Wir möchten die Mitglieder des Buchholz-Labor und die Sigma-Aldrich RNAi-Team zur Diskussion zu bestätigen. Wir möchten die Max-Planck-Gesellschaft und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung grands Go-Bio [0315105] für die Unterstützung bedanken. MISSION ® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sigma-Aldrich Biotechnology LP

1. Hochwertige MISSION esiRNA Bibliotheken <ol><li> Für jedes Gen von Interesse am anfälligsten und spezifische Zielregion für RNAi gewählt Nutzung der DEQOR Algorithmus (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). 4 DEQOR Partituren zum Schweigen Potenzial aller möglich 21 Nukleotide lange siRNAs in einem Ziel-mRNA auf State-of-the art Design-Constraints 4. Darüber hinaus wird jeder potenzielle siRNA für mögliche Kreuzreaktionen mit anderen Genen, indem Sie eine BLAST-Suche gegen das Transkriptom des Organismus untersucht analysiert. Das Programm bietet damit eine Analyse der allgemeinen Qualität und cross-Silencing Kapazitäten der potenziellen esiRNA (300-600 bp Länge). </li><li> Die gewählten Region der Ziel-Gen cDNA durch PCR mit genspezifischen Primern von Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor-Sequenzen flankiert verstärkt. </li><li> Jeder PCR-Produkt für MISSION esiRNA Produktion verwendet wird, für die Identität durch Sequenzierung und für die Reinheit von Caliper LabChip verifiziert. </li><li> Lange doppelsträngige RNA wird aus dem PCR-Produkt durch die RNA-Polymerase, durch ein Glühen der transkribierten Stränge verfolgt transkribiert. </li><li> esiRNAs sind begrenzt durch enzymatische Verdauung der langen doppelsträngigen RNA mit RNaseIII durch Reinigung über Anionenaustauscher-Chromatographie unter Verwendung von Q-Sepharose Spin-Säulen, hergestellt. </li><li> esiRNAs werden gefällt und resuspendiert in TE-Puffer. Die Ausbeute wird durch UV-Absorptionsmessungen gemessen und die Konzentration wird durch Lösen in einem geeigneten Volumen TE-Puffer eingestellt. Die Qualität des Endprodukts wird durch Caliper LabChip Analyse überprüft. </li></ol> 2. Die Wahl einer Zelllinie und die Optimierung der Transfektion für das Screening <ol><li> Titrieren Mengen esiRNA (Verwendung Eg5 als positiv und Renilla-Luciferase als Negativ-Kontrolle) und steigende Mengen an Transfektionsreagenz in einer 384-Well-Platte, fügen Zellen und inkubieren für 48 Stunden. Eg5 ist ein Kinesin-Motorproteine ​​für bipolare Spindel-Anordnung und eine Depletion führt zu einer mitotischen verhaften. Wiederholen Sie diesen Vorgang für verschiedene Transfektionsreagenzien und Zelllinien. Hier verwenden wir HeLa-Zellen kultiviert folgenden Standardverfahren und oligofectamine (Invitrogen) als Transfektionsreagenz. </li><li> Für die Auswahl der optimalen Transfektionsbedingungen zählen die Zellen mit Eg5 esiRNAs, dass eine Mitose (runde Form) und die Gesamtzahl der Zellen mit Renilla-Luciferase (RLuc) esiRNA mittels Lichtmikroskopie transfizierten zeigen transfiziert. Wählen Sie den Zustand mit der geringsten Toxizität für RLuc und am ausgeprägtesten Phänotyp für Eg5. Eine alternative Methode für die Optimierung der Transfektion Bedingungen beinhaltet eine stabile Zelllinie EGFP (oder ein anderes geeignetes Reportergen) unter der Kontrolle eines konstitutiven aktiven Promotor. Nach der Transfektion eines esiRNA gegen EGFP (oder einem anderen Reporter-Gen) und RLuc (oder einem anderen geeigneten Negativkontrolle esiRNA) messen knock-down Wirksamkeit und Toxizität von zB Fluoreszenz unterstützt Zellsortierung (FACS). Stellen Sie sicher, dass die verwendeten esiRNA für EGFP vollständig komplementär zu den Ziel-mRNA ist. </li></ol> 3. Einrichten des primären Bildschirms 5,6 <ol><li> Optimieren Sie die Pipettiergenauigkeit für alle verwendeten Komponenten auf einem automatischen Pipettieren Station (zB Aquarius, Tecan und WellMate, Matrix). Da Pipettieren Parameter auf die Art von Lösung, Volumen und Plattentyp ändern sich in Abhängigkeit dieser Optimierung muss für jeden Schritt einzeln wiederholt werden. Wenn möglich, sollte das Pipettieren Station unter einer Sterilbank platziert werden, um Kontaminationen zu vermeiden. Alle verwendeten Komponenten sollten vor der Verwendung desinfiziert werden entweder durch Autoklavieren ggf. oder durch Besprühen mit 75% Ethanol. Optimieren wash-Protokolle, so dass eine Kreuzkontamination von Brunnen zu Brunnen ist ausgeschlossen. Details für die Optimierung von Pipettierautomaten kann nicht geben, für die Raum-Einschränkungen und hängen stark von der verwendeten Pipettierstation. Für weitere Informationen beziehen sich auf die Hersteller-Protokoll. </li><li> Transfektion von Zellen in 384-Well-Format mit den optimierten Bedingungen von oben mit esiRNAs für Eg5 und RLuc. Verwenden Sie ein abwechselndes Muster für Eg5 und RLuc esiRNA über die gesamte Platte. </li><li> Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden beheben die Zellen mit kaltem 100% Ethanol in PBS rehydriert für 15 Minuten, Edelstahl für 25 Minuten in PBS mit 1 pg / ml DAPI und 100 ug / ml RNase A (Qiagen). Schließlich mit PBS und speichern Waschen bei 4 ° C. </li><li> Messen Sie die Intensität der DAPI-Fluoreszenz-Mikroskopie durch z. B. auf einer Olympus ScanR System. Generieren Sie ein Histogramm durch Auftragen DAPI-Intensität gegen die Zellzahl und Auswertung der Zellzyklus-Verteilung durch die Berechnung der Anteil der Zellen mit der DNA-Gehalt 2N für G1-Phase; &lt;2N&gt; 4N für S-Phase; 4N für G2/M-phase und &gt; 4N für Aneuploidie / Polyploidie. </li><li> Beurteilen Sie die Homogenität der Ergebnisse über die Platte. Eine weitere Optimierung ist notwendig, wenn die Ergebnisse signifikant zu positionieren effe auszuschließencts. Ein häufiges Problem bei der Verwendung von Multi-Well-Platten wird verbessert Verdunstung am Rande Brunnen während Inkubationszeit. Dies führt zu unterschiedlichen experimentellen Bedingungen in verschiedenen Vertiefungen, die oft übersetzt Platte-Position spezifische Wirkungen. Aus diesem Grund empfehlen wir allen Rand Brunnen leer für einen Bildschirm zu verlassen. Zur weiteren Minimierung Verdunstung sorgen dafür, dass die Inkubatoren bei hoher Luftfeuchtigkeit aufbewahrt werden. Wir setzen routinemäßig Verdunstung Barrieren wie Corning Atmungsaktive Dichtungsband, die Verdunstung zu blockieren. Auch andere Ressourcen für die Position Effekte zu berücksichtigen, z. B. technische Veränderung der Anzeige-System (Mikroskop, Platten-Lesegerät, etc) oder Variationen in Liquid Handling (Steigungen, Inhomogenität der Lösungen, etc.) entnommen werden. </li><li> Die statistischen Unterschiede zwischen positiven und negativen Kontrollen stellen ein Maß für die Bedeutung des Tests verwendet. Ein großer Unterschied zwischen negativen Kontrolle (oder Hintergrundgeräusche; Mock-Kontrolle) und Probe muss vor Beginn der eigentlichen Screening festgestellt werden. Ein gutes Maß für die statistische Signifikanz der Z-Faktor. Der Z-Faktor ist nach der Gleichung berechnet: Z = 1 - (3 SD [sample] + 3 SD [Mock]) * (| Av [sample] - Av [Mock] |) -1; mit SD: Standardabweichung, Av: Durchschnitt. Ein Z-Faktor von 1&gt; Z&gt; 0,5 zeigt eine statistisch signifikante