Wir danken J. Chen für die Bereitstellung der Käfig Fluorescein-Dextran-Synthese-Protokoll. Diese Arbeit wurde von der March of Dimes Auszeichnung 5-FY09-78, die American Heart Association Award 09BGIA2090075 unterstützt, und die NIH / NHLBI Auszeichnung R01 HL107369-01 bis SS Ein besonderes Dankeschön an C. Closson für seine Mikroskopie Hilfe.

1. Synthese von caged Fluorescein-Dextran (nach Lit.. 14) <ol><li> Bereiten Sie eine 0,1 M Lösung von Natrium-Borat in ddH 2 O verdünnt </li><li> Maßnahme 4 mg von 10 kDa Aminodextran und fügen Sie es dem CMNB-caged Fluorescein Röhre. </li><li> Add 500 mL der vorbereiteten Natriumboratlösung (Schritt 1,1), die CMNB-caged Fluorescein Röhre. Verschließen Sie die Tube und Wirbel für 30 Sekunden, um die Mischung zu lösen. </li><li> Lassen Sie die Mischung über Nacht reagieren auf Kolbenpendel bei Raumtemperatur. Decken Sie die Röhrchen mit Metallfolie, um die Exposition der Mischung auf das Umgebungslicht zu verhindern. </li><li> Besorgen Sie sich einen Zeba entsalzen Spin-Säule und drehen Sie die untere Kappe. Markieren Sie einen Punkt auf der Säule, die zur Orientierung verwendet werden, wenn die Säule zentrifugiert. Legen Sie die Spalte in einem 15 ml konischen Falcon-Röhrchen. Hinweis: Die Lösung in der Spin-Säule ist Säulenpuffer. </li><li> Lösen Sie die Abdeckkappe auf der entsalzen Spin-Säule. Legen Sie die 15 ml konischen Falcon-Röhrchen, dass die Spin-Säule entsalzt Häuser in einer Zentrifuge. Richten Sie die Spin-Säule mit dem markierten Punkt (Schritt 1,4) vor der Mitte des Zentrifugenrotor. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach dem Zentrifugieren, entfernen Sie die entsalzen Spin-Säule aus dem Falcon-Röhrchen. Entsorgen Sie sowohl die gesammelten Durchströmung und die 15 ml konischen Röhrchen. Fordern Sie ein neues 15 ml konischen Falcon-Röhrchen, und platzieren Sie den entsalzen Spin-Säule in den neuen Falcon-Röhrchen. Hinweis: Nach dem Zentrifugieren der Säule Harzbett sollte verdichtet erscheinen. Verwenden Sie die Spalte sofort. </li><li> Besorgen Sie sich die umgesetzte Gemisch (caged Fluorescein-Dextran) in Schritt 1.3. Entfernen Sie die Schutzkappe von der Spin-Säule und saugen Sie den Reaktionsaustrag und wenden Sie es langsam auf die Mitte des entsalzen Spin-Säule. Nach dem Auftragen der Reaktionsaustrag, ersetzen Sie die Kappe auf dem Spin-Säule. </li><li> Legen Sie die Falcon-Röhrchen, dass die Spin-Säule entsalzt Häuser in einer Zentrifuge. Wie in Schritt 1,5, orientieren die Spin-Säule mit dem markierten Punkt vor der Mitte des Zentrifugenrotor getan. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1000 xg für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Zentrifugation wird eine gelbe Mischung (caged Fluorescein-Dextran) gesammelt (etwa 400 ul) in der 15 ml-Falcon-Röhrchen werden. Übertragen Sie die caged Fluorescein-Dextran-Gemisch in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Unmittelbar Deckel des Röhrchens mit Metallfolie, um die Exposition der Mischung auf das Umgebungslicht zu verhindern. Lyophilisieren den Käfig Fluorescein-Dextran-Gemisch in einer Speedvac. Gefriertrocknung von 350 ul dauert etwa 4 Stunden. </li><li> Nach vollständiger Gefriertrocknung, resuspendieren das Pulver (ca. 3 mg) in ddH 2 O, um eine endgültige Konzentration von etwa 1% w / v. Mix durch kurzes Vortexen, um das Pulver zu suspendieren. </li><li> Aliquot der Käfig Fluorescein-Dextran in separate Metallfolie abgedeckt Rohre, und lagern Sie sie bei -20 ° C. </li></ol> 2. Die Ernte von Embryonen und die Mikroinjektion von caged Fluorescein-Dextran * Bei diesem Verfahren wird der Zebrafisch als Tiermodell-System. <ol><li> Am Tag vor Injektionen, bis Zebrafisch Kreuze entweder 1:1 Mann-zu-Frau-oder 2:1 Mann-zu-Frau-in Zuchtbecken mit Teilern gesetzt. </li><li> Am nächsten Morgen ändern Aufzuchtbecken Wasser und entfernen Sie den Teilern. Unmittelbar bereiten ein 5 ul 1 / 10 verdünnt funktionierende Lösung von caged Fluorescein-Dextran in entweder 1 X Danieau Medien (siehe Herstellung von Lösungen) oder ddH 2 O. Decken Sie die funktionierende Lösung Rohr mit Metallfolie Lichteinfall zu verhindern. </li><li> Pipette den vorbereiteten Käfig Fluorescein-Dextran-Lösung (Schritt 2,2) in die Nadel. Vor dem Schneiden der Nadelspitze auf eine geeignete Größe unter den Dissektionsmikroskop, ein Stück aus transparentem Gelbfilter vor der weißen Lichtquelle. Der gelbe Filter spontane Uncaging der Fluorescein-Dextran während Injektionen zu vermeiden. Beim Blick durch das Okular Okular, sollte die Lichtquelle gelb erscheinen. </li><li> Sammeln Embryonen und Pipette sie in eine Mikroinjektion Schimmel Fach. Stellen Sie die Mikroinjektion Zeit von 3 bis 4 nL liefern von caged Fluorescein-Dextran. Unter dem Dissektionsmikroskop, orientieren die Embryonen mit einer Pinzette und injizieren (3 bis 4 nL) Fluorescein-Dextran in die Basis der Blastomere Zellen (Blastomeren-Eigelb-Schnittstelle) eingesperrt. Der Embryo Bühne für die Injektion sollte 1 - bis 2-Zell-Stadium. </li><li> Nach der Injektion entfernen die Embryonen aus der Mikroinjektion Schimmel Fach und legen Sie sie in eine saubere Petrischale mit frischem Fisch Wasser. Methylenblau kann, um die Fische Wasser hinzugefügt werden, um Pilzwachstum zu einer Endkonzentration von verhindern bei 0,02% w / v. Deckel der Petrischale mit Metallfolie zu verhindern Uncaging der injizierten caged Fluorescein-Dextran. </li><li> Heben Sie den injizierten Embryonen zu einem Stadium, wenn die Zellen von Interesse photoaktivierte werden müssen. Für Photoaktivierung, bereiten Sie einen 0,6% niedrig schmelzender Agarose-Lösung in ddH 2 O. Je nach Embryonalstadium, Tricaine (MS222) kann auf der niedrig schmelzenden Agarose hinzugefügt werden. Um dies zu tun, verdünnte 0,02% Tricaine in niedrig schmelzender Agarose in einer Endkonzentration von 0,0014%. </li><li> Sobald die Embryonen der entsprechenden Entwicklungsstufe, dechorionate die Embryonen in 1 X Danieau Medien mit einer Pinzette zu erreichen. Wenn dechorionating, stellen Sie sicher, dass eine transparente Gelbfilter in den Weg der weißen Lichtquelle platziert wird (siehe Schritt 2.3). </li><li> Erhitzen Sie die 0,6% niedrig schmelzender Agarose-Lösung auf 37 ° C. Je 1 mL der niedrig schmelzenden Agarose in die Vertiefung einer LabTek chambered Deckglas gleiten. Vorsichtig aufsetzen 3 bis 4 Embryonen in niedrig schmelzender Agarose und orientieren sie mit einer Pinzette in den Zellen, photoaktivierte nach unten gegen den Boden Deckglas werden. </li><li> Lassen Sie die Agarose zu verfestigen. Nach dem Erstarren Pipette 1 ml 1 X Danieau Medien über die Agarose. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 2,8 bis 2,9 für mehr Embryonen. </li></ol> 3. Zwei-Photonen-Aktivierung von caged Fluorescein-Dextran * Dieses Verfahren setzt voraus, dass der Embryo Reporter GFP zum Ausdruck bringt. Der Embryo wird eine Anzeige mit dem Argon-Ionen-(488 nm) Laserquelle an der LSM 510 META NLO-Mikroskop. Ein einzelner GFP positive Zellen ausgewählt und photoaktivierte mit dem Mai Tai Laser (Femtosekundenlaser) gekoppelt, um die LSM 510. Das Verfahren ist das gleiche für nicht-fluoreszierenden Embryonen. Alternativ kann weißes Licht verwendet, um die Zelle aktiviert werden, durch die Aktivierung mit dem Mai Tai Laserquelle gefolgt zu finden. <ol><li> Laden Sie das LSM 510 Software. Legen Sie ein transparentes Gelb-Filter in das weiße Licht Strahlengang. </li><li> Wählen Sie Neues Bild scannen und klicken Sie auf Start Expert Mode. </li><li> Wählen Sie die Registerkarte Laser. Schalten Sie den Argon-Ionen-(488 nm) und Mai Tai (Femtosekunden) Laserquellen. </li><li> Stellen Sie die Mai Tai Wellenlänge von 740 nm auf. </li><li> Wählen Sie die Registerkarte Konfiguration. Setzen Sie den Lichtweg-Konfiguration für den Argon-Ionen und Mai Tai-Laser. </li><li> Wählen Sie die Registerkarte Scannen. Ändern Sie das Ziel, 20X/0.8. </li><li> Stellen Sie die max Scan-Geschwindigkeit, indem Sie max. </li><li> Set Mode, Methode und Anzahl an Line, Mean, und 1. </li><li> Unter der Registerkarte Kanäle deaktivieren Sie alle Laserquellen mit Ausnahme des Mai Tai. </li><li> Legen Sie eine Power-Meter in den optischen Strahlengang. </li><li> Wählen Sie das Cont-Taste, um kontinuierliche Abtastung aktivieren. </li><li> Passen Sie die Übertragung% bis zum Power-Meter liest eine mittlere Laserleistung von 47 mW. </li><li> Stoppen Sie den Scan, indem Sie die Stopp-Taste. </li><li> Unter der Registerkarte Kanäle deaktivieren Sie das Mai Tai Laserquelle und wählen Sie die Argon-Ionen-(488 nm). </li><li> Wählen Sie die Schnelle xy-Taste. Unter der Registerkarte Kanäle Einstellung der Lochkamera, Detektor Gain, Verstärker-Offset und Verstärkung des Verstärkers für die Argon-Ionen-Laser, um die beste Bildqualität zu erzielen. </li><li> Mit dem Stufen-Regler, finden und sich auf die Zelle zu aktivieren. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche Stop. </li><li> Mit dem Zoom-Werkzeug, zoomen Sie auf die aktivierte Zelle, bis Sie den Zoomfaktor unter der Registerkarte Modus zeigt von 50 bis 70. </li><li> Stoppen Sie den Scan, indem Sie die Stopp-Taste. </li><li> Unter der Registerkarte Kanäle deaktivieren Sie die Argon-Ionen-Laser (488 nm) und wählen Sie die Mai Tai-Laser. </li><li> Unter der Registerkarte Modus stellen Sie die Scan-Geschwindigkeit bis 31,46 sek. </li><li> Wählen Sie die Ein-Knopf, um die Suche nach Zwei-Photonen-Aktivierung von caged Fluorescein-Dextran der ausgewählten Zelle zu beginnen. </li><li> Nach der Aktivierung, deaktivieren Sie das Mai Tai Laser unter der Registerkarte Kanäle, und wählen Sie erneut die Argon-Ionen-Laser (488 nm). </li><li> Stellen Sie den Zoom-Faktor unter-Modus auf 1, und klicken Sie auf den Max-Taste unter dem Speed-Überschrift zu den schnellsten Scan-Geschwindigkeit eingestellt. </li><li> Wählen Sie Fast-xy, die photoaktivierte Region zu überprüfen. Prüfen Sie, ob die photoaktivierte Region nicht Lasers abgetragen. Für weitere Informationen über Laser-Ablation, entnehmen Sie bitte dem Abschnitt Diskussion. </li><li> Wiederholen Sie die obigen Schritte für andere Embryonen. </li></ol> 4. Immundetektion von uncaged Fluorescein-Dextran (nach Lit. 16). <ol><li> Nach photoativation, legen Sie ein transparentes Gelb-Filter vor der weißen Lichtquelle und manuell entfernen jedem Embryo aus niedrig schmelzender Agarose mit scharfen Zangen. Legen Sie alle entfernt Embryonen in eine neue Petrischale mit frischem 1 X Danieau Medien. Deckel der Petrischale mit Metallfolie, um die Exposition von Embryonen, um Licht zu verhindern. </li><li> Falls erforderlich, hinten die Embryonen, um die gewünschte Entwicklungsstadium. In der Zwischenzeit bereiten 4% Paraformaldehyd-Lösung (siehe Herstellung von Lösungen). Aliquot von 1,5 ml der vorbereiteten Paraformaldehyd in ein Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Nach den Embryonen der Entwicklungsphase von Interesse erreicht haben, Pipette die Embryonen in die Mikrozentrifugenröhrchen (aus Schritt 4.2). Decken Sie die Röhrchen mit Metallfolie, um Lichteinwirkung zu verhindern. </li><li> Nutation das Rohr über Nacht bei 4 ° C. Für den nächsten Tag vorzubereiten Ethanol (EtOH)-Lösungen in Phosphatpuffer (PBS) und ddH 2 O benotet, 30% EtOH: PBS, 50% EtOH: PBS, 70% EtOH: ddH 2 O und 100% EtOH. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie den Embryonen von 4 ° C. Entfernen Sie die Metallfolie für die Röhre und schnell absaugen Abs.formaldehye (hinterlässt ein kleines Volumen, das genug, um die Embryonen Abdeckung). Pipette 1,5 ml 30% EtOH: PBS in die Röhre. Re-Cover das Rohr mit einer Metallfolie. Nutation der Röhre bei Raumtemperatur für 10 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.5 mit 50, 70 und 100% eingestuft EtOH-Lösungen. Nach der 100% EtOH waschen, spülen die Embryonen wieder in 100% EtOH für 10 min. </li><li> Nach dem Waschen, speichern Sie die Embryonen über Nacht bei -20 ° C. Für den nächsten Tag vorzubereiten phosphatgepufferte zwischen (PBT, siehe Herstellung von Lösungen), 5 X Blocking-Puffer (siehe Herstellerangaben Protokoll für Vorbereitung), Maleinsäure (Protokoll für die Herstellung in den Blocking-Puffer-Protokoll gefunden werden), 10 mg / ml Proteinase K und 10 X-Antikörper-Lösung (Anti-Fluorescein-AP, siehe Herstellung von Lösungen). </li><li> Auch für das 2% Lamm Serum (LS, siehe Herstellung von Lösungen) in PBT verdünnt. Shop der Antikörper bei 4 ° C über Nacht unter Schütteln auf einer Kolbenpendel. Die 2% LS kann bei 4 ° C aufbewahrt werden </li><li> Am nächsten Tag nehmen Sie die Embryonen von -20 ° C. Entfernen Sie die Metallfolie für die Röhre und schnell absaugen 100% EtOH. Fügen Sie 1,5 ml 70% EtOH: ddH 2 O, um das Rohr. Re-Cover das Rohr mit einer Metallfolie. Nutation der Röhre bei Raumtemperatur für 10 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.8 Verwendung 50 und 30% eingestuft EtOH-Lösungen, und 100% PBT. Nach der 100% PBT waschen, spülen die Embryonen noch 3 mal in 100% PBT für 10 Minuten. </li><li> Wenn die Embryonen älter als 24 Stunden sind, behandeln Proteinase K ihnen. Wenn nicht, fahren auf 4,13 Schritt. Um dies zu tun, verdünnte die vorbereitete Proteinase K (Schritt 4.7) 1:1000 in PBT. Inkubieren Sie die Embryonen in Proteinase K für 10 Minuten oder länger, wenn die Embryonen älter sind. Halten Sie die Embryonen mit Metallfolie abgedeckt, um Lichteinfall zu verhindern. </li><li> Nach Proteinase K-Behandlung, waschen Sie die Embryonen 5 Mal in PBT für 10 Minuten. Nach dem Waschen, fix die Embryonen in 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Kolbenpendel. Danach sofort abwaschen die Embryonen 5 Mal in PBT für 10 Minuten. Halten Sie die Embryonen mit Metallfolie abgedeckt, um Lichteinfall zu verhindern. </li><li> Machen Blockierungspuffer durch Verdünnen von 5 X Blockierungspuffer in Maleinsäure-Puffer auf 1 X. Nehmen Sie den Embryonen aus PBT und legen Sie sie in 1 X Blockpuffer. Decken Sie die Embryonen mit Metallfolie und Nutation sie bei Raumtemperatur für 5 bis 6 Stunden. </li><li> Nach 5 bis 6 Stunden blockiert, Hitzeschockprotein die Embryonen bei 65 ° C für 15 bis 20 Minuten. </li><li> Besorgen Sie sich die Antikörper-Lösung und die 2%-LS vorbereitet vom Vortag. Centrifuge der Antikörper-Lösung bei maximaler Drehzahl. Übertragen Sie die wässrige Phase, die 2% LS Röhre. Das Röhrchen zu mischen. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen aus Blocking-Puffer in die LS-Antikörper-Gemisch. Halten Sie die Embryonen mit Metallfolie abgedeckt, um Lichteinfall zu verhindern. