Name: automated analysis of c. elegans swim behavior using celest software
Uploaded: 2016-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software at JoVE.com

CELEST Entwicklung von NIH gewährt R21AG027513 und U01AG045864 unterstützt wurde. Daten und einige kurze Videodarstellungen sind aus Restif et al angepasst. (2014) 8, die unter der Creative Commons Namensnennung (CC BY) Lizenz veröffentlicht wurden http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Wir danken Ricardo Laranjeiro für Manuskript Hilfe.

1. Nematode Wachstum und Handhabung <ol><li> Wachsen C. elegans auf Standard - Petri - Platten , die NGM 1-3 mit OP50-1 Escherichia coli als Nahrungsquelle entdeckt. </li><li> Halten Kulturen in einem Inkubator, der die gewünschte Temperatur beibehält. C. elegans wächst gut 15 bis 25 ° C, mit 20 ° C die Standardwachstumstemperatur ist. HINWEIS: Schwimmen ist eine robuste Phänotyp, aber Kraft schwimmen kann durch Umweltfaktoren einschließlich Kontamination auf Platten und eine Überhitzung der Kulturen und Dias betroffen sein. Starke Anstrengungen stabilen Bedingungen zu halten gemacht werden sollte. </li><li> Verwenden Sie ein hausgemachtes Nematoden Pick aus einem Platindraht schmolzenen in einem Glasstab 4 Übertragung einzelner Tiere zu behandeln. </li></ol> 2. für Schwimmanalyse einrichten <ol><li> Verwenden Sie ein integriertes System bestehend aus einem Stereomikroskop, digitale CCD-Kamera und digitale Video-Recording-Software. Die CELEST Software can auf einem separaten Computer verwendet werden. <ol><li> Bedecken Sie das Mikroskop mit einem dunklen Tuch (zB Filz) Blendung in der Schwimmablegebereich auf dem Objektträger zu verhindern und die Bildqualität zu verbessern. </li><li> Stellen Sie den Arbeitsabstand des Mikroskops und Vergrößerung der vollen Ansicht der Schwimmbereich und den unteren Spiegel scharfem Kontrast der Tiere vor dem Hintergrund zu erhalten. Stellen Sie die Beleuchtung Dunkelfeld die Leichen der Erwachsenen als weiß vor dem schwarzen Hintergrund sichtbar zu machen, die sich sehr gut für Computational Visualisierung arbeitet und mit der Swim-Analyse-Tracking-Software. </li><li> Achten Sie darauf, den Arbeitsbereich zu halten, Objektträger und schwimmen fallen sehr sauber. Debris kann durch Verschließen der freien Schwimmen der Erwachsenen und dünnen Fäden der Faser mit der Analyse stören können Tiere wie nonmoving nachgewiesen werden während der Verfolgung. </li></ol></li></ol> 3. Tier Vorbereitung auf die Analyse der körperlichen Fitness in Liquid <ol><li> Pipette 60 ul of 1x M9-Puffer in einen 10-mm-Ring auf einem Mikroskop-Objektträger vorgedruckt. Stellen Sie sicher, dass der Tropfen vollständig den Innenbereich des Rings abdeckt. Die Software extrahiert mehr Schwimmen Informationen dieses Tropfengröße auf einer Folie enthalten sind unter Verwendung als es wäre, wenn Multiwell-Platten verwendet. </li><li> Wählen Sie einzelne erwachsene Nematoden und übertragen sie in den Tropfen 1x M9-Puffer, minimiert den Transport von Bakterien, die die Flüssigkeit trüben kann. Minimieren Bakterien, indem man zuerst auf eine Seite der Platte, die Tiere für die Übertragung platzieren, die nicht viel Bakterienrasen enthält, lassen sie kriechen, und sie dann sanft anheben. <ol><li> Wenn die Nematoden in den Tropfen zu übertragen, verwenden Sie ein Binokular nahe der Analysestation die Länge der Schwimmzeit zu reduzieren, was 25 das Verhalten der Tiere beeinflussen können. </li><li> Legen Sie nur 4 Erwachsene in der Drop, wenn sie oft heftig und kreuzen sich die Wege bewegen. Als Führung überlappende Schwimmer zu minimieren (die Computeranalyse confounds), sollten Sie platzieren4 Tiere pro Tropfen, wenn sie so aktiv wie junge, gesunde WT Erwachsene und 5 Tiere pro Tropfen, wenn sie älter sind und zeigen weniger Kraft. HINWEIS: Gesunde WT Nematoden beginnen instinktiv schwimmen bald nach in Flüssigkeit gelegt. Mit Hilfe eines Nematoden Pick, trennen Sie vorsichtig die Erwachsenen in der Tropfen, wenn sie verklumpen. </li></ol></li></ol> 4. Analyse der körperlichen Fitness in Liquid - Videoaufzeichnung von Schwimmen <ol><li> Positionieren Sie den Schlitten beladen mit Erwachsenen auf der Basis des Mikroskops ihre Schwimm aufzuzeichnen. 30 s Videos erfassen Details der individuellen Verhalten des Tieres in Flüssigkeit (Video 1), und die Entnahme von einer großen Anzahl solcher Aufzeichnungen erreicht wird leicht , wenn sie von CELEST Software 8,26 Aided; jedoch schwimmen längere Zeit für andere spezifische Verhaltensstudien können 25 ideal. Wichtig ist, stellen Sie sicher, die gleiche Vergrößerung in allen Aufnahmen, da Vergrößerung Unterschiede forderlich, haltent Schwimmen Analyse und spannt Vergleich. Hinweis: Diese Schritte werden als Anleitung zur Verfügung gestellt aufgelistet , die digitale Videoaufzeichnungssoftware in der Tabelle der Materialien; VirtualDub Open-Access-Software könnte ersetzen, obwohl wir nicht getestet haben. <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Einstellungen als Anleitung für eine erfolgreiche Schwimmanalyse: Bildgröße von 696 x 520 Pixel, Bildauflösung von 0,02 mm / Pixel und einer Rate von 18 Bildern / s. Versionen mit höherer Auflösung dieser Einstellungen erleichtern Tracking aber werden die Maßnahmen vom Programm berechnet nicht beeinflussen. HINWEIS: Die Schwimmzone durch die 60 &amp; mgr; l Tropfen 1x M9-Puffer auf dem Objektträger nicht viel Tiefe vorgesehen ist, die Bewegung nach oben und nach unten gerichtete Schwimm minimiert. </li></ol></li><li> Unter Einstellungen, gehen Sie auf &quot;Aufnahme&quot;, Set &#39;Limit Sequence Size&#39; auf &#39;545 Frames auf der Festplatte &quot;. Unter der gleichen Position, das Kontrollkästchen &quot;Use Recording Manager &#39;. Klicken Sie auf den &quot;Bearbeiten aktuellen recorSkript ding ... &#39;Taste, und unter &quot;Befehle&quot; die Option &quot;Grab Frame&#39; und unter &#39;Stoppbedingungen&quot;, geben Sie &quot;Stopp nach 0: 00: 30.00&quot;. </li><li> Zur Aufzeichnung wählen Sie &quot;Neue Sequenz im RAM&quot; unter der ursprünglichen Position, dann drücken Sie die rote &quot;Record&quot; Taste. Die Software wird 545 Frames über 30 s mit der Digitalkamera greifen und halten sie im RAM-Speicher. </li></ol> 5. Analyse der körperlichen Fitness in Liquid - Video-Behandlung <ol><li> Fragment, das das Video in eine Folge von Bildrahmen durch die nach Hause Schrift klicken und &quot;Export vollständige Sequenz zu ...