Trennung der negativen Kontrollen (und Lärm) von den positiven steuert 7. </li></ol> 4. Primäre Bildschirm <ol><li> Bereiten Sie 384-well-Zellkulturplatten für die Transfektion von esiRNAs Nutzung der optimierten Bedingungen von oben. Hier verwenden wir 15NG esiRNA pro Well in 5μl TE-Puffer gelöst. Mindestens acht Kontrolle Positionen pro Platte sollte mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen für den biologischen Prozess untersucht (: Eg5 und RLuc hier) geladen werden. Um zu vermeiden, Position Effekte Rande Vertiefungen werden mit 5μl TE-Puffer nur geladen. </li><li> Add 5μl OptiMEM (Invitrogen) mit 0.2μl Oligofectamine pro Well, Mischen und inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Add Zellsuspension auf die Transfektion Mischung (hier: 40 ul einer HeLa Zellsuspension bei 25 Zellen / ul Konzentration; äquivalent zu 1000 Zellen pro well) und Inkubation für 72 Stunden. </li><li> Messen DNA-Inhalte auf einem automatisierten Mikroskop (Olympus ScanR, siehe oben). Bewerten mit Z-score-Statistik für hit Auswahl: Z-Scores werden für alle Proben esiRNAs mit dem Signal für die negative Kontrolle als Referenz berechnet. Beachten Sie, dass die Z-score nicht das gleiche wie das Z-Faktor. Z-Scores bieten ein statistisches Maß für die Bedeutung der Abtastwerte im Vergleich zu einem (Mock-) Kontrolle. Es ist nach der Gleichung berechnet: Z = (Wert [Sample] - durchschnittlich [Mock]) * Standard-Abweichung [Mock] -1. Für Hit Auswahl eines Schwellenwerts muss angewendet werden. In der Regel wie eine Bedeutung Kriterien: 2 &lt;Z &lt;-2 verwendet wird, sondern abhängig von der Qualität des Datensatzes, der studierte biologischen Prozess oder einfach nur den Rahmen des Bildschirms, unterschiedliche Schwellenwerte könnten erhoben werden. Neben den recht einfach Z-score Statistiken auch aufwändigere mathematische Auswerteverfahren verwendet werden (ein erster Einblick in das weite Feld der statistischen Auswertung der Screening-Daten können in Malo et al. 8). </li></ol> 5. Sekundäre Bildschirm und drücken Sie die Validierung <ol><li> Ein zweiter Bildschirm folgt den primären Bildschirm, um Fehlalarme aufgrund von experimentellen Fehlern oder Off-Target-Effekte zu beseitigen. Für die ausgewählten hits dem gleichen Verfahren wie in den primären Bildschirm verwendet werden, sollten für eine größere Anzahl von Wiederholungen (3-5) wiederholt werden, um eine bessere statistische Auswertung zu ermöglichen. </li><li> Für überprüft trifft ein sekundärer, nicht-überlappenden esiRNA (oder ein anderes nicht-überlappenden silencing Trigger) gegen die Ziele in den ersten Screens identifiziert verwendet werden sollte. Das gleiche Test und Auslesen sind als für den primären Bildschirm verwendet werden. </li><li> Letztendlich ist die ausgewählten Gene können durch cross-species RNAi Rettung 9 validiert werden. Dadurch wird eine bakterielle künstliche Chromosom (BAC) Verschlüsselung, wie zB die Maus Ortholog des Gen stabil in Zellen transfiziert. BAC-Konstrukte erhalten ein Gen in ihrer genomischen Kontext und ermöglichen eine fast-physiologische Ausdruck. RNAi gegen die endogenen menschlichen Gen verlassen die Maus Transgenexpression unverändert, die die RNAi-Phänotyp-rettet. RNAi-Rettung bietet der Gold-Standard für die Überprüfung der RNAi-Phänotypen bislang nicht verfügbar. </li><li> Schließlich werden die validierten Kandidaten im Detail untersucht, um schließlich daraus mechanistische Verständnis. In vielen Fällen RNAi kann in diesen Experimenten verwendet werden, zB in der Sekundarstufe, aufwändigere Tests. </li></ol>

