Wir möchten Scott Hamilton, und die Mitglieder der O&#39;Halloran Labor für sorgfältige Lektüre des Manuskripts danken. Wir danken auch unseren anonymen Gutachter für gute Vorschläge und aufschlussreiche Kommentare.

Ein. Bau der GFP Tagged EGL-4 Ausdruck Tiere <ol><li> Klonen die translationale Fusion GFP :: EGL-4 unter dem Promotor für das odr-3-Gens (2678 bp Gebrauch unmittelbar vor dem Startkodon): (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4. Die odr-3-Promotor-Laufwerke Ausdruck in den amphid Neuron Paare: AWA, AWB, AWC und schwach ASH. </li><li> Injizieren das Plasmid (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4 in Wildtyp (N2) Tiere bei 50 ng / ul mit den Co-Injektion unter Verwendung von Standard-Marker Keimbahn-Transformationstechniken 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / ul) und (p) odr-1 :: dsRed 10 (25 ng / ul). Die odr-1-Promotor-Laufwerke Ausdruck in der AWC und AWB amphid Neuron Paaren, und die OFM-1-Promotor-Laufwerke Ausdruck in den coelomocytes. </li><li> Betreff Die transgenen Tiere exprimieren die extrachromosomale Arrays in Schritt 1,2 bis Ultra Violet (UV) / trimethylpsoralen (TMP) Integration-Protokoll detailliert11. </li><li> Bleach synchronisiert die Tiere 12 und kultivieren sie auf Nematode Growth Media (NGM) Platten mit OP50 E. coli auf die L4-Stadium. Waschen L4 Tiere von NGM-Platten mit M9 Puffer OP50 E. entfernen coli-Bakterien. </li><li> Entfernen M9-Puffer und fügen 50-100 ul von 30 ug / ml TMP arbeitet Lösung auf dem Wurm Pellet in der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wickeln Sie den 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in Folie Umgebungslicht blockieren und leicht bewegen auf einem Rotator für 15 min in der Folie verpackte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Übertragen Sie die Würmer in der TMP / Wurm-Lösung zu einem großen ungesetzte NGM Platte. </li><li> Setzen Sie die Würmer auf dem NGM Platte UV 350 uJ (X100) mit einem Stratalinker 2400. Dann fügen Würmern zu einem OP50 mit NGM Platte und inkubieren im Dunkeln für 5 Std. </li><li> Pick-50 transgenen Würmer etwa 10 gesetzten Platten (2-5 Würmern jede Platte). Transfer P0 ist auf neue Platten alle 24 Stunden für 3 Tage. </li><li> Pick-250 klonale F1 einnimals (1 Tier pro Platte). Klonen von 2-4 F2 Tiere aus jeder F1 Platte. Prüfen F3 Tiere für eine 100% Übertragungsleitung durch suchen (p) ofm-1 :: GFP Expressionsmuster unter einem Präpariermikroskop Fluoreszenzmikroskop aussehen. </li><li> Outcross die endgültige integrierte Linie (n) mit Wildtyp N2 Tieren 5 mal. Wir werden auf die endgültige integrierte Linie als pyIs500 beziehen, und die GFP-markierten EGL-4-Molekül als GFP :: EGL-4. </li></ol> 2. Anbau und Pflege der Tiere für nukleare Translokation Assays <ol><li> Kultivieren die pyIs500 Tieren bei 25 ° C auf Standard 10 cm NGM-Platten (siehe unten für Rezept) seeded mit OP50 