&quot; im Video-Recording-Software auswählen. HINWEIS: Die digitale Videoaufzeichnungssoftware können die Rahmen als .bmp, .jpg, .tif oder .png speichern, von denen alle hier präsentiert von der Swim-Analyse-Programm gelesen werden. Beachten Sie, dass TIF-Dateien verwenden mehr Speicherplatz, aber einige Formate wie JPG kann die Bildqualität verschlechtern. </li><li> Starten Sie das Schwimmen Analyseprogramm von MATLAB by Klick auf die Schaltfläche Ausführen. </li><li> Auf dem Startbildschirm des Programms schwimmen Analyse, verwenden Sie die &quot;Hinzufügen einer Video &#39;oder Buttons&#39; mehrere Videos hinzufügen &#39;Sequenzen von Bild zu laden Rahmen ein zu einer Zeit oder in Gruppen, während relevante Labels wie Genotyp, Datum, Versuch und Dauer Anbringen . Die Software erstellt eine Datenbank der markierten Sequenzen. </li><li> Aktivieren Sie die gleichzeitige Verfolgung mehrerer Tiere in den hochgeladenen Sequenzen von 1 &#39;klicken. Prozess Videos &#39;. In dem neuen Bildschirm, wählen Sie die gewünschten Videos im linken Feld und klicken Sie auf &quot;zur Liste hinzufügen&quot;. Für jedes Video, klicken Sie auf seinen Namen in der oberen rechten Liste das erste Bild des Videos in der rechten unteren Ecke angezeigt werden soll. Abgrenzen die Schwimmzone um 3 Punkte innerhalb des Rings auszuwählen und initiieren Verarbeitung, indem Sie auf &quot;Process alle Videos oben genannten &#39;. Sehen Sie Fortschritt der Verarbeitung in der Mitte unten. </li><li> Einmal vollendet, &quot;Schließen&quot;, die Videoverarbeitung Bildschirm. </li></ol> 6. Die Analyse der körperlichen Fitness in Liquid - Messung <ol><li> Klicken Sie auf &quot;2. Compute Maßnahmen &quot;einen neuen Bildschirm zu öffnen, in dem die bearbeiteten Videos hochgeladen werden können, ein zu einer Zeit, die Verfolgung von einzelnen Tieren zu bestätigen oder abzulehnen. Videos, die in der Liste erscheint auf der linken Seite, wo das Video Name dieses Video zu können geklickt haben, verarbeitet wurden hochladen. </li><li> Nutzen Sie die Anleitung Schritt auf die Bereiche der verpassten Tracking (roten Blöcke) im Gegensatz zu erfolgreichen Tracking (grüne Blöcke) zu konzentrieren. HINWEIS: Alternativ kann man auf der automatisierten Ausgabe von gültiger Tracking verlassen , da die Software ein robustes Tracking - System (94,1% Gültigkeit ab 404 Videos in 2.020 Tieren beobachtet 8). <ol><li> Finden Sie die &quot;Gültigkeit des segmentierten Körpers in der ersten Farbbalken auf dem Bildschirm in der unteren Hälfte. Der Prozentsatz der &quot;gültige Rahmen &#39;ist in grün, und der Prozentsatz der&quot; abgelehnten frames&#39; ist in rot. ≥80% der gültigen Rahmen implizieren, dass die Tracking-ikommt von mindestens 432 Frames nformationen verwendet Maßnahmen zur Berechnung von 540 in einem 30 s schwimmen Studie bei 18 Bildern / s aufgezeichnet. </li><li> Leicht steuern und Blöcke gültiger ändern / abgelehnt Rahmen der &#39;Next Block&#39; verwendet wird, &#39;Schalter Gültigkeit &quot;,&quot; Split-Block &quot;und&quot; Isolieren frame&#39; Optionen. In dem seltenen Fall, dass zwei Tiere Pfade in einem überlaufenen Badezone gekreuzt, schalten ihre Identifikationsnummern über einen bestimmten Bildbereich mit dem &#39;Switch&#39; Taste. </li><li> Sehen Sie sich die Balkendiagramme in der unteren Hälfte des Bildschirms für zusätzliche Informationen über Tracking und überlappende Performances. Die Länge des segmentierten Körper (Tierkörperlänge pro Rahmen) korreliert mit Ausdehnungen überlappen. </li></ol></li><li> Wenn irgendwelche hellen Flecken auf dem Video die Analyse stören, stellen die hellen Bereiche in der Schwimmzone, die durch die &quot;Glare Zonen&quot; Funktion auswählen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Speichern und Compute Maßnahmen&quot; die Gültigkeit Eingabe zu speichern, bevor upandere verarbeitete Video geladen ist. In diesem Stadium der Software im Hintergrund berechnet (für den Benutzer nicht gezeigt), Krümmung Karten der Schwimmleistung einzelner Tiere und die Parameter , die unten angegeben (Video 2). HINWEIS: Die gemessenen Parameter , die hier fokussiert sind , sind in Tabelle 1 beschrieben. Die Welle Initiationsfrequenz, Körperwellenzahl, Asymmetrie, strecken, und Curling basieren auf den Krümmungen berechnet, dass die Software für die Tiere berechnet; Die Fahrgeschwindigkeit, Pinselstrich und Aktivitätsindex Parameter werden auf Krümmung Karten basieren. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Schließen&quot;, die &quot;Compute Maßnahmen&quot; Bildschirm zu verlassen. </li></ol> 7. Analyse der körperlichen Fitness in Liquid - Ausgabe Resultate Hinweis: Die Software auf mehreren Maßnahmen der Schwimmbewegung berichten können, die aus offenkundigen auf sehr subtile Verhaltensmerkmale decken nicht ohne weiteres Tor von Auge (Videos 3 und 4). Hier dasSchwerpunkt liegt auf 8 Parameter, die typischerweise einen guten Dynamikbereich zeigen: Wellenstartgeschwindigkeit, Körperwellenzahl, Asymmetrisch, Stretch, Curling, Fahrgeschwindigkeit, Pinselstrich und Aktivitätsindex. <ol><li> Auf dem Startbildschirm des Programms, klicken Sie auf &quot;3. Ergebnisse anzeigen &quot;, um die Analyseausgabe zu erhalten. </li><li> Erstellen Probengruppen für statistische Behandlung durch die gewünschten analysierten Sequenzen von Frames im linken Feld auswählen und sie in eine neue oder bestehende Probengruppe zu bewegen, indem Sie auf die &quot;Hinzufügen zur ausgewählten Probe&quot; oder &quot;In den neuen Sample &#39;Tasten. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Show Graphen für diese Proben&quot; zu einem zweiten Bildschirm zu gehen, dass die Graphen anzeigt und die wichtigsten Statistiken der Proben für jede der 8 Parameter durch Auswahl auf dem oberen Rand des Bildschirms. <ol><li> Falls gewünscht, passen Sie die Darstellung der Balkendiagramme an der oberen linken Ecke des Bildschirms mit den &#39;Farben&#39;, &#39;# von Histogrammen &quot;und&quot; Anzahl der Würmer &quot;Selektoren. </li></ol></li><li> Benutzen&quot;2D-Histogramme&quot; Kombinationen von zwei beliebigen Parameter über die &quot;Maßnahme auf der X-Achse&quot; zu plotten und &quot;Maßnahme auf der Y-Achse &#39;Drop-Down-Menüs auf der linken Seite des Bildschirms. Klicken Sie auf &quot;Schließen&quot; zu beenden und zur Rückkehr zum Bildschirm &quot;Ergebnisse anzeigen&quot;. </li><li> Verwenden Sie den &quot;Export ...&quot; Taste auf der oberen linken Ecke des Bildschirms detaillierte numerische Daten als CSV-Datei zu speichern, zu öffnen und weiter in ein Tabellenkalkulationsprogramm zu manipulieren. </li><li> &#39;Schließen&#39; &#39;Display Ergebnisse&#39; Bildschirm zurück zum Home-Bildschirm zu gehen und klicken Sie auf &quot;Beenden&quot; Sichern der Datenbank, um sicherzustellen, die analysierten Videosequenzen enthalten. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die Verwendung von C. elegans als Modellsystem weiterhin aufgrund seiner genetischen Formbarkeit, experimentelle Lenkbarkeit und Anatomie kommentierte akribische Detail zu erhöhen. Zum Beispiel wird die neuronale Struktur und Konnektivität des C. elegans hermaphroditischen deutlich 34-36 kartiert, stark Untersuchungen von spezifischen neuronalen Schaltungen erleichtern , die bestimmte Verhaltensweisen steuern. 