Die Arbeit in den Hammarlund Labor wird gefördert durch: NIH gewährt R01 NS066082-01 und T32GM007223, die Beckman-Stiftung, und der Ellison Medical Foundation.

1. Zusammenbau des Systems Die spezifischen Komponenten unseres Systems sind unten aufgeführt. Wenn sie richtig montiert, sollte der Benutzer in der Lage sein, das Mikroskop mit einer Hand zu konzentrieren, bewegen sich die Bühne mit den anderen (entweder mit der Maus oder dem Joystick), aktivieren Sie den Laser mit dem Fußpedal, und haben eine klare Sicht auf die on- Bild ein. <ol><li> MicroPoint Laser montiert, um die Epi-Fluoreszenz-Port eines zusammengesetzten Mikroskop. Wir verwenden eine Nikon 80i, aber keine Forschung-grade aufrecht oder invertiert Umfang funktionieren sollte. Die MicroPoint System wird eine eigene dichroitische, die den Fluorophor, dass die Zellen, die Sie möchten Etiketten passen sollten. Cutting-Zellen mit alternativen Fluorophoren markiert erfordert zusätzliche dichroics. Zusätzlich ist ein Impulsgeber und Fußpedal mit dem MicroPoint System kommen. </li><li> 100x, 1,4 NA Öl-Objektiv für die Durchführung von Operationen und die Beurteilung Regeneration, plus zusätzliche Ziele wie nötig für die Lokalisierung der Probe auf dem Objektträger. Wir verwenden eine Nikon Plan Apo VC für Chirurgie, und feststellen, dass ein 4-fach nützlich ist für die grobe Fokussierung und der Suche nach der Probe. </li><li> Motorisierte Bühne mit Joystick. Eine Bühne mit extrem hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit ist überflüssig, da die Bühne ist nur für die Ausrichtung verwendet. Wir verwenden eine Vor OptiScan II (siehe Diskussion). </li><li> Camera. Die Kamera muss eine Frame-Rate aus, um Fokus und Ziel der markierten Neuriten mit den 100x-Objektiv, bei der Visualisierung des Bildes auf dem Computer zu überwachen. Wir bevorzugen Abschwächung des Beleuchtungslicht während der Axotomie Verfahren, um mögliche Verwechslung Effekte aus Foto-Entfärben oder Schäden (siehe 1.7 unten) zu vermeiden. So muss die Kamera empfindlich genug sein, um diese reduzierte Lichtmenge aufnehmen. Wir verwenden eine Hamamatsu Orca 05G, und finden, dass die Bildgebung bei 16,3 Hz ist ausreichend. Equivalent-Kameras ersetzt werden könnten. </li><li> Computer, Monitor und Imaging-Software, dass die Kamera fahren kann. Darüber hinaus verwenden wir die Imaging-Software, um den motorisierten Bühne mit einer Maus zu manipulieren (siehe Diskussion). </li><li> Air Tisch. Diese Anforderung kann je nach Standort variieren, aber seit der Operation mit einem 100x Objektiv durchgeführt wird, finden wir Schwingungsisolierung wesentlich zu sein. </li><li> Leichte Versorgung mit Lichtleiter und Verschluss-Mechanismus für die Beleuchtung des Fluorophors. Der Lichtleiter wird dem MicroPoint befestigen. Der Verschlussmechanismus ist nützlich, um die Beleuchtungsstärke unabhängig von der Laser reduzieren. Wir verwenden eine Vor Lumen 200 oder einer Leica EL6000 und dämpfen bis zu 80% der gesamten Lichtintensität für Axotomie. </li></ol> 2. Laser-Setup Ein detailliertes Protokoll zunächst koordiniert und gebündelt wird der Laser mit dem MicroPoint Lasersystem zur Verfügung gestellt. Wir gehen davon aus, dass dieses Verfahren eingehalten wurde erfolgreich beim ersten Setup gefolgt. Dazu gehören die Ausrichtung der Laser mit dem Fadenkreuz im Okular. Hier bieten wir ein Protokoll für die regelmäßige Wartung der Laserfokus und Intensität. Wie in der MicroPoint manuelle erwähnt, ist die gepulste Stickstoff-Laser in der Lage schweren Schaden für das menschliche Auge. Es sollte darauf geachtet, niemals direkt in den Laserstrahl werden. Einmal installiert, sollte das Sperrfilter sicher Block-Strahlung durch die Okulare. Cutting Neuronen in einem Organismus von der Größe eines Sandkorn kann schwierig sein. Da der Bereich der Schäden, die durch den Laser getan ist sehr klein, ist es unerlässlich, die