E. coli-Bakterien 13 (Abbildung 1). </li><li> Am Tag 1, Pick vier vor fünf L4 pyIs500 Tiere aus Platten bei 25 ° C kultiviert auf fünf separaten 10 cm OP50 E. coli ausgesät Platten und Inkubation bei 25 ° C (dh 4-5 L4 Tieren pro Platte). </li><li> Am Tag 4, waschen erwachsenen populations der pyIs500 Tieren abseits der großen NGM-Platten mit S-Basal-Puffer (siehe unten Rezept). Verwenden Sie Einweg-Glas-Pipetten auf Tiere zu übertragen, da sie an der Seite des Kunststoff-Pipettenspitzen haften. </li></ol> 3. Langfristige Geruch Induced Nuclear Translokation Assays <ol><li> Waschen Sie die pyIs500 Tieren 3 mal in S-Basal, um Bakterien zu entfernen. Nicht zentrifugieren Tiere zwischen Wäschen, sondern dass die Tiere durch die Schwerkraft in einer stationären 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen begleichen. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass alle Bakterien entfernt wird, und dass die NGM Pasteten sind frei von Verunreinigungen, wie Restbakterien wird sich negativ auf das Ergebnis der Translokation Assay. Außerdem haben wir gefunden, dass die Autoklavierung 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen erzeugt einen &quot;sticky&quot;-Eigenschaft auf die Innenwände der Röhre, die Tiere bewirkt, dass an den Seiten haften und so verwenden nicht-autoklavierter 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Während Tiere zwischen Wäschen Abwicklung, Make-up tEr Adaption Lösung. 100 ml S-Basal-Puffer in einem 100 ml Zylinder graduiert. Hinzufügen Anpassung Geruch an die S-Basal und Abdichtung des Zylinders mit einem Streifen Parafilm. Bei Durchführung Benzaldehyd Anpassung hinzuzufügen 7,5 ul von Benzaldehyd in 100 ml S-Basal für Butanon Adaption fügen 11 ul von 2-butaone zu 100 ml S-Basal. Vorsichtig umdrehen (nicht schütteln) die Abschluss Zylinder mit S-Basal und Geruch 30 Mal um eine gleichmäßige Emulsion zu schaffen. </li><li> Nach dem letzten Waschen in S-Basal, damit die Tiere sich niederzulassen und entfernen Sie alle Flüssigkeit. Label ein tube &quot;+ ve&quot; oder &quot;Anpassung&quot; und das andere Rohr &quot;-ve&quot; oder &quot;unadapt&quot;. Dann fügen Sie 1 ml der Anpassung Mix der Anpassung Mikrozentrifugenröhrchen (+ ve) und 1 ml S-Basal der unangepassten Kontrolle Mikrozentrifugenröhrchen (-ve). Versuchen, die Anzahl der Tiere zwischen 100 und 200 in jeder Röhre zu halten. Mit einigen der Praxis ist es möglich, den ungefähren Anzahl von Tieren in einem Pellet schätzen, indem Auge. </li><li> Legen Sie eine 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen cap protectorZu jedem Röhrchen (verhindert Deckel aus knallen offen) und platzieren Sie die Rohre auf einem Rotator für 80 min. Wir haben festgestellt, dass Geruch Belichtung zwischen 60 min und 80 min zu ähnlichen Ergebnissen (sowohl aufgrund der langfristigen Anpassungsmaßnahmen) ergibt. Allerdings bietet 80 min Exposition konsistentere Ergebnisse in unseren Händen. So sind alle unsere langfristige Anpassung Assays standardisiert sind durch die Verwendung eines 80 min Geruch Exposition (Abbildung 2). </li><li> Nach 80 min, waschen Tieren 3 mal in S-Basal. Damit sich die Tiere durch die Schwerkraft zwischen jedem Waschgang zu begleichen. </li></ol> 4. Kurzfristige Odor-induzierten nukleären Translokation von Assays <ol><li> Im Falle von kurzfristigen Geruch Anpassung, das gleiche Protokoll nach langfristigen geruchs-induzierte Translokation Assays (Schritte 3.1-3.4), jedoch anstelle der Inkubation der pyIs500 Tieren bei der Anpassung Geruch für 80 min, verwenden Sie eine Exposition von 30 Minuten . Die Quantifizierung von Geruchs-induzierte Kerntranslokation unten beschriebenen Assays (Schritt 5) die gleiche ist für eine langfristige und kurzfristige term Expositionen. </li></ol> 5. Scoring der Geruch-induzierten nukleären Translokation Ereignis <ol><li> Make 2% Agarose Pads enthaltend 5 mM Natriumazid (NaN 3) durch Lösen Agarose-Gelelektrophorese in dH 2 0. Legen Sie eine einzelne Tropfen geschmolzenen Agarose mit NaN 3 auf einem Glasobjektträger. Unmittelbar legen Sie ein weiteres Glasobjektträger auf der ersten Folie, um die Tropfen geschmolzenen Agarose glätten. Hinterlegen für 30 sec, und dann sanft necken abgesehen die Objektträger Ausfahrt aus einer Mikroskop-Objektträger mit einer flachen Agarose Pad von ~ 1 mm. </li><li> Nach dem letzten Waschen in S-Basal, damit die Würmer in der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen niederlassen und entfernen Sie alle Flüssigkeit. Dann fügen Sie die Tiere tropfenweise auf die Agarose Pads von mehreren Objektträgern. Es ist wichtig, die Anzahl der Tiere pro Folie zwischen 50 und 100 halten. Zu viele Tiere pro Folie wird komplizierter Scoring und oft eine Streuung glow nach Blaulicht-Anregung. Überschüssige Flüssigkeit kannböse sein aus der Agarose-Pad mit einem kleinen Kim-wischen. Legen Sie eine 0,5 mm Glas Deckglas auf dem Pad und stehen lassen für 2 min für die NaN 3 zu ermöglichen, um die Tiere zu fixieren. Beachten Sie, können Tiere aus den Folien nach Scoring wiederhergestellt werden. Die Tiere werden aus dem NaN 3 Anästhesie nach ~ 1 Stunde wiederherstellen, wenn ein seeded NGM Platte in einem Tropfen M9 Puffer übertragen. </li><li> An dieser Stelle ist es zwingend erforderlich, dass jeder Experimentator eine Schlüsselrolle zu verfolgen, welche Rutsche die experimentelle (+ ve) Folie ist und die Folie ist die Steuerung (-ve) slide entwickeln, und übergeben Sie die Folien an eine andere Person, die blind punkten wird die GFP: EGL-4 Lokalisation Muster. Dies wird für jede Experimentator Vorspannung zu steuern. </li><li> Bewertung zwischen 50 und 100 Tieren pro Folie unter Verwendung eines aufrechten Fluoreszenzmikroskop mit 10X, 40X und 63X vergrößernden Objektiven und GFP / RFP Filter. Erstens, suchen Tiere unter 10X Vergrößerung