302 Neuronen bilden das Nervensystem des erwachsenen Hermaphroditen, die eine breite Palette von sensorischen Input in grundlegende Verhaltens Ausgänge wie Lokomotion verarbeiten. Die Struktur des komplexeren männlichen Nervensystem hat auch 37 beschrieben worden ist , so dass geschlechtsspezifische Schaltung angesprochen werden. 37 C. elegans Verhalten wurde auf Standard - Kulturplatten mit festen Medien ausführlich untersucht. Da WT C. elegans bewegt sich in vorhersehbarer Sinuswellen auf Agar gefüllten Platten, Abweichungen von derGesamtmuster kann durch Auge und erzielte manuell erfasst werden. Dieser Ansatz ist jedoch unter dem Kriterium des Experimentators und ist arbeitsintensiv. Hard- und Software - Tools entwickelt , zu verfolgen und zu messen C. elegans Fortbewegung auf festen Medien die Vorspannung Subjektivität entfernen und ermöglichen eine groß angelegte Studien, komplexere biologische Fragestellungen ermöglicht angesprochen werden. Die jüngste Verhaltensdatenbank durch das Labor erstellt Schafer 16 ist ein ausgezeichnetes Beispiel für die analytische Ausdehnung und Tiefe , die auf Platten mit einem Rechensystem für die Fortbewegung erreicht wurde. Wenn WT C. elegans in Flüssigkeit gelegt wird, passt sich das Tier schnell seine Bewegung in die neue Umgebung, ein Bad zu initiieren. C. elegans Schwimmen einen größeren Bewegungsspiel nutzt als kriechende und unregelmäßiger 8 sein kann. Software wie CELEST soll die Lücke für eine detaillierte Analyse von C. elegans zu füllen Verhalten in flüssiger, permitting Quantifizierung von Bewegungs-assoziierten Parameter, die nicht ohne weiteres durch die un-Aided Auge gemessen werden, oder dass schneller als die manuelle Scoring durchgeführt werden kann. In 8 Fest h verarbeiten bis zu 200 Videos, ~ 1.000 Datensätze pro Tag ein individuelles könnte. Die Software definiert Schwimmen Beurteilung Parameter, die als umfassende Fingerabdruck der körperlichen Fitness und Verhalten dienen. Darüber hinaus Verständnis der komplexen Facetten von C. elegans Verhalten in flüssiger und ihre zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu bereichern, kann diese Software verwendet werden , um mehrere Aspekte der Biologie einschließlich pharmakologischen Reaktionen, Altern und unterschiedliche Verhalten zu erforschen. Der hier präsentierte die Übersicht über die quantifizierten Veränderungen , die in der körperlichen Leistungsfähigkeit von C. elegans auftreten Erwachsene , wie sie im Alter von einem Beispiel für eine solche Anwendung der Software ist (für eine ausführlichere Darstellung siehe Restif et al. 8). Im Zusammenhang mit der Alterung verringerte sich einige gemessenen Parameter währendandere erhöht oder nicht konsequent war in Wildtyp verändern. Trends wurden zu einem großen Teil von der Rechen Profil der Langlebigkeit Mutanten bestätigt, und die relativen Profile von anmutigen und schlechte ager Kohorten gleichgeschlechtlicher Alter Populationen gehalten in Uniform Umweltbedingungen. Die hohe Auflösung der Software kann auch subtile Phänotypen zeigen bisher unbekannte in ausführlich charakterisiert Mutanten (zB Alter-1 (hx546) in Abbildung 1). Es gibt einige besonders kritische Schritte des Protokolls beschrieben. eine konstante Temperaturumgebung zwischen der Schwimm Umgebung pflegen und die Dehnungsmeßplatte Kultur ist für Schwimmen Reproduzierbarkeit wichtig, so Experimentatoren sind große Mühe zu gehen, sehr ermutigt, um zufällige Temperaturschwankungen vermeiden. Schwimm Medien sollten wie die Platten bei der gleichen Temperatur sein. Ebenso wird sorgfältig auf die Tropfengröße für das Schwimmen helfen Reproduzierbarkeit gewährleisten. Schließlich ist es ratsam, in zu denkenVoraus über die Abladen der großen Video-Dateien, die sich ansammeln. Die Verarbeitung von Bildern auf einer Seite neben der Video-Capture-Computer wird empfohlen. Die Verwendung der Software hier für swim Analyse vorgestellt hat bestimmte Einschränkungen. Erstens: Obwohl die Programme gleichzeitig mehrere Tiere verfolgen können, wenn mehr als fünf Tiere gemeinsam analysiert werden, besteht eine erhöhte Wahrscheinlichkeit, dass die Tiere übereinander in den Videobildern schwimmen. Wenn das Programm nicht eindeutig bestimmen, welches Tier war die, wie es jene Datenrahmen zensiert. Obwohl dieses Programm stellt sicher, dass Daten für einzelne Tiere von hoher Qualität sind, schränkt sie den Durchsatz. Zweitens sollten die Bilder ziemlich sauber sein, dh frei von Staub, Schmutz und Blendung durch Leuchten, als assoziierte Signale auch die Bildanalyse durcheinander bringen kann. Wie bereits in Abschnitt 2.1.1 Protokoll, ein sehr Low-Tech-Investitionen, die sich stark der Bildaufnahme durch die Beseitigung Komplikationen im Zusammenhang mit Schwankungen helfen kann in Umgebungsbeleuchtung ist die Bühnenbereich mit einem dunklen Tuch abdecken, die nicht Umgebungslicht erlaubt, um die Bühne zu erreichen. Drittens wird das Programm für die Tiere bei erwachsenen Stadium optimiert. Junge Larven schwimmen sehr schnell und haben kleine Körper, die Programmfehler erhöht. Viertens nutzt einige der Software MATLAB, und wenn es Versions-Upgrades und / oder Betriebssystem-Upgrades können einige Programmverknüpfungen gestört werden. Derzeit ist die Software für den Einsatz auf MATLAB 2015B und Mac OS Version 10.10 optimiert, aber wir erwarten, dass in Kürze eine Software-Version zu veröffentlichen, die robuster gegenüber solchen Veränderungen ist. Schließlich können die Videodatendateien groß werden schnell und Speicherplatz benötigen zugeteilt werden. Zusammenfassend hier präsentiert ist eine einfache Methode , die von jedem Labor ohne große Investitionen leicht umgesetzt werden können für CELEST Analyse Schwimmen Videos von C. elegans zu erstellen. Funktionen des Softwarepakets gehören umfangreiche Automatisierung von Tracking durchAnalyse, simultanen Multi-Tier - Verfolgung und Verwendung von mathematischen Grundlagen (dh Krümmungsmaßnahmen) zur Quantifizierung der meisten Bewegungsparameter. Die Software ist Open Source, mit Code und Demos öffentlich zugänglich wie in Restif detailliert et al. 8. Obwohl die Programmanalyse Advanced Computer Vision für Tracking - Funktionen, anderen veröffentlichten Tracking - Systeme (zB Greenblum et al., 2014 38) sind kompatibel mit der Parameteranalyse der Software vorgestellt. Zukünftige Verbesserungen werden in Richtung Umwandlung der Software in ein robusteres Paket gerichtet werden, die Verwendung auf die spezifischen Versionen der Betriebssysteme nicht oben erwähnt beschränken (auch in der Tabelle der Materialien angegeben).