dreidimensionale Position des Laserfokus zu kennen, um die Probe exakt Ziel. Der Laserfokus wird mithilfe der gespiegelten gleiten. Zunächst testen wir, dass die z Position des Laserfokus im Fokus der Bildgebung Weg entspricht. Als nächstes wird der xy Ort des Schadens Fokus mit Fadenkreuz in der Imaging-Software markiert. Focusing in der z-Ebene <ol><li> Drücken Sie den Graufilter ND16 (Abbildung 1a). Wir verwenden Neutralfilter in der Epi-Illumination Pfad zu dem Laser zu dämpfen und gleichzeitig einen Schwerpunkt. Für noch feinere Fokussierung, drücken sowohl in der ND16 und ND4 fluoreszierenden Filter. </li><li> Stellen Sie die MicroPoint Laser 1 Impuls mit dem Schalter drehte sich zu &#39;Select&#39; (Abbildung 1b), und bewegen Sie dann den Filter Rad, um die entsprechenden langen Bypass-Sperrfilter (Abbildung 1c). </li><li> Legen Sie die gespiegelte Bild auf der Bühne und konzentrieren sich auf Nadelstiche in ihm mit dem 4X Ziel Durchlicht. </li><li> Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das gespiegelte Bild und eine Neuausrichtung auf Nadelstiche mit dem 100X Objektiv. Öffnen Sie den Verschluss der Kamera mit dem Strahlengang Schalthebel (Abbildung 1d) und der Laser Shutter (Abbildung 1e). Wenn nötig, transmittierten Lichtintensität, so dass die Kanten der Löcher gestochen werden: dies wird in der Fokussierung genau zu helfen. </li><li> Drücken Sie das Fußpedal. Dabei sollte sich ein kleines Loch in den Spiegel, wenn der Laser richtig fokussiert ist. </li><li> Fokus des Mikroskops etwas oberhalb der Ebene der gespiegelten Bild und schießen den Laser wieder. Dies sollte eine noch kleinereLoch als der erste Schuss, oder lassen Sie keine Marke überhaupt. Wiederholen Sie die durch die Konzentration unterhalb der verspiegelten Folie. </li><li> Wenn ein Loch ist nicht in 2.5 produziert, oder wenn ein größeres Loch entsteht, wenn die sich oberhalb oder unterhalb der Oberfläche des Spiegels, Neuausrichtung der Laser mit der Fokus-Ring auf der Ablation Kopf. Stellen Sie sicher, dass das Loch noch richtig mit dem Fadenkreuz im Okular ausgerichtet. Bei konsequenter Nutzung der z-Ebene konzentrieren selten angepasst werden muss. </li></ol> Focusing in der xy-Ebene <ol start="8"><li> Folgen Sie den Schritten bis 2.3 über 2,1, und drücken Sie das Fußpedal, um ein kleines Loch in den Spiegel gleiten zu machen. </li><li> Initiate &#39;Live&#39; Capture-Modus aus den Elementen &#39;Acquire&#39; Menü. In der &quot;Measure&quot;-Symbolleiste wählen Sie &quot;ROI-Editor&quot;, und wählen Sie dann den &#39;double cross &quot;-Werkzeug und ziehen Sie das Fadenkreuz, um sie mit dem Zentrum der neuen Loch ausrichten. Klicken Sie auf &quot;Save ROI&quot; und dann &quot;Exit-Editor &#39;und wieder Live-Capture-Modus. </li><li> Aktivieren Sie die &quot;Maus XY&quot;-Einstellung in Elemente auf der Bühne mit der Maus zu manipulieren. </li><li> Ziehen Sie den Graufilter (s) wieder in die ursprüngliche Position (en), stellen Sie den Laserpulsen bis 10, und entfernen Sie das gespiegelte Bild. </li></ol> Einstellen der Leistung des Lasers <ol start="12"><li> Die Leistung des Lasers sollte auf ein Minimum Kraft notwendig, um das Neuron Ihrer Wahl geschnitten eingestellt werden. Stellen Sie die Macht, indem Sie die Dämpfungsplatte (Abbildung 1f) während des Schneidens lebenden Würmer (wie unten beschrieben). Wenn die Laserleistung zu hoch ist, kommt es zu peripheren Schäden oder Explosion ein Loch in den Wurm. Wenn die Laserleistung zu gering ist, wird es nicht sever des Neurons. Sobald das System eingerichtet wurde, die Stellung der Eichleitung nur selten geändert werden muss. Wenn der Laser wird schwach, und die Dämpfungsplatte muss bewegt werden, um weiter schneiden, könnte dies ein Zeichen, dass der Farbstoff in der Farbstoff-Zelle zu ersetzen (siehe Diskussion) werden muss. </li></ol> 3. Immobilisierung der Würmer <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung von 3% geschmolzene Agarose in M9 (22mm KH2PO4, 42mm Na2HPO4, 85mm NaCl, 1 mM MgSO4). Dispense 5 ml geschmolzene Agarose in ein 15 ml Falcon Röhrchen. Füllen Sie ein anderes Rohr mit Wasser. Die Röhrchen in ein modulares Heizelement bis 55 ° C eingestellt Füllen Sie das Heizelement mit Wasser zu mini Wasserbäder für jedes Röhrchen zu schaffen. Hinweis: Agarose in großen Mengen auf Vorrat hergestellt werden und für die nachfolgenden Experimente wieder eingeschmolzen. </li><li> Legen Sie zwei Schichten der Etikettierung Band auf jedem der beiden Rutschen und einen sauberen Objektträger zwischen diesen Folien. Dispense einem Rückgang von Agarose mit einem Kunststoff-Glühbirne Pipette auf die Mitte des sauberen Objektträger und legen Sie eine andere Folie senkrecht zur ersten, so dass die resultierende Agarose-Pad die Dicke von zwei Stücken des Bandes (Abbildung 2). Entfernen Sie eine der beiden Folien aus dem Pad nach 30 Sekunden. Spülen und speichern Sie die Kunststoff-Pipette in die mit Wasser gefüllten Falcon-Röhrchen für die Verwendung mit nachfolgenden Folien. </li><li> Als nächstes legen Sie 3-5 ul von 0,10 um oder 0,05 um Polystyrol-Kügelchen in der Mitte des Pads. Add 5-10 Würmer Ausdruck fluoreszierendes Protein in den Nervenzellen des Interesses. Wenn die Neuronen von Interesse asymmetrisch auf der rechten oder linken Seite des Wurms verbreitet sind, verwenden Sie eine Platin holen, um Würmer, so dass die richtige Seite nach oben drehen. Worms muss auf Folien innerhalb von 10 Minuten Vorbereitung der Agarose-Pads gelegt werden. </li><li> Vorsichtig ein Deckglas auf die Würmer. Nach dem Aufsetzen des Deckglases, bewegen Sie es nicht in Bezug auf die Agarose-Pad, da dies die Nagelhaut zu stören und zerstören die Würmer. Legen Sie die vorbereiteten Objektträger unter dem Mikroskop Bühne. </li></ol> 4. Cut Neuronen <ol><li> Direktes Licht in die Okulare mit dem Strahlengang Schalthebel. Konzentrieren Sie sich auf den Wurm mit dem 4X Ziel geschnitten werden, einen Tropfen Öl auf das Deckglas, und wechseln Sie in den 100X Objektiv. Bringen Sie den Strahlengang der Kamera. </li><li> Benutzen Sie die Maus auf das Neuron Ihrer Wahl unter der Mitte des Fadenkreuzes zu bewegen. Drücken Sie das Fußpedal an den Laser Feuer und durchtrennen die neuronalen Prozess. Bei Bedarf können zwei Gruppen von Impulsen verwendet werden, um das Neuron zu trennen sein. Zunächst ist es hilfreich, genau zu verfolgen, die Neuronen in den einzelnen Würmer wurden durchtrennt, um spätere Regeneration zu beurteilen. Wenn richtig ausgeführt, produziert Laser Axotomie eine kleine Pause in das Neuron, ohne nennenswerte Schäden an den umliegenden Hautgewebe oder anderen Neuronen (siehe Abbildung 3). In bestimmten Fällen kann eine kleine Narbe um den Ort der Verletzung zu bilden. </li><li> Recover die Würmer durch das Entfernen der Deckgläschen in einer direkten Aufwärtsbewegung, wobei darauf geachtet, dass die Würmer auf dem Agarose-Pad bleiben. Nicht rutschen dem Deckglas ab. Dann schneiden Sie das Pad um die Würmer mit Nadel-Nase-Zangen und platzieren Sie den Abschnitt Agarose auf einem frisch ausgesäten NGM-Platte mit OP50 8. Platz 10 &amp;mgr; l sterilem M9 auf dem Pad, um die Würmer aus den Kügelchen frei und entfernen Agarose. </li></ol> 5. Ergebnis Neuronen für die Regeneration <ol><li> Bereiten Agarose-Pad wie in Schritt 2.2 beschrieben. </li><li> Legen Sie Würmer in 3-5 &amp;mu; L von Polystyrol-Kügelchen. Deckglas auflegen. Slides können nacheinander hergestellt werden, oder alternativ alle Würmer können im Voraus und die Folien in 10 cm Kulturschalen mit jeweils einem feuchten Kimwipe die Agarose feucht zu halten gehalten vorbereitet werden. </li><li> Verwenden Sie den 100X Ziel, den abgetrennten Neuronen zu visualisieren. In vielen Neuronen, wird ein neuronales Stumpf distal der Schnitt vor Ort bleiben. Wir nutzen