A+to+the+ACF+chromatin-remodeling+factor+and+induces+cell+death+through+regulation+of+SNF2h-containing+complexes.">The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes.</a> Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).</li><li>Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+by+adenovirus+E4orf4+protein+is+cell+line-specific+and+is+mediated+by+the+death+receptor+pathway.">Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway.</a> J. Virol. 75, 789-798 (2001).</li><li>Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+type+5+E4+open+reading+frame+4+protein+induces+apoptosis+in+transformed+cells.">Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells.</a> J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).</li><li>Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4orf4+protein+interacts+with+both+Ba+and+B'+subunits+of+protein+phosphatase+2A,+but+E4orf4-induced+apoptosis+is+mediated+only+by+the+interaction+with+Ba.">Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba.</a> Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E4orf4,+a+novel+adenovirus+death+factor+that+induces+p53-independent+apoptosis+by+a+pathway+that+is+not+inhibited+by+zVAD-fmk.">E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk.</a> J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+induces+growth+arrest+and+mitotic+catastrophe+in+H1299+human+lung+carcinoma+cells.">The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells.</a> Oncogene. 28, 390-400 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases.">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Knockdown der Genexpression ist ein wichtiger Ansatz zur Untersuchung des Beitrags von einem Protein zu Regulationswege. Da konstitutive knockdown der Expression von essentiellen Genen wirkt sich negativ auf Zellproliferation, können ihr Studium erfordern entweder vorübergehende Einführung von siRNAs oder Anwendung von stabilen bedingte knockdown Systeme. Erzeugung stabiler Zelllinien mit der Fähigkeit zur Arzneimittel-induzierter Expression von shRNAs hier beschrieben, bietet einen Vorteil gegenüber transienten Tr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> DMEM high glucose </td><td> Gibco </td><td> 41965 </td><td></td></tr><tr><td> Tet-System zugelassenen FBS </td><td> Clontech </td><td> 631106 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Pen Strep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Trypsin-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> T-REx-293-Zellen </td><td> Invitrogen </td><td> R710-07 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma </td><td> A1720 </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invitrogen </td><td> R210-01 </td><td></td></tr><tr><td> pSuperior.neo + GFP-Plasmid </td><td> OligoEngine </td><td> VEC-PBS-0007/0008 </td><td></td></tr><tr><td> jetPIE </td><td> Polyplus Transfektion </td><td> 101-40 </td><td></td></tr><tr><td> Doxycyclin </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoromount-G </td><td> SouthernBiotech </td><td> 0100-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of cell-lines for conditional knockdown of gene expression and measurement of the knockdown effects on e4orf4-induced cell death

Funktionelle Inaktivierung der Genexpression in Säugetierzellen ist für die Untersuchung der Beitrag eines Proteins von Interesse, um verschiedene Bahnen 1,2. Jedoch wird bedingten Knockdown der Genexpression in Fällen erforderlich, wenn konstitutive Knockdown nicht durch Zellen für einen langen Zeitraum 3-5 toleriert. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Zelllinien erlaubt bedingten Knockdown Untereinheiten des ACF Chromatin-Remodeling-Faktor. Diese Zelllinien erleichtern die Bestimmung des Beitrags von ACF, um die Induktion des Zelltodes durch das Adenovirus-Protein E4orf4 6. Sequenzen, die für kurze Haarnadel RNAs und für die Acf1 SNF2h Untereinheiten des ACF Chromatin-Remodeling-Faktor wurden neben einer Doxycyclin-induzierbaren Promotors in einem Plasmid auch ein Gen enthält, das für Neomycin-Resistenz-Gen kloniert. Neomycin-resistente Zellklone wurden in Gegenwart von G418 und getrennt ausgewählt. Die resultierenden Zelllinien wurden durch induzierteDoxycyclin-Behandlung, und einmal Acf1 oder SNF2h Expressionsniveaus wurden reduziert, wurden die Zellen mit einem Plasmid E4orf4 oder einem leeren Vektor transfiziert. Um die spezifische Wirkung der shRNA Konstrukte zu bestätigen, wurden Acf1 oder SNF2h Proteinniveaus zu WT Ebenen durch Kotransfektion mit einem Plasmid exprimieren Acf1 oder SNF2h die gegen das shRNA gemacht wurden durch Einführen stiller Mutationen wiederhergestellt. Die Fähigkeit von E4orf4 zum Zelltod in den verschiedenen Proben zu induzieren, wurde durch eine DAPI-Assay, in dem die Häufigkeit des Auftretens von Keimen mit apoptotischen Morphologien in der transfizierten Zellpopulation 7-9 gemessen wurde. Die hier beschriebene Protokoll kann zur Bestimmung der funktionellen Beitrag verschiedener Proteine, um die Induktion des Zelltods durch ihre Proteinpartner in Fällen verwendet werden, wenn konstitutive Knockdown-Zelle tödlich sein kann.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death at JoVE.com

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Beitrag des ACF Chromatin-Remodeling Faktor E4orf4-induzierten Zelltod wurde gemessen. Das Protokoll umfasst Selektion von Zellklonen, in denen Doxycyclin Behandlung induziert bedingten Knockdown des ACF-Untereinheiten und Acf1 SNF2h, und die Verwendung des Assay E4orf4 DAPI-induzierten Zelltod in den induzierbaren Zelllinien messen.

Vorbereitung der Cell-Linien für Conditional Knockdown der Genexpression und Messung der Knockdown Auswirkungen auf E4orf4-induzierten Zelltod

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

preparation-cell-lines-for-conditional-knockdown-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Aufrufe.  Technion - Israel Institute of Technology. Beitrag des ACF Chromatin-Remodeling Faktor E4orf4-induzierten Zelltod wurde gemessen. Das Protokoll umfasst Selektion von Zellklonen, in denen Doxycyclin Behandlung induziert bedingten Knockdown des ACF-Untereinheiten und Acf1 SNF2h, und die Verwendung des Assay E4orf4 DAPI-induzierten Zelltod in den induzierbaren Zelllinien messen.

Serie: Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

Generierung von stabilen menschlichen Zelllinien mit Tetracyclin-induzierbarer (Tet-on) shRNA oder cDNA Expression

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Groß Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwenden dsRNA Fütterung Bibliotheken zu Robust Loss-of-function Phänotypen generieren

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In vivo siRNA-Transfektion und Gene Knockdown im Rückenmark über Rapid-Nichtinvasive Lendenwirbel intrathekale Injektionen in Mäuse

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...