Definieren, wie Genetik, Epigenetik, Erfahrung und Umwelt Einfluss Verhalten eine große Herausforderung in der modernen Biologie ist. Einfach, genetisch zugänglich Modelle, die rechnerisch verfolgt und gemessen werden können kritische Beiträge zu diesem Ziel leisten können. Die Nematoden Caenorhabditis elegans ist ein solches Modell. Der Zweck dieses Artikels ist es zu zeigen , wie C. elegans Lokomotion Schwimmen nachverfolgt werden kann und quantifizierten Informationen über acht neue Merkmale mit biologischer Relevanz zu extrahieren. C. elegans hat eine relativ kurze Lebensdauer von ca. 2 - 3 W und einer Fortpflanzungszeit von etwa 4 d bei 20 ° C 1,2. Im Standard - Laborkulturen wird diese mikroskopisch kleinen Faden auf Petri - Platten , die Nematode Growth Medien (NGM) gezüchtet , die mit einer bakteriellen Nahrungsquelle 3,4 verteilt sind. WT N2 Tiere bewegen sich aktiv in elegant Sinuswellen auf Agar gefüllten Platten; sie Bewegung Ratte ändernes , wenn ( der Suche nach Nahrung) Roaming, Wohnung (Browsing), oder von einer Mahlzeit (inaktive Sättigung quiescence) Gewinnen 5. Impairment 6 oder im Alter von 7-12 können dramatisch verändern auch die Bewegung auf den Platten. Gene, die Verhalten, Health oder Alterung modulieren, kann durch die Analyse C. elegans Bewegungsmuster oder Fortbewegung charakterisiert werden funktionell. Ein Ansatz Health zu messen , ist alterungs- Erwachsene in drei Kategorien klassifizieren (zB A, B, und C) entsprechend ihrer Fortbewegung auf Platten, mit intensiver körperlicher Aktivität ist Klasse A und Lähmung ist Klasse C 7,8,13. Obwohl eine solche qualitative Sortierung nützlich ist, Unterschiede in der körperlichen Fitness zu offenbaren, sind die Kategorien breit ohne klare Grenzen und damit ihre Scoring unterliegt Bias Experimentator. Eine wachsende Zahl von Tracker haben die Objektivität, Raffinesse erhöht und Präzision der Analyse von C. elegans Bewegungauf festen Medien 14-18. C. elegans Fortbewegung auf Platten meist auf die Ebene beschränkt ist , in dem das Tier Kontakt mit der festen Oberfläche des Mediums bildet. (C. elegans kann auch Exploration induzieren , indem Sie den Kopf zu heben weg vom Rest des Körpers , die immer noch in Kontakt mit einer festen Oberfläche ist, die Positionierung des Körpers in mehreren Ebenen. Doch dieses Verhalten ungewöhnlich ist.) Wenn sie in flüssiger gesetzt, diese Nematoden initiiert eine wellen~~POS=TRUNC oder Schwimmen, die weitergehende dreidimensionale Bewegung verfügt, eine größere Bandbreite an Geschwindigkeit und Tiefe der Bewegung und eine erhöhte Inzidenz mit dem Alter der vorderen anders posterior bewegt, wie die Tiere auf festen Oberflächen verglichen. Als schnelle Analyse der körperlichen Fitness und Reaktion auf neue Umgebung kann ein Experimentator eines einzelnen Tieres in einen Flüssigkeitstropfen platzieren und sammle seine Frequenz der Körper biegt sich unter dem Binokular. Die Videoaufnahme kann Gegenwart und Zukunft Ritzungen des Schwimm Kraft der ErleichterungTier. Jedoch begrenzt die manuelle Ansatz die Anzahl der Funktionen, die erzielt werden können, und ist vollständig in einer Zeit, Scoring ein Tier gezwungen. Locomotion in Flüssigkeit weniger ist als die Fortbewegung auf festen Medien untersucht. Tatsächlich gibt es einige Software - Optionen , die die Fortbewegung im Labor zu implementieren robust und einfach in flüssiger 19-24 zu messen. Die Software CELEST (C. elegans Swim Test) bietet Einfachheit in der Anwendung und mathematisch-basierte Maßnahmen , die 8 - Daten (Krümmungs scores) unmittelbar relevant für die Art der Bewegung liefern; (ausführliche Beschreibung von Merkmalen und Vorteilen in Restif et al. 8). Darüber hinaus ermöglicht Computeranalyse die Aufklärung der phänotypischen Eigenschaften, die für das menschliche Auge unmöglich zu punkten. Dabei werden Daten, die die Auflösung dieser Analyse Ansatz exemplarisch vorgestellt und ein einfaches Protokoll zu implementieren, um schwimmen Studien aufnehmen für nachfolgende CELEST Analyse beschrieben.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; WT (ancestral).</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Biosafety Level: BSL-1.</td></tr><tr><td>OP50-1 &lt;em&gt;Escherichia Coli&lt;/em&gt;&amp;nbsp;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Streptomycin resistant strain of OP50.&amp;nbsp; Biosafety Level: BSL-1.</td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Printed Microscope Slides&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002</td><td>have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink</td></tr><tr><td>Nematode Growth Medium (NGM)</td><td>For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer, 1 mL 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L. Sterilize by autoclaving.</td><td></td><td>Stiernagle, T. Maintenance of &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)</td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td>For 1 L: 3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L. Sterilize by autoclaving.</td><td></td><td>Stiernagle, T. Maintenance of &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CeleST</td><td>Driscoll Lab, Rutgers University</td><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; Swim Test</td><td>Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>www.mathworks.com/downloads</td><td>MatLab version 2015b (best)</td><td>The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn&#039;t be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn&#039;t need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mac OS</td><td>www.apple.com</td><td>Version 10.10</td><td>Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don&#039;t even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it&#039;s the operating system in our lab).</td></tr><tr><td>Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Transmitted Light Base</td><td>Diagnostic Instruments</td><td>TLB 3.1</td><td></td></tr><tr><td>Digital CCD Camera</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)</td><td></td></tr><tr><td>Digital Video Recording Software</td><td>Norpix</td><td>Streampix Version 3.17.2</td><td></td></tr></tbody></table>

automated analysis of c. elegans swim behavior using celest software

Sezieren die neuronalen und neuromuskuläre Schaltungen, die das Verhalten regulieren bleibt eine große Herausforderung in der Biologie. Der Nematode Caenorhabditis elegans hat sich als unschätzbar Modellorganismus zu sein zu helfen , dieser Herausforderung zu begegnen, aus technologischen Ansätzen inspirieren, den Bau des menschlichen Gehirns Connectome, um tatsächlich ein Licht auf die spezifischen molekularen Treiber von grundlegenden Funktionsmuster zu vergießen. Der größte Teil der Verhaltensstudien in C. elegans sind auf festen Substraten durchgeführt. In Flüssigkeit zeigen Tiere Verhaltensmuster, die Bewegung in einem Bereich von Geschwindigkeiten in 3D, sowie Teilkörperbewegungen, wie eine hintere curl ohne vordere Formänderung umfassen, die für die Quantifizierung neue Herausforderungen einzuführen. Die Schritte eines einfachen Verfahrens, und die Verwendung einer Software , die hochauflösende Analyse von C. elegans Schwimmverhalten ermöglicht, werden hier vorgestellt. Die Software namens CELEST, nutzt eine spezielle Computerprogramm, das verfolgtmehrere Tiere gleichzeitig und stellt neue Maßnahmen von C. elegans Fortbewegung in Flüssigkeit (Schwimmen). Die Maßnahmen werden vor allem in der Tierhaltung begründet und basiert auf Mathematik in Computer Vision und Mustererkennung verwendet, ohne Rechenanforderungen für Schwellen cut-offs. Das Software-Tool kann verwendet werden, um sowohl in der Hunderte von Tieren aus kombinierten Kleinserien Studien Gesamt Schwimmen Fähigkeiten beurteilen und neue Phänotypen sogar in gut charakterisierten genetischen Mutanten zu offenbaren. Die Herstellung von Proben für die Analyse mit CELEST ist einfach und Low-Tech, so dass breite Anpassung von der wissenschaftlichen Gemeinschaft. Die Nutzung der Rechen hier beschriebenen Ansatz sollte daher auf dem besseren Verständnis des Verhaltens und Verhaltensschaltungen in dem C. elegans - Modell beitragen.

Durch die Analyse der Fortbewegung in Flüssigkeit (Schwimmen), Phänotypen, die nicht ohne weiteres ersichtlich, auf festen Medien (Crawling) erläutert. Um Quantifizieren Schwimmen Fortbewegung entwickelten wir spezifische Software , die zehn neuen Parameter des Schwimmverhaltens 8 misst. Die acht am nützlichsten dieser Parameter werden im Detail in Tabelle 1 beschrieben. Diese Parameter werden Wave-Startgeschwindigkeit genannt, Körperwellenzahl, Asymmetrisch, Stretch, Curling, Fahrgeschwindigkeit, Pinselstrich und Aktivitätsindex. Studien , die die Leistung der Software veranschau haben den funktionellen Rückgang von Hunderten von alternden Erwachsenen mit WT, Verhaltens- oder Langlebigkeit Mutantenhintergründe 8, definiert und haben die gut erforschten Langlebigkeit Mutanten Alter-1 (hx546) und daƒ-16 (mgDƒ50) analysiert, die Mutationen beherbergen, die das normale Insulin-Signalweg unterbrechen. Das Gen Alter-1 kodiert für eine Phosphatidylinositol - 3-Kinase (pIK3) Katalytische Untereinheit, und, wenn es die Mutation hx546 birgt, verursacht Laufzeitverlängerung und Stressresistenz 27-29. Das Gen daƒ-16 kodiert für ein forkhead Box O (FOXO) Transkriptionsfaktor, der Lebensdauer und beeinträchtigt die Stress - Reaktion verkürzt sich, wenn 30-33 gelöscht. Bestimmte Parameter des Schwimmens wie Wave - Startgeschwindigkeit, Fahrgeschwindigkeit, Pinselstrich und Aktivitätsindex nach und nach zurückgegangen mit dem Alter auch in günstigen genetischen Hintergrund (Abbildung 1). Im Einklang mit derzeitigen Kenntnissen und langlebiges Alter-1 (hx546) Mutanten zeigten eine starke körperliche Leistung als WT bei fortgeschrittenen und extrem hohen Alter. Auch wie erwartet, kurzlebige daƒ-16 (mgDƒ50) Mutanten zeigten die Leistung beeinträchtigt, vor allem bei extrem hohen Alter. Bemerkenswerterweise war es nur unter der Kontrolle der CELEST Computer Vision und mathematischen Algorithmus Paket, das die superior Schwimmleistung von Alter-1 (hx546) Mutanten war zu Beginn des Erwachsenenalter nachweisbar. Die Tatsache , dass das Alter-1 (hx546) führt zu einer Verbesserung der physischen Leistung bei jungen Erwachsenenleben legt nahe , dass diese Mutation normale Entwicklung und / oder jungen Erwachsenen Phänotyp in einer Weise , die zuvor nicht geschätzt beeinflusst (Abbildung 1). Körperwellenzahl, Asymmetrisch, Stretch und Curling - Parameter mit dem Alter in WT tendierten und Alterungs Mutant Erwachsene (Abbildung 2). Interessanterweise ergab die Auflösungsstufe der Software feineren Verhaltensmerkmale wie die nachhaltige Symmetrie des Alters-1 (hx546) Mutanten während ihrer gesamten Lebensdauer und die Unfähigkeit der extremen alten daƒ-16 (mgDƒ50) Mutanten und das gleiche in dem Maße zusammenrollen zu strecken -age WT und Alter-1 (hx546) Erwachsene. Neben dem Gesamt unvermeidlichen Verlust physikalischer performance aufgrund von Alter, jeder einzelne Erwachsenen ein einzigartiges Muster Progression durch den Alterungsprozess zeigt, selbst wenn Genetik und Umwelt 7 praktisch homogen sind. (Von Genetik und Umwelt, die möglichen verwirrenden Auswirkungen dieser Faktoren minimiert Controlling, den bedeutenden Beitrag von stochasticity zu altersbedingten Degeneration Enthüllung.) Eine synchronisierte C. elegans Population von ähnlichen genetischen Hintergrund gehalten in einer kontrollierten Umgebung enthält immer noch eine Mischung aus verschiedene Klassen von Individuen nach ihren alternden Besonderheiten. Obwohl alle als gesunde Erwachsene beginnen, verlieren einige schnell ihre körperliche Fitness (schlecht Ager, Klasse C), während andere Kraft für längere Zeit (anmutigen Ager, Klasse A) erhalten. Bad Ager erscheinen daher eine wesentlich kürzere als anmutige Health Ager zu haben. Wie weiter detailliert in unserer Studie 8, gehalten anmutigen Ager jugendliche körperliche FITNess wie durch den Vergleich mit der Swim - Profil von viel jüngeren Erwachsenen (Abbildungen 3, 4 und 5) beobachtet. Diese nachhaltige Fitness ist vergleichbar mit der körperlichen Leistungsfähigkeit von langlebigen Alter-1 (hx546) Mutanten bei post-reproduktiven Alter (D 11) (Abbildungen 1 und 2). Im Gegenteil verloren, schlechte Ager dramatisch viel von ihrer körperlichen Leistungsfähigkeit bald nach der Wiedergabe auf einem Niveau ähnlich denen der extremen alten und progeric daƒ-16 (mgDƒ50) Erwachsene (Abbildungen 1 - 4) durchgeführt wird . Diese Ähnlichkeiten können grob Vergleich gezogen werden, jedoch insbesondere Signaturen sind leicht bemerkbar bei genauerem Hinsehen. Zum Beispiel, obwohl es eine gewisse Korrelation zwischen dem Ausmaß der sowohl strecken und Curling in extremen alten Wildtypen und Alterung Mutanten (Abbildung 2) ist diese Beziehung nicht in schlecht Ager beobachtet (4 und 5), die höhere Neigung zeigen , sich zu kräuseln up abernicht getestet in den Proben zu strecken. Die Software, die wir so präsentieren fügt Dimension der Analyse der körperlichen Fitness oder motorischen Leistungsfähigkeit durch die Werkzeuge für die anspruchsvolleren Studien bieten, die vorher nicht lenkbar waren. Zusammengefasst stellt CELEST umfassende Ablesungen in Form von acht neuen Maßnahmen hier hervorgehoben, die den Verhaltens Fingerabdruck von spezifischen genetischen, epigenetischen definieren und ökologischen Hintergründe, die Identifizierung von einzigartigen und gemeinsamen Parameter Muster ermöglicht, die die Signaturen der spezifischen Bedingungen sein kann ( Umwelt-, pharmakologische, Ernährungs), biologische Prozesse oder Organismus Staaten wie Health. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig1.jpg" /> Abbildung 1: CELEST Software Berichte über Wave - Initiation Rate (A), Aktivitätsindex (B), Pinselstrich - Optik (C) und Fahrgeschwindigkeit (D) für WT, das Alter-1 (hx546) und daƒ-16 (mgDƒ50)<html> Erwachsene auf D 4 (junge Erwachsene), 11 (post-Wiedergabe) und 20 (extrem alt). &#39;#&#39; In y-Achse bedeutet &quot;Zahl&quot;. WKA sind grau, alters 1 in grün und daƒ-16 in rot gefärbt. Die Fehlerbalken sind die Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Same-Alter WT und Alterungs Mutanten wurden für eine statistische Signifikanz im Vergleich mit one-way ANOVA durch Dunnett-Mehrfachvergleichstest. **, P = 0,001 - &lt;0,01; ***, P = 0,0001 - &lt;0,001. n = 62 in jedem Datenpunkt von vier unabhängigen Studien. Beachten Sie, dass hier, und für 2, jedes einzelne 30 s Video mit 4 Tieren gemacht, und für jeden Versuch punkten wir insgesamt 16 Tiere von 4 schwimmen Videos wird diese gezeigt für 4 biologischen Replikaten für jeden Datenpunkt durchgeführt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig2.jpg" /> Abbildung 2: Software - Berichte über die Körper - Wellen - Nummer (A), Asymmetrisch (B), Stretch (C) und Curling (D) für WT, das Alter-1 (hx546) und daƒ-16 (mgDƒ50) Erwachsene auf D 4 (junge Erwachsenenalter), 11 (post-Wiedergabe) und 20 (extrem alt). &#39;#&#39; In y-Achse bedeutet &quot;Zahl&quot;. WT sind in grau, alters 1 in grün gefärbt und daf-16 in rot. Die Fehlerbalken sind die Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Same-Alter WT und Alterungs Mutanten wurden für eine statistische Signifikanz im Vergleich mit one-way ANOVA durch Dunnett-Mehrfachvergleichstest. *, P = 0,01 - &lt;0,05; **, P = 0,001 - &lt;0,01; ***, P = 0,0001 - &lt;0,001. n = 62 in jedem Datenpunkt aus vier unabhängigen, 30 s schwimmen Studien.e.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig3.jpg" /> Abbildung 3: Software - Berichte über die Wave - Initiation Rate (A), Aktivitätsindex (B), Pinselstrich - Optik (C) und Fahrgeschwindigkeit (D) für junge WT Erwachsene (D 4) und Same-Alter Anmutig und Bad Ager (D10 und 11). &#39;#&#39; In y-Achse bedeutet &quot;Zahl&quot;. Junge WKA sind grau, Klasse A anmutigen Ager in grün gefärbt und Klasse C schlecht Ager in rot. Die Fehlerbalken sind die Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Klasse A anmutigen Ager und Klasse C schlecht Ager wurden im Vergleich zu D 4 junge Erwachsene one-way ANOVA durch Dunnett-Mehrfachvergleichstest gefolgt werden. ****, P &lt;0,0001. n = 27 in jedem Datenpunkt von zwei unabhängigen, 30 s schwimmen Studien. Graph ist leicht von Restif et al modifiziert. (2014) 8, die unter der Creative wurdeCommons Namensnennung (CC BY) Lizenz http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig4.jpg" /> Abbildung 4: Software - Berichte über die Körper - Wellen - Nummer (A), Asymmetrisch (B) und Curling (C) für junge Erwachsene WT (D 4) und Same-Alter anmutig und Bad Agers (D 10 und 11). &#39;#&#39; In y-Achse bedeutet &quot;Zahl&quot;. Junge WKA sind grau, Klasse A anmutigen Ager in grün und Klasse C schlecht Ager in rot gefärbt. Die Fehlerbalken sind die Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Klasse A anmutigen Ager und Klasse C schlecht Ager wurden im Vergleich zu D 4 junge Erwachsene one-way ANOVA durch Dunnett-Mehrfachvergleichstest gefolgt werden. **, P = 0,001 - &lt;0,01; ****, P &lt;0,0001; <strong&gt; n / a, da nicht anwendbar nur ein Tier aus der Gesamtstichprobengröße gelockt. n = 27 in jedem Datenpunkt von zwei unabhängigen, 30 s schwimmen Studien. Graph ist leicht von Restif et al modifiziert. (2014) 8, die unter der Creative Commons Namensnennung (CC BY) Lizenz http veröffentlicht wurde: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig5.jpg" /> Abbildung 5: Software - Bericht über Stretch für junge Erwachsene WT (D 4) und Same-Alter Anmutig und Bad Agers (D 10 und 11). Junge WKA sind grau, Klasse A anmutigen Ager in grün und Klasse C schlecht Ager in rot gefärbt. Die Fehlerbalken sind die Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Klasse A anmutigen Ager und Klasse C schlecht Ager wurden im Vergleich zu D 4 young Erwachsene one-way ANOVA durch Dunnett-Mehrfachvergleichstest gefolgt werden. n = 27 in jedem Datenpunkt von zwei unabhängigen Studien. Graph ist leicht von Restif et al modifiziert. (2014) 8, die unter der Creative Commons Namensnennung (CC BY) Lizenz http veröffentlicht wurde: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54359/54359fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/54359/54359video1.jpg" /> Video 1: Schwimmen von einer repräsentativen Gruppe von C. elegans Erwachsene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video1.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video1.mov" target="_blank">dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video1.mov" target="_blank">.)</a> <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/54359/54359video2.jpg" /> Video 2: CELEST Software Berechnung einzelner Krümmungen der Swim Performances der getesteten Tiere. Curvature Karten werden im Hintergrund berechnet wird; erscheinen sie nicht in der Software-Schnittstelle mit dem Benutzer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video2.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video2.mov" target="_blank">dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video2.mov" target="_blank">.)</a> <img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/54359/54359video3.jpg" /> Video 3: Software Berechnung der Schwimm Maßnahmen auf der Grundlage individueller Curvature Maps. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video3.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video3.mov" target="_blank">dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video3.mov" target="_blank">.)</a> <img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/54359/54359video4.jpg" /> Video 4: Software Berechnung der Swim Maßnahmen, die auf Curvature Verlassen Sie sich nichtMaps. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video4.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video4.mov" target="_blank">dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54359/Video4.mov" target="_blank">.)</a>

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Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Eine effiziente und einfache Methode für die computergestützte Analyse von Nematoden Schwimmverhalten in Flüssigkeit beschrieben. Das Verfahren erfordert keine Investitionen für C. elegans Laboratorien wenig. Die verwendete Hardware ist Standard, und der Computer-Software für die Verhaltensanalyse (CELEST) ist eine Open Source ein.

Automatische Analyse von<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Verhalten mit CELEST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

automated-analysis-of-c-elegans-swim-behavior-using-celest-software

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

12.4K Aufrufe.  Rutgers University.  Eine effiziente und einfache Methode für die computergestützte Analyse von Nematoden Schwimmverhalten in Flüssigkeit beschrieben. Das Verfahren erfordert keine Investitionen für C. elegans Laboratorien wenig. Die verwendete Hardware ist Standard, und der Computer-Software für die Verhaltensanalyse (CELEST) ist eine Open Source ein. 

Serie: Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

Einzel-Wellenlänge Schatten von Imaging<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion einschließlich Kraft-Schätzungen

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Forschung

Ingenieurwesen

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

Quantitative Locomotion Study of Frei Schwimmen Mikroorganismen mittels Laserbeugung

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Biotechnik

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Tracking und Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

Neurowissenschaften

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) controls several functions in C. elegans including learning and motor activity. Conditions that stimulate DA release (e.g., amphetamine (AMPH) treatments) or that prevent DA clearance (e.g., animals lacking the DA transporter (dat-1) which are incapable of reaccumulating DA into the neurons) generate an excess of extracellular DA ultimately resulting in inhibited locomotion. This behavior is particularly evident when animals swim in water. In fact, while wild-type animals continue to swim for an extended period, dat-1 null mutants and wild-type treated with AMPH or inhibitors of the DA transporter sink to the bottom of the well and do not move. This behavior is termed "Swimming Induced Paralysis" (SWIP). Although the SWIP assay is well established, a detailed description of the method is lacking. Here, we describe a step-by-step guide to perform SWIP. To perform the assay, late larval stage-4 animals are placed in a glass spot plate containing control sucrose solution with or without AMPH. Animals are scored for their swimming behavior either manually by visualization under a stereoscope or automatically by recording with a camera mounted on the stereoscope. Videos are then analyzed using a tracking software, which yields a visual representation of thrashing frequency and paralysis in the form of heat maps. Both the manual and automated systems guarantee an easily quantifiable readout of the animals' swimming ability and thus facilitate screening for animals bearing mutations within the dopaminergic system or for auxiliary genes. In addition, SWIP can be used to elucidate the mechanism of action of drugs of abuse such as AMPH.

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming induced paralysis (SWIP) is a well-established behavioral assay used to study the underlying mechanisms of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans (C. elegans). However, a detailed method to perform the assay is lacking. Here, we describe a step-by-step protocol for SWIP.

Schwimmen induzierte Paralyse zu beurteilen Dopamin Signalisierung in Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Verhalten

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Ein Test zur Messung der Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit der<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Automatisierte verhaltensbasierte Analyse der großen C. Elegans Populationen verwenden ein breites Sichtfeld Tracking-Plattform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Immunologie und Infektion

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor impairment that worsens with time. While considerable advances have been made in determining genetic drivers of ALS for a subset of patients, the majority of cases have an unknown etiology. Further, the mechanisms underlying motor neuron dysfunction and degeneration are not well understood; therefore, there is an ongoing need to develop and characterize representative models to study these processes. Caenorhabditis elegans can adapt their movement to the physical constraints of their surroundings, with two primary movement paradigms studied in a laboratory environment- crawling on a solid surface and swimming in liquid. These represent a complex interplay between sensation, motor neurons, and muscles. C. elegans models of ALS can exhibit impairment in one or both of these movement paradigms. This protocol describes two sensitive assays for evaluating motility in C. elegans: an optimized radial locomotion assay measuring crawling on a solid surface and an automated method for tracking and analyzing swimming in liquid (thrashing). In addition to the characterization of baseline motor impairment of ALS models, these assays can detect suppression or enhancement of the phenotypes from genetic or small molecule interventions. Thus, these methods have utility for studying ALS&#160;models and any C. elegans strain that exhibits altered motility.

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol describes two sensitive assays for discriminating among mild, moderate, and severe motor impairment in C. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis, with general utility for C. elegans strains, with altered motility.

Evaluation der motorischen Beeinträchtigung bei C. elegans Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

Swimming-Induced Paralysis (SWIP) Assay: A Method to Quantify Dopamine-Mediated Locomotion in C. elegans

Source: Kudumala, S., et al. <a href="https://www.jove.com/video/59243/swimming-induced-paralysis-to-assess-dopamine-signaling">Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in&#160;Caenorhabditis elegans</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019).
Here, we introduce an assay to measure SWIP, a behavioral phenotype of&#160;C. elegans&#160;that occurs during vigorous motion like swimming.&#160; The example protocol discusses both manual and automated analysis approaches.

Schwimminduzierter Lähmungsassay (SWIP): Eine Methode zur Quantifizierung der Dopamin-vermittelten Fortbewegung bei C. elegans

Source: Kudumala, S., et al. Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019).
Here, ...

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Einzel-Wellenlänge Schatten von Imaging