mit Hellfeldbeleuchtung. Zweitens, suchen Sie die AWC Neuron durch Ausschalten des bright-Beleuchtung und mit dem RFP-Filter. Die (p) odr-1 :: dsRed Laufwerken Ausdruck in AWB und AWC Neuronen. Die AWC Neuronen haben ausgeprägte ovale Zellkörper wie mit AWB Zellkörpern, die kleiner und kreisförmig sind (Abbildung 2). </li><li> Sobald die AWC Zellkörper gefunden wurde, dem GFP-Filter einschalten und notieren Sie die Lokalisierung von GFP: EGL-4 als Kern-oder zytoplasmatisch. Verwendung eines Zählers kann der Experimentator zu halten suchen in das Okular während Scoring die Folie. Anmerkung: Schritte 5,1-5,5 sind mindestens 3-mal auf verschiedenen Tagen wiederholt, um statistisch signifikante Daten (Fig. 1-2) zu erzeugen. </li></ol> 6. Die Überwachung EGL-4 während der Erholung von Langzeit-Geruch Anpassung GFP-markierten <ol><li> Nach Schritt 3,5, teilen die Bevölkerung pyIs500 Tieren in mehrere Aliquots und Gäste für nukleare gegenüber zytoplasmatische GFP :: EGL-4 in der AWC zum Zeitpunkt Null (dh nach 80 min Exposition) und multiple nachfolgenden Zeitpunkten (Abbildung 3). </li><li> Übertragen sowohl die Steuerung (-ve) und experimentelle (+ ve) Tieren mit Einweg-Glas-Pipetten auf NGM-Platten. </li><li> Damit sich die Tiere für verschiedene Zeitspannen erholen und erneut zu prüfen, die Lokalisierung von GFP :: EGL-4in AWC zu jedem Zeitpunkt wie in den Schritten von 5,1 bis 5,5. </li></ol> 7. Materialien NGM-Platten:; 3 g Natriumchlorid (NaCl), 2,5 g Bacto-Pepton 21 g Bacto-Agar: Für 1 L 1 L ddH 2 0 hinzuzufügen. Autoclave Media. Nach dem Autoklavieren, kühlen den Agar, bis die Temperatur liest 54 ° C. Fügen Sie die folgenden Lösungen: 25 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer, 1 ml 1 M Magnesiumsulfat (MgSO 4), 1 ml 1 M Calciumchlorid (CaCl 2), 1 ml Cholesterin in Ethanol (5 mg / ml Stammlösung). 1 M Dibasic K 2 HPO 4 174,2 g / mol: Für 500 ml: In 400 ml ddH 2 O löst man 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Lautstärke auf 500 L mit ddH 2 O. Filtern sterilisieren mit einem 500 ml Sterile Filter Unit. 1 M Einbasisches KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Für 1 L: In 800 ml ddH 2 O löst 136,1 g Einbasisches KH 2 PO 4. Lautstärke auf 1 l mit ddH 2 O. Filtern sterilisieren mit einem 500 ml Sterile Filter Unit. 1 M Kaliumphosphat (K 3 PO 4) Puffer pH 6,0: Für 1 L: In einem 1 L Sterile Filter Unit, fügen Sie 868 ml von 1 M Einbasisches KH 2 PO 4. Lassen Sie das Gerät filtern durch, dann fügen Sie 132 ml von 1 M Dibasic K 2 HPO 4. Lassen Sie das Gerät, um alle Flüssigkeit zu filtern. Filter entfernen Gerät und pH-Wert auf 6,0. Lagerung bei Raumtemperatur. S-Basal: Für 1 L: 50 ml 1M K 3 PO 4-Puffer, pH ~ 6,0, und 20 ml 5M NaCl aq. Füllen auf 1 l mitddH 2 O. Autoklavieren Solution. M9: Für 1 L: 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O. Füllen auf 1 l mit ddH 2 0. Sterilisieren durch Autoklavieren.

<ol>
	<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803 (1995).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity,+discrimination,+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).</li><li>Bargmann, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Neuron. 74 (3), 515 (1993).</li><li>L'Etoile, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+regulates+olfactory+adaptation+in+C.+elegans.">The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans.</a> Neuron. 36, 1079-10 (2002).</li><li>Lee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+entry+of+a+cGMP-dependent+kinase+converts+transient+into+long-lasting+olfactory+adaptation.">Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation.</a> PNAS. 107 (13), 6016 (2010).</li><li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+AWC-mediated+olfactory+plasticity+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).</li><li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cGMP+levels+affect+the+localization+of+EGL-4+in+AWC+in+Caenorhabditis+elegans.">Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).</li><li>Mello, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).</li><li>Miyabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+members+of+a+divergent+nuclear+receptor+family+in+Caenorhabditis+elegans.">Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 215, 314 (1999).</li><li>L'Etoile, N. D., Bargmann, C. 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Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+C.+elegans+Dopamine+Neuron+Degeneration+Assay+for+the+Validation+of+Potential+Parkinson's+Disease+Genes.">Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes.</a> J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).</li><li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity:+Aplysia+and+the+hippocampus.">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Geruch nukleärer Eingabe eines GFP-markierten EGL-4-Molekül hier beschriebenen bietet eine robuste molekulare Auslesen der olfaktorischen Anpassung in C. elegans. Die Geruchs-induzierte nukleäre Translokation Assays sind einfach und erfordern nur ein paar Tage Vorbereitungszeit. Die pyIs500 Tier, das wir für diese Assays aufgebaut haben, drückt eine Markierung, die die AWC Neuron als auch als Ausdruck der GFP-markierten EGL-4-Protein leuchtet. So fühlen wir, dass ein Experimentator mit wenig ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> NGM-Platten </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fisher Chemical </td><td> S671-10 </td><td> NGM-Platten </td></tr><tr><td> Bacto Pepton </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> NGM-Platten </td></tr><tr><td> Kaliumphosphat Dibasic </td><td> Fisher Chemical </td><td> S375-500 </td><td> S-Basal-Puffer und NGM-Platten </td></tr><tr><td> Kalium monobasisches </td><td> Fisher Chemical </td><td> P285-500 </td><td> S-Basal-Puffer und NGM-Platten </td></tr><tr><td> Kimwipes - Small </td><td> Kimberly-Clark </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol 100% </td><td> Gold Shield ChemicalCo. </td><td> 43196-115 </td><td> Verdünnen Gerüche für Chemotaxis-Assays </td></tr><tr><td> Kalziumchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C8106-500G </td><td> NGM-Platten </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfat </td><td> MP Biomedicals </td><td> 150.136-500G </td><td> NGM-Platten </td></tr><tr><td> Natriumazid 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> ICN10289180 </td><td> Narkose </td></tr><tr><td> Agarose - UltraPure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> Agarose-Pads </td></tr><tr><td> Benzaldehyd </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1334-100G </td><td> AWC Geruch </td></tr><tr><td> Butanon, ACS Grade </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 360.473-500ML </td><td> AWC Geruch </td></tr><tr><td> Reaktionsgefäße - 1,5 ml Colored </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur Pipette Einweg Glas 5-3/4 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> UV-Integration </td></tr><tr><td> Filter Vacuum Bottle - 500 ml </td><td> Nalgene </td><td> 09-740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

a molecular readout of long-term olfactory adaptation in c. elegans

Während anhaltende Stimulation meisten sensorischen Neuronen wird ihre Reaktion durch eine Verringerung ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem Signal anzupassen. Die Anpassung Resonanz hilft Form Aufmerksamkeit und schützt die Zellen vor Reizüberflutung. Anpassung innerhalb des olfaktorischen Schaltung C. elegans wurde zuerst von Colbert und Bargmann 1,2 beschrieben. Hier haben die Autoren Parameter der olfaktorischen Adaption Paradigma, das sie verwendet, um einen genetischen Screen entwerfen zu isolieren Mutanten in ihrer Fähigkeit, an flüchtigen Gerüchen, erfasst durch den Amphid Flügel Zellen Typ C (AWC) sensorischen Neuronen anzupassen definiert. Wenn Wildtyp C. elegans Tiere werden zu einem attraktiven AWC-spürte Geruch 3 für 30 min ihre Reaktionsfähigkeit auf den Geruch wird anzupassen ausgesetzt und ignoriert dann die Anpassung Geruch in einem Chemotaxis Verhaltens Assay für ~ 1 Stunde. Wenn Wildtyp C. elegans Tiere werden zu einem attraktiven AWC-spürte Geruch für ~ 1 Stunde ausgesetzt werden sie dann ignorieren Sie die Anpassung Geruch in achemotaxis Verhaltens Assay für ~ 3 Std. Diese beiden Phasen der olfaktorischen Anpassung in C. elegans wurden als kurzfristige olfaktorische Adaption (induziert nach 30 min Geruch Belichtung) und langfristige olfaktorischen Adaption (induziert nach 60 min Geruch Exposition) beschrieben. Später von L&#39;Etoile et al. Arbeiten, freigelegt 4 ein Protein Kinase G (PKG) genannt EGL-4, die sowohl für die kurz-und langfristigen olfaktorische Anpassung AWC Neuronen benötigt wird. Die EGL-4-Protein enthält eine Kernlokalisierungssequenz, die zur langfristigen olfaktorischen Anpassungsmaßnahmen aber entbehrlich für kurzfristige olfaktorischen Adaption Reaktionen im AWC 4 ist. Durch die Kennzeichnung EGL-4 mit einem grün fluoreszierenden Protein, war es möglich, die Lokalisation von EGL-4 im AWC bei längerer Exposition Geruch zu visualisieren. Mit diesen vollständig funktionellen GFP-markierten EGL-4 (GFP :: EGL-4)-Molekül ist es uns gelungen, eine molekulare Auslesen langfristige olfaktorischen Adaption im AWC 5 zu entwickeln. Mit dieser molecular Auslesen der olfaktorischen Anpassung konnten wir sowohl vorwärts und rückwärts genetischen Screens durchführen, um mutierte Tiere, die defekte subzelluläre Lokalisation Muster der GFP :: EGL-4 weisen in der AWC 6,7 identifizieren. Hier beschreiben wir: 1) die Konstruktion von GFP :: EGL-4 Ausdruck Tieren; 2) das Protokoll für den Anbau von Tieren für die langfristige geruchs-induzierte nukleäre Translokation Assays, und 3) die Wertung der langfristigen geruchs-induzierte Kerntranslokation Event-und Recovery-(Re-Sensibilisierung) aus der nuklearen GFP :: EGL-4 Zustand.

Ein Beispiel für die Lokalisierung von GFP :: Muster EGL-4in der AWC vor und nach längerer Exposition Geruch ist in Abbildung 2 gezeigt. Vor verlängerte Geruch Belichtung GFP :: EGL-4 wird in das Cytosol der AWC (2B) lokalisiert, und nach 80 min Geruch Exposition GFP :: EGL-4 ist mit dem Kern der AWC (2D) lokalisiert. Auf der Verhaltensebene werden die Tiere mit zytosolischen GFP :: EGL-4 in AWC zu einer punktförmigen Quelle des Geruchs (- beachten Sie die Chemotaxi...

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A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Hier beschreiben wir eine molekulare Auslesen der langfristigen olfaktorische Anpassung<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. Die Protein Kinase G, EGL-4, ist für einen stabilen Anpassungsmaßnahmen im primären sensorischen Neuronen Paar genannt AWC. Bei längerem Geruch Exposition EGL-4 transloziert aus dem Cytosol an Kern der AWC.

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

10.7K Aufrufe.  George Washington University. Hier beschreiben wir eine molekulare Auslesen der langfristigen olfaktorische Anpassung Caenorhabditis elegans. Die Protein Kinase G, EGL-4, ist für einen stabilen Anpassungsmaßnahmen im primären sensorischen Neuronen Paar genannt AWC. Bei längerem Geruch Exposition EGL-4 transloziert aus dem Cytosol an Kern der AWC.

Serie: A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Positive Butanone Learning, kurzfristige und langfristige Assoziative Speicher Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em&gt; C elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Langfristige Verhaltens Verfolgung von Frei Schwimmen Schwach elektrische Fische

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

Automatische Analyse von<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Verhalten mit CELEST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Quadruple Immunfärbung der olfaktorischen Glühbirne zur Visualisierung von olfaktorischen sensorischen Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

Verwenden einen angepasste mikrofluidischen olfaktorische Chip für die Bildgebung neuronaler Aktivität als Reaktion auf Pheromone in männlichen C. Elegans Kopf Neuronen

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in

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