die Anwesenheit von diesem Rest als Indiz dafür, dass das Neuron in der Tat war durchtrennt (Abb. 4). Das Vorhandensein dieser Stumpf macht es möglich, ein Neuron, das abgeschnitten wurde und von einem, der nicht geschnitten wurde regeneriert unterscheiden. Hinweis: Sowohl die distalen und proximalen Stümpfe zunächst nach dem Schneiden zurückzuziehen. </li><li> Beurteilen Regeneration. Eine Vielzahl von Parametern bestimmt werden kann. Eine einfache Test, ob die verletzten Neuron hat ein Wachstum Kegel (Abb. 4a) gebildet und regeneriert, oder nicht (Abbildung 4b). Alternativ können Neuritenlänge verfolgt und verglichen werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Als Beispiel beschreiben wir Charakterisierung der Regeneration der γ-Aminobuttersäure (GABA) Motoneuronen. Diese Neuronen, die im Bauchmark wohnen und zu erweitern Prozesse umfänglich an der dorsalen Nervenstrang, sind für die ordnungsgemäße Fortbewegung 9 essentiellen. GABA Neuronen sichtbar gemacht werden durch die Expression einer genetisch kodierten Fluorophor, wie grün fluoreszierende Protein (GFP), die unter der Kontrolle des unc -47 oder -25 unc Promotoren (Stämme EG1285 und CZ1200 jeweils zur Verfügung aus dem C. elegans Genetic-Center ). Berg L4-Stadium Würmer wie beschrieben, drehen Sie den Würmern so die GABA Neuronen auf ihr Recht zugewandten Seiten sind oben, und legen Sie das Deckglas. Cut 1-3 von der hinteren Kommissuren in jeder Wurm, der Mitte zwischen den dorsalen und ventralen Seile. Vermeiden Sie Schnitte Kommissuren, dass Quer-oder fasciculate mit anderen Kommissuren, da diese schwer zu später Partitur. Recover Würmer wie beschrieben. 18 bis 24 Stunden nach einer erfolgreichen Axotomie werden die Würmer von der Operation erholt haben und weisen eine normale Bewegungsapparates und Eiablage Verhaltensweisen. Discard Würmer, die tot oder krank sind. Montieren Sie den Rest, wie beschrieben, und zu bewerten Regeneration. Wir in der Regel sollen mindestens 30 geschnitten Neuronen pro experimentellen Bedingungen zu beurteilen. In oxIs12 Tiere, wird in der Regel 60-70% der abgetrennten L4 GABA Neuronen ein Wachstum Kegel-Struktur, durch eine Verbreiterung der Membran an der Spitze und die Verlängerung von mehreren Neuriten Filialen, und wanderten aus dem Schnitt Website (Abbildung 4a) bewiesen initiiert haben. In vielen Fällen wird das Wachstum Kegel migriert mit dem dorsalen Nervenstrang, eine benachbarte neuronale Kommissur oder den distalen Stumpf wieder haben. Die restlichen 30% der Neuronen entweder initiiert haben kein Wachstum, bilden einen Baumstumpf proximal an den Ort der Axotomie oder verlängert nur kleine Filopodien (Abbildung 4b) haben. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Die UV gepulsten Laser Axotomie System. Spezifische Komponenten sind: (a) ND-Filter (b) Puls-Selektor (c) Filterrad Hebel (d) Strahlengang Schalthebel (e) Laser Shutter und (f) Dämpfungsplatte. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Vorbereiten einer Agarose-Pad. Zur Herstellung eines Agarose-Pad in der gewünschten Dicke, zwei Lagen Klebeband (grün) sind auf zwei Folien gelegt. Eine Folie wird zwischen den ersten beiden gelegt, und ein Tropfen Agarose wird dann an die saubere Folie hinzugefügt. Schließlich wird eine vierte Folie senkrecht zu den ersten drei platziert, was zu einem Pad, das die Dicke von zwei Stücken des Bandes. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Vertreter GABA Neuron axotomies. In einem typischen Experiment werden GABA Neuron Kommissuren in der Mitte der lateralen Seite des Wurms durchtrennt. Eine abgetrennte Kommissur wird unmittelbar vor (links) und nach (rechts) Axotomie gezeigt. Alle Bilder wurden mit einer 100X Öl-Objektiv aufgenommen. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse der GABA Neuron axotomies. 24 Stunden post-Axotomie abgetrennten Axone sind für die Regeneration erzielt. Ein regenerierenden Axone mit einem Wachstum Kegel (Pfeil) ist in (a), während ein nicht-regenerierenden Axone als proximalen Stumpf (Pfeil) in (b) zu sehen sind. Der distale Stumpf jedem Schnitt Axon ist in jedem Panel (Pfeilspitze) gezeigt und ist ein Indiz dafür, dass das Axon wurde durchtrennt.

<ol>
	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase.">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branchi+ng.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branchi ng.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Yan, D., Wu, Z., Chisholm, A. D., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DLK-1+Kinase+Promotes+mRNA+Stability+and+Local+Translation+in+C.+elegans+Synapses+and+Axon+Regeneration.">The DLK-1 Kinase Promotes mRNA Stability and Local Translation in C. elegans Synapses and Axon Regeneration.</a> Cell. 138, 1005-1018 (2009).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+Functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: Functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Gabel, C. V., Antoine, F., Chuang, C., Samuel, A. D. T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nematode+Caenorhabditis+Elegans.">The Nematode Caenorhabditis Elegans.</a> , (1988).</li><li>McLntire, S. L., Jorgensen, E., Kaplan, J., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GABAergic+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">The GABAergic nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364, 337-341 (1993).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in.</a> C. elegans. Optics Express. 15, 8521-8531 (2007).</li><li>Chung, S., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies.">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Applied Physics A: Materials Science &#38; Processing. 96, 335-341 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature Protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wang, Z., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration.+Current+Opinion+in+Neurobiology.">Genetic dissection of axon regeneration. Current Opinion in Neurobiology.</a> , (2010).</li><li>Huang, X., Cheng, H. -. J., Tessier-Lavigne, M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAX-1,+a+Novel+PH/MyTH4/FERM+Domain+Cytoplasmic+Protein+Implicated+in+Netrin-Mediated+Axon+Repulsion.">MAX-1, a Novel PH/MyTH4/FERM Domain Cytoplasmic Protein Implicated in Netrin-Mediated Axon Repulsion.</a> Neuron. 34, 563-576 (2002).</li><li>McIntire, S. L., Reimer, R. J., Schuske, K., Edwards, R. H., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+vesicular+GABA+transporter.">Identification and characterization of the vesicular GABA transporter.</a> Nature. 389, 870-876 (1997).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser microsurgery in C. elegans in Methods in Cell Biology: Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , .</li><li>Guo, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5, 531-533 (2008).</li><li>Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+precision+on-chip+small-animal+immobilization,+multi-photon+imaging+and+femtosecond-laser+manipulation.">Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation.</a> Lab on a Chip. 8, 653-656 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+on-chip+high-throughput+whole-animal+sorting+and+screening+at+subcellular+resolution.">Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 13891-13895 (2007).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans.">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li><li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior,+nerve+regeneration,+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans.">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 561-567 (2009).</li><li>Samara, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+femtosecond+laser+neurosurgery+screen+reveals+small-molecule+enhancer+of+regeneration.">Large-scale in vivo femtosecond laser neurosurgery screen reveals small-molecule enhancer of regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).</li><li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery.">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> Journal of Experimental Zoology. 231, 45-56 (1984).</li><li>Sulston, J. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+cell+autonomy+during+postembryonic+development+of+Caenorhabditis+elegans.">Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 78, 577-597 (1980).</li><li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans.">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 87, 286-300 (1981).</li><li>Allen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans.">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Innate+Immune+Responses+to+Infection+and+Wounding+in+the+C.+elegans+Epidermis.">Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis.</a> Current biology. CB 18, 481-489 (2008).</li></ol>

Eine Vielzahl von Lasersystemen wurden verwendet, um Neuriten in C schneiden elegans, und mehrere Studien haben ihre Leistung im Detail 3,7,10,11 untersucht. Die MicroPoint Laser in unserem Protokoll ist ein schlüsselfertiges System, das einfach zu installieren und zu warten ist, und wird zu einem niedrigen Preis den Forschern im Vergleich zu einem Ti-Saphir-Laser-System zur Verfügung. Im Vergleich zu einem Ti-Saphir-System, jedoch ist die MicroPoint Laser erwartet, dass Schäden an einer größeren Fläche, die nachteilig für einige Anwendungen führen kann. Wenn ein Ti-Saphir-System gewünscht wird, ist ein hervorragendes Protokoll auf den Aufbau eines solchen Systems zur Verfügung 12. Das aktuelle Protokoll kann auf einer Vielzahl von Neuronen in C durchgeführt werden elegans, aber stellen wir fest, dass die Unterschiede in der regenerativen Fähigkeiten zwischen verschiedenen Typen von Neuronen 13 sind zu erwarten. Darüber hinaus können verschiedene transgene Hintergründe beeinflussen regenerative Erfolg. Obwohl der Prozentsatz der Regeneration GABA Neuronen ist ziemlich konstant zwischen verschiedenen transgenen Marker Stämme haben wir festgestellt, insgesamt einen leichten Anstieg der Regeneration in juIs76 14 vs oxIs12 15 Würmer. Die Unterschiede zwischen den Markierungen des Touch-Neuronen wurden auch 2 beschrieben. Wir bevorzugen es, die Würmer mit Mikroperlen als Anästhetika immobilisieren wie die Perlen in schneller und konsequenter Ruhigstellung 16 Resultat. Dies ist auch vorteilhaft, da wir in der Lage, um die Regeneration frei von möglichen Verwechslung Effekte durch Anästhesie 17 zu beobachten sind. Eine Alternative Anästhesie-freie Methode zur Immobilisierung ist die Verwendung von mikrofluidischen Bauteilen. Der Einsatz der Mikrofluidik für Axotomie wurde ausgiebig 17-22 beschrieben. Wir finden, dass mit konsequenten Einsatz der Laser funktioniert am besten, wenn das Cumarin in den Farbstoff-Zelle 440 geändert wird einmal pro Woche nach dem Eingriff in die MicroPoint Handbuch beschrieben ist. Falls erforderlich, kann die Dämpfung Schieberegler verwendet, um Macht zu erhöhen, aber dies kann ein Hinweis auf alte Farbstoff-oder Laser-Versatz werden. Außerdem hat der Farbstoff-Zelle eine begrenzte Lebensdauer und muss in absehbarer Zeit umgebaut oder ersetzt werden (siehe Fehlersuche). Es kann schwierig sein, das Ziel Neuriten unter dem Fadenkreuz, dass der Laserfokus markieren Manöver, vor allem wenn das Tier nicht vollständig gelähmt ist. Wir finden, dass eine manuelle Bühne nicht optimal ist für diesen Zweck, obwohl es sicherlich brauchbar ist. Ein Joystick-gesteuerte motorische Phase ist präziser, und wir finden, dass mit einer Software, Bild Ziehen mit der Maus, um den motorisierten Bühne bewegen unterstützt am besten ist. Nikon Elements bietet diese Funktion und wird in diesem Protokoll beschrieben, aber die freie Mikromanager Paket, sowie andere Imaging-Software, kann eine ähnliche Funktionalität haben. Eine andere Art von feinen Ausrichtung ist es, den Laserfokus zu verschieben, anstatt das Tier. Ein Galvanometer beam-Lenkung ist als Add-on auf die MicroPoint Laser, wenn dieser Ansatz wird bevorzugt. Neben ihrer Anwendung auf die Untersuchung der neuronalen Regeneration, kann der Laser benutzt, um andere Zelltypen, wie Haut-, Muskel-oder spezialisierte Zellen abzutragen oder zu stören spezifischen neuronalen Synapsen 23-27 sein. Darüber hinaus könnte Signalwege, die zur Degeneration von Nervenzellen, die Verletzung oder Krankheit begleitet regeln mit diesem System untersucht werden. Als solche wird die Verwendung von gepulsten Lasern weiter leuchten sowohl die genetischen Faktoren und die zellbiologische Veränderungen, die neuronale Regeneration und anderen relevanten Prozesse zu erleichtern vergossen. Fehlerbehebung: Hier beschrieben werden einige häufig auftretende Probleme und ihre Lösungen beschrieben. <ol type="a"><li> Der Laser schneidet nicht richtig. Dies ist wahrscheinlich, weil entweder der Laser außerhalb des Fokus (siehe Abschnitt 2) oder der Farbstoff in der Farbstoff-Zelle muss ersetzt (siehe MicroPoint Handbuch). Alternativ kann der Farbstoff-Zelle muss ersetzt oder neu aufgebaut werden. </li><li> Die Würmer sind auf Agarose-Pad bewegen. Dieser ist in der Regel ein Zeichen, dass die Agarose-Pad zu feucht ist. Wir finden, dass Pads für ca. 30 Sekunden verlassen werden, bevor Würmer auf sie gesetzt werden, um dieses Problem zu umgehen müssen. Sie können auch versuchen, den kleineren (0,05 um) Mikrokügelchen. </li><li> Die Rückgewinnung von Würmern ist schwierig und ineffizient. Dies kann durch falsche Deckglas Entfernung oder durch eine trockene Agarose Pad verursacht werden. Wenn das Pad zu trocken ist, können Sie feststellen, dass die Axone ein beaded Erscheinungsbild zu entwickeln. In einigen Fällen ist dies, weil die Würmer waren nicht auf dem Pad platziert bald, nachdem es gemacht wurde. Alternativ kann ein Altbestand von Agarose-Lösung haben eine mehr als 3% Konzentration nach wiederholtem Schmelzen. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> 0,05 um Polystyrol-Kügelchen </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 08691 </td><td></td></tr><tr><td> 0,10 um Polystyrol-Kügelchen </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose GPG / LE </td><td> Amerikanischen Bioanalytische </td><td> 00972 </td><td> Reinstwasser </td></tr><tr><td> Falcon 14 ml Polystyrol-Round-Röhrchen </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> 17 x 100 mm Stil, nicht pyrogen </td></tr><tr><td> Thermo Scientific Plain vorgereinigte Objektträger </td><td> Erie Scientific Company </td><td> 420-004T </td><td> 3 &quot;x 1&quot; x 1 mm </td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> VWR </td><td> 48366 205 </td><td> 18 mm x 18 mm Nr. 1 1 / 2 </td></tr><tr><td> KIMTECH Science Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 34155 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 100 x 15mm Stil Petrischale </td><td> BD Biosciences </td><td> 351029 </td><td></td></tr><tr><td> Band blank 3/4W x 500L </td><td> TimeMed </td><td> T-512 </td><td></td></tr><tr><td> Immersionsöl </td><td> Nikon </td><td></td><td> Typ A, nd = 1,515 </td></tr><tr><td> EG1285 oder CZ1200 </td><td> C. elegans Genetic-Center </td><td> http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ </td><td></td></tr><tr><td> OptiScan II </td><td> VOR Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS-Elements Ar oder Br </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MicroPoint Ablation Laser System </td><td> Photonic Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zusammengesetztes Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse-80i </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Kamera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> Modell C8484-05G01 </td><td></td></tr><tr><td> Dell Precision T3400 PC mit Intel Core 2 Duo </td><td> Dell </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Windows XP Professional </td><td></td><td> Microsoft </td><td> Version 2002, Series Pack 3 </td></tr><tr><td> Dual-Trockenbad Incubator </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Analog steuert </td></tr><tr><td> 4X Plan Fluor Ziel </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100X Plan Apo VC Öl-Objektiv </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 / 45 Pinzetten </td><td> Dumont </td><td> 11251-35 </td><td> Dumoxel Standard Tipps, können auch # 7 </td></tr><tr><td> Präpariermikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ800 </td><td> Mit NI-150 High Intensity Illuminator </td></tr></tbody></table>

in vivo laser axotomy in c. elegans

Neuronen mit anderen Zellen über Axone und Dendriten, schlank Membran-Erweiterungen, die prä-oder post-synaptischen Spezialisierungen enthalten kommunizieren. Wenn ein Neuron durch Verletzung oder Krankheit beschädigt wird, kann es zu regenerieren. Cell-inneren und äußeren Faktoren beeinflussen die Fähigkeit eines Neurons zu regenerieren und Restore-Funktion. Vor kurzem hat die Nematoden C. elegans wurde als ein hervorragendes Modell Organismus entstanden, um Gene zu identifizieren und Signalwege, die die Regeneration von Neuronen 1-6 beeinflussen. Die wichtigste Methode, um neuronale Regeneration in C. initiieren elegans ist die Laser-vermittelte Schneiden oder Axotomie. Während Axotomie, ist ein fluoreszenzmarkierten neuronalen Prozess abgetrennt mit Hochenergie-Impulsen. Zunächst neuronalen Regeneration in C. elegans wurde unter Verwendung eines verstärkten Femtosekunden-Laser 5. Allerdings haben anschließenden Regeneration Studien gezeigt, dass eine konventionelle gepulste Laser verwendet werden, um genau zu trennen Neuronen in vivo und rufen eine ähnliche regenerative Antwort 1,3,7 werden. Wir präsentieren ein Protokoll für die Durchführung von In-vivo-Laser Axotomie in der Wurm mit Hilfe eines MicroPoint gepulsten Lasers, ein schlüsselfertiges System, das leicht zugänglich ist und dass wurde in großem Umfang für gezielte Zellablation verwendet. Wir beschreiben die Ausrichtung der Laser-, Montage der Würmer, Schneiden bestimmten Neuronen und Beurteilung anschließende Regeneration. Das System bietet die Möglichkeit, eine große Zahl von Neuronen in mehreren Würmern während eines Experiments abgeschnitten. So ist die Laser-Axotomie wie hier beschrieben, ein effizientes System für die Initiierung und Analyse des Prozesses der Regeneration.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Laser Axotomy in C. elegans at JoVE.com

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Ein Protokoll, um Neuronen im Schnitt<em&gt; C. elegans</em&gt; Mit einem MicroPoint gepulster Laser vorgestellt. Wir beschreiben die Einrichtung des Systems, Immobilisierung Würmer und Durchtrennen markierten Neuronen. Vorteile sind ein relativ kostengünstiges System und die Fähigkeit, neuronale Prozesse oder abzutragen Zellen trennen<em&gt; In vivo</em&gt;.

In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

18.2K Aufrufe.  Yale University School of Medicine. Ein Protokoll, um Neuronen im Schnitt C. elegans Mit einem MicroPoint gepulster Laser vorgestellt. Wir beschreiben die Einrichtung des Systems, Immobilisierung Würmer und Durchtrennen markierten Neuronen. Vorteile sind ein relativ kostengünstiges System und die Fähigkeit, neuronale Prozesse oder abzutragen Zellen trennen In vivo.

Serie: In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em&gt; C elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Tracking und Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In-vivo-Imaging von Dauer-spezifische neuronale Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...