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	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li><li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi.">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li><li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens.">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li><li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEQOR:+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs.">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li><li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+mammalian+cell+division.">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells.">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells.">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies.">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li></ol>

Autoren erklären, finanzielle Beziehungen mit kommerziellen Unternehmen, die ein Interesse an der eingereichten Arbeit haben könnte.

RNA-Interferenz hat sich zu einem Standard-Technik, um loss-of-function Phänotypen studieren. Groß angelegte Sammlungen von RNAi-Mediatoren sind von verschiedenen Herstellern erhältlich und bieten eine einfache, kostengünstige und schnelle Methode für die Gen-Silencing. Diese öffnete sich das Tor für das systematische Screening für Key-Player in vielen biologischen Prozessen ermöglicht ein Genom-Skala Perspektive auf eine Vielzahl von verschiedenen Arten und Zelltypen. Hohe falsch positiven und falsch negativen Ergebnisse sind eine gemeinsame Herausforderung in RNAi-Screens. Um dieses Problem anzugehen, haben erhebliche Anstrengungen investiert, um die Wirksamkeit zu verbessern und insbesondere die Spezifität der silencing auslöst. Eine wichtige Entdeckung war, dass ein Pool von verschiedenen siRNAs demselben Transkript stark erhöht Zielspezifität. Da ein sehr komplexes Pool von verschiedenen siRNAs durch die Endoribonuklease produziert wird, werden esiRNAs hohen Zielspezifität auslöst, die Verringerung der Quote an falsch positiven RNAi-Screens. esiRNAs haben auch gezeigt, um eine effiziente Niederschlägen zu erreichen, wodurch auch die falsch-negative Rate. Da RNAi-Screens technisch anspruchsvoll sind, werden sie wahrscheinlich schwierig bleiben, um auf einem Routine-Basis für einige Zeit durchzuführen. Doch wie bekommen Reagenzien und Instrumente besser und Labors teilen ihre Erfahrungen, sind die Verwendung von RNAi-Screens in der modernen Biologie als auch in Zukunft zu erhöhen.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments</td>
</tr>	
<tr>
<td>MISSION esiRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For additional information contact: rnai@sial.com</td>
</tr>
<tr>
<td>Wellmate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoScientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Breathable sealing tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OptiMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=E7023|SIAL&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Ethanol</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E7023</td>
<td>200 proof (absolute), for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P5493|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Phosphate buffered saline</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P5493</td>
<td>BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=D8417|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&#x2032;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D8417</td>
<td>Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC)</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=R6513|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonuclease A from bovine pancreas</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R6513</td>
<td>For molecular biology, &ge;70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T9285|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA buffer solution</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T9285
</td>
<td>100 x, for molecular biology</td>
</tr>
</table>

mission esirna for rnai screening in mammalian cells

RNA-Interferenz (RNAi) ist eine grundlegende zelluläre Mechanismus für die Kontrolle der Genexpression. RNAi wird von kurzen doppelsträngigen RNAs auch als small interfering RNAs (siRNAs) bezeichnet induziert. Die kurze doppelsträngige RNAs stammen aus mehr doppelsträngigen Vorstufen durch die Aktivität von Dicer, ein Protein der RNase III Familie von Endonukleasen. Die resultierenden Fragmente sind Bestandteile des RNA-induced silencing complex (RISC), lenkt sie auf die verwandten Ziel-mRNA. RISC spaltet die Ziel-mRNA wodurch die Expression des kodierten Proteins 1,2,3. RNAi hat sich zu einem mächtigen und weit verbreiteten experimentellen Methode für den Verlust der Genfunktion Studien in Säugerzellen Nutzung small interfering RNAs. Derzeit sind zwei wichtigsten Methoden sind für die Produktion von small interfering RNAs. Eine Methode besteht in der chemischen Synthese, während eine alternative Methode beschäftigt endonukleolytische Spaltung der Ziel-spezifischen langen doppelsträngigen RNAs von RNase III in vitro. Dabei ist eine vielfältige Pool von siRNA-Oligonukleotide wie erzeugt, die auch als Endoribonuklease vorbereitet siRNA oder esiRNA bekannt. Ein Vergleich der Wirksamkeit von chemisch abgeleiteten siRNAs und esiRNAs zeigt, dass beide Trigger potent in Ziel-Gen-Silencing sind. Unterschiede können jedoch beim Vergleich Spezifität werden. Viele einzelne chemisch synthetisierte siRNAs herstellen prominenten Off-Target-Effekte, während die komplexen Gemisch innewohnt esiRNAs führt zu einer spezifischen Knockdown 10. In dieser Studie präsentieren wir die Gestaltung der genomweite MISSION esiRNA Bibliotheken und deren Nutzung für die RNAi-Screening durch einen DNA-Gehalt Bildschirm für die Identifizierung von Genen in den Ablauf des Zellzyklus beteiligt veranschaulicht. Wir zeigen, wie die Transfektionsprotokolls und der Test für das Screening in hohem Durchsatz zu optimieren. Wir zeigen auch, wie groß Datensätze können statistisch ausgewertet werden und gegenwärtige Methoden zur primären Treffern zu validieren. Schließlich geben wir mögliche Ansatzpunkte für weitere funktionelle Charakterisierung von validierten Hits.

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MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Hier verwenden wir ein menschliches esiRNA Bibliothek in einem Hochdurchsatz-Screening nach Genen der Zellteilung beteiligt. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Durchführung eines esiRNA Bildschirme, und wie zu analysieren und die Ergebnisse überprüfen.

MISSION esiRNA für RNAi-Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K Aufrufe.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Hier verwenden wir ein menschliches esiRNA Bibliothek in einem Hochdurchsatz-Screening nach Genen der Zellteilung beteiligt. Wir zeigen, wie die Einrichtung und Durchführung eines esiRNA Bildschirme, und wie zu analysieren und die Ergebnisse überprüfen.

Serie: MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Forschung

Biologie

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing und Subkultivierung Säugerzellen

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Bakterielle Lieferung von RNAi Effektoren: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Bibliothek Screening in Säugerzellen

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.