1. Die Vorbereitung und das Zählen der Namalwalzellen <ol><li> Entfernen Zellen aus Kulturflasche und Zentrifuge die Zellen zu pelletieren. Überstand entfernen und die Zellen in einem bekannten Volumen von PBS. Die Zellen in diesem Protokoll verwendet werden Suspensionszellen. Wenn Sie mit adhärenten Zellen werden, müssen Sie vor dem Sammeln trypsinize. </li><li> Um zu bestimmen, die Anzahl der lebenden Zellen, Fleck ein Aliquot der Zellsuspension durch Mischen 1:1 mit einer 0,4% Trypanblau-Lösung angesetzt und 10 ul der Mischung auf eine Zählung Rutsche, und fügen Sie dann den Schieber in die TC10 automatisierte Zelle counter (Bio-Rad Laboratories, Inc). </li><li> Die TC10 Zelle Zähler Autofokus zu gewährleisten, die genaue Anzahl, und fahren Sie dann mit dem Zählen. Es ermittelt automatisch die Dichte von lebenden Zellen und insgesamt Zellen in der Probe. </li><li> Ansicht auswählen Bild, um die Zellen auf dem Hauptschirm angezeigt. Wählen Sie dann die Verdünnung Rechner, um die TC10 Zellzähler haben berechnet automatisch die Höhe der Zelle Mischung, die benötigt werden. </li><li> Dieses Experiment ist mit insgesamt drei siRNAs: eine Kontroll-siRNA und zwei verschiedenen siRNAs die STAT6 Gen, plus untransfizierte steuert. Dies erfordert 3,6 ml in einer Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen pro ml. </li><li> Geben Sie die gewünschte Konzentration und letzte Band von Werten in der Verdünnung-Rechner, und berechnet das Volumen der Zellsuspension benötigt basierend auf den Live-Zellzahl für diese Probe. Alternativ führen Sie die Berechnung manuell. Übertragen Sie anschließend die gewünschte Lautstärke der Zelle Mischung für diese Experimente in ein neues Röhrchen. </li><li> Spin the Zellgemische die Zellen zu pelletieren und entfernen Sie alle PBS. Resuspendieren in 3,6 ml Gene Pulser Elektroporation Puffer (Bio-Rad Laboratories). Transfer-800 ul Aliquots in Röhrchen mit den entsprechenden siRNAs und vorsichtig mischen. Die Zellen sind nun bereit für die Elektroporation. </li></ol> 2. Elektroporation der Zellen in 96-well Platten <ol><li> Der 96-well Platte Elektroporation ermöglicht die Wiederholungen für alle vier Behandlungen zusammen elektroporiert werden. </li><li> Transfer 150 ul der Zellsuspension in die Vertiefungen einer 96-well Platte Elektroporation. </li><li> Legen Sie die Platte in der MXcell Elektroporation Platte Kammer und den Deckel schließen. </li><li> Elektroporieren mit den Einstellungen für die Zell-Linie und Puffer verwendet wird optimiert. Diese Zellen sind elektroporiert mit einem exponentiellen Abfall Welle mit Geräteeinstellungen von 250 V, 350 uF und 1000 Ω Widerstand. </li><li> Nach der Elektroporation abgeschlossen ist, Pipette nach oben und unten leicht in jede Vertiefung zu mischen und dann übertragen Zellen einer Gewebekultur Platte mit vorgewärmten Medien. Namalwa Zellen werden in RPMI (Life Technologies) mit 7,5% FCS und 1% Pyruvat ergänzt gewachsen. </li><li> Kontrollproben, die nicht elektroporiert werden von den verbleibenden Zellsuspension aufgenommen und zu Kulturschalen vorgewärmtes Kulturmedium identisch mit dem elektroporiert Zellen. </li><li> Inkubieren Zellen über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Nach 24 Stunden wurde eine Reihe von Zellen mit 10 ng / ml Endkonzentration rekombinanten IL-4 (R &amp; D Systems) induziert. Der zweite Satz von Kontroll-Zellen erhalten nur zusätzliche Medien. Alle Zellen sind weitere 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubiert. </li></ol> 3. Extract und kontrollieren RNA <ol><li> Nach insgesamt 48 Stunden auf Wachstum, zählen Sie die Zellen in jeder Vertiefung und Transfer ein Aliquot aus jedem Well ein Mikrozentrifugenröhrchen für die RNA-Extraktion, und frieren ein zweites Aliquot für Western-Blot oder andere Protein-Analyse. </li><li> Centrifuge Proben die Zellen zu pelletieren, und dann zu entfernen und den Überstand verwerfen aus jedem Röhrchen. </li><li> Fahren Sie mit der RNA-Extraktion. Wir verwenden in der Regel die Aurum Gesamt-RNA-Kit (Bio-Rad) nach dem mitgelieferten Protokoll. </li><li> Bei der Überwachung von siRNA-vermittelten Gen-Knockdown ist es besonders wichtig, um RNA-Qualität zu überprüfen, weil abgebaut RNA irreführenden Ergebnissen führen wird. Die 260/280 Ratio weist nicht auf RNA-Integrität daher ist es wichtig, die Proben auf einem Gel oder Mikrofluidikvorrichtung zu bestätigen RNA nicht abgebaut laufen. </li><li> Um zu beurteilen, die Qualität und Quantität in einem Schritt, werden diese Proben analysiert mit dem Experion automatisierte Elektrophorese-System (Bio-Rad) werden. </li><li> First-, Wärme-Proben. Dann, prime, laden und Wirbel der Experion RNA-Chip. Legen Sie die Chips in das Experion Elektrophorese-Station und starten Sie laufen. </li><li> Nach dem Lauf abgeschlossen ist, wird die Software Experion Ergebnisse automatisch in Form von ein Elektropherogramm, Ergebnisse Tabelle (dh zeigt RNA-Konzentration, die ribosomale-Verhältnis und die RNA Qualitätsindikator Zahl), und virtuelle Gel (die sieht ähnlich aus wie ein traditionelles RNA Gel). Hohe Qualität der Gesamt-RNA Proben werden typischerweise eine RQI von 8-10. </li&gt; </ol> 4. Real-time PCR <ol><li> Nach Überprüfung der RNA-Qualität, mit der cDNA Reaktionen ablaufen. Dieses Experiment verwendet die iScript one-step RT-PCR-Mix (Bio-Rad) zur cDNA-Synthese und real-time PCR in einer Reaktion zu kombinieren. </li><li> Machen Sie einen Master-Mix enthält alle Reaktionskomponenten außer der RNA-Templates für jedes Primer-Set, und verteilen diese in die PCR-Platte. </li><li> Nach Verdünnen der RNA, um eine gleichmäßige Konzentration, fügen Sie die RNA-Proben in die entsprechenden Vertiefungen. Jede Reaktion ist in dreifacher Ausfertigung gesetzt. </li><li> Verschließen Sie die Platte, und legen Sie sie in die CFX384 real-time PCR-System (Bio-Rad). Wählen Sie das entsprechende Protokoll und beginnen den Lauf. </li><li> Nachdem der Lauf beendet ist, wird die Genexpression durch den Vergleich der Genexpression des Gens von Interesse normalisiert, um eine Referenz-Gen in Zellen mit experimentellen siRNA auf die gleiche Normalisierung der Zellen durch Elektroporation mit einem Kontroll-siRNA elektroporiert bestimmt. </li></ol> 5. Die Analyse der siRNA Knockdown <ol><li> Die Expression von CCL17 überwacht wurde mittels quantitativer real-time PCR, um die Rolle des Transkriptionsaktivators STAT6 in IL-4 abhängige Induktion von CCL17 zu untersuchen. Für dieses Experiment wurde GAPDH als Referenz-Gen verwendet. Alternate Verweis Gene oder mehrere Referenz-Gene können in der gleichen Weise eingesetzt werden. </li><li> Die CFX-Manager-Software automatisch CCL17 Ausdruck Ausdruck der Referenz-Gen aus derselben Probe normalisiert und automatisch verglichen die resultierende normalisierte Werte zu Behandlungen durch einfaches Auswählen GAPDH als &quot;Referenz&quot; und die Kontrolle der Behandlung (Kontroll-siRNA ohne IL-4-Induktion) als Kontrolle &quot;Kontrolle&quot; in die experimentellen Einstellungen Fenster der CFX-Manager-Software. </li><li> Ohne IL-4-Induktion, die Transkription von CCL17 blieb niedrig, konstitutive Niveau vergleichbar mit der Kontrolle der Behandlung. </li><li> Zellen mit IL-4 induziert und Beibehaltung einer normalen STAT6 Weg (dh Kontroll-siRNA oder transfizierten Kontrollzellen Behandlungen) zeigte 8-10 fache Induktion von CCL17 Ausdruck. </li><li> Zellen mit IL-4, aber mit STAT6 Ausdruck gehemmt durch die Einführung von entweder STAT6 siRNA induzierte zeigten nur etwa 2-fach höher CCL17 Ausdruck als die induzierten Zellen bestätigt die Rolle der STAT6 in der IL-4 induzierte Expression von CCL17. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Übersicht über die IL-4-Signalweg. A) Die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor führt zur Dimerisierung und Aktivierung von STAT6. Aktiviert STAT6 in den Zellkern und aktiviert die Transkription seiner Zielgene, wie CC17. B) Ohne IL-4-Induktion wird die Transkription von CCL17 bei niedrigen, konstitutive Niveau bleiben. C) Nach dem siRNA-vermittelten Inaktivierung des Gens STAT6, sollte die Behandlung mit IL4 zu wenig oder gar keine Erhöhung der CCL17 Expression führen. <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Induktion von CCL17 durch IL4 von verschiedenen Bedingungen durch quantitative real-time PCR gemessen. A) Die Proben ohne IL-4 angewachsen war eine geringe konstitutive Niveau der Expression, unabhängig von der Genexpression. B) Wie in grün und blau dargestellt, reagiert Kontrollproben in der Regel auf die Behandlung mit IL-4, mit eine 8-10 fache Induktion von CCL17. Allerdings Zellen mit siRNAs STAT6, in rot und pink gezeigt transfiziert, hatte CCL17 Ausdruck in Reaktion auf IL-4 vermindert, unterstützt die Idee, dass STAT6 spielt eine Rolle in der IL-4 induzierte Expression von CCL17.

Der Autor wird von Bio-Rad Laboratories, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.

Dieser Artikel wurde gezeigt, wie siRNAs in eine schwierige elektroporieren Aussetzung Zelllinie transfizieren und wie die Genexpression in diesen Zellen folgen. Wenn Sie dieses Verfahren es ist wichtig sich daran zu erinnern, die Dinge so konsequent wie möglich in allen Proben zu halten.

using an automated cell counter to simplify gene expression studies: sirna knockdown of il-4 dependent gene expression in namalwa cells

Die Verwendung von siRNA-vermittelten Gen-Knockdown ist weiterhin ein wichtiges Instrument in Studien der Genexpression werden. siRNA-Studien werden durchgeführt, nicht nur die Auswirkungen der Herunterregulieren einzelner Gene zu studieren, aber auch Signalwege und andere komplexe Interaktion Netzwerke zu verhören. Diese pathway-Analysen erfordern sowohl die Verwendung der entsprechenden zellulären Modellen und Methoden, die weniger Störung der zellulären Physiologie verursachen. Die Elektroporation wird zunehmend als ein wirksames Mittel zur siRNA und anderen Nukleinsäuren in schwierigen einzuführen, um Zelllinien und Primärzellen, ohne den Signalweg untersucht transfizieren verwendet. Es gibt mehrere wichtige Schritte zu einer erfolgreichen siRNA Experiment, und es gibt Wege, um die Arbeit zu vereinfachen und gleichzeitig die Verbesserung der Datenqualität in mehreren experimentellen Stadium. Um Ihnen bei Ihrem siRNA-vermittelten Gen-Knockdown Projekt gestartet haben, werden wir demonstrieren, wie man einen Weg Studie komplett aus Sammeln und Zählen der Zellen vor der Elektroporation durch post Transfektion real-time PCR Genexpressionsanalyse durchführen. Die folgende Studie untersucht die Rolle des Transkriptionsaktivators STAT6 in IL-4 abhängige Genexpression von CCL17 in einer Burkitt-Lymphom-Zelllinie (Namalwa). Die Techniken demonstriert werden für eine breite Palette von siRNA-Experimenten auf beiden adhärenten und Suspensionszellen nützlich. Wir werden auch zeigen, wie man Zellzählung mit dem TC10 automatisierte Zelle zu begegnen, wie man mehrere Proben gleichzeitig mit dem MXcell Elektroporationssystem elektroporieren, und wie man gleichzeitig zu beurteilen RNA Qualität und Quantität mit dem Experion automatisierte Elektrophorese-System zu optimieren.

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Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Dieses Verfahren beschreibt eine schnelle und einfache Workflow siRNA in schwierigen einzuführen, um Zelllinien zu transfizieren und folgen Genexpression durch real-time PCR. Verwendung eines automatisierten Zellzahl, bieten Multi-Well-Platte Elektroporation und automatisierte Elektrophorese Station schnelle und zuverlässige Ergebnisse ohne die Notwendigkeit für teure Roboter-Handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

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Serie: Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elektrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.

Vorbereitung der Cell-Linien für Conditional Knockdown der Genexpression und Messung der Knockdown Auswirkungen auf E4orf4-induzierten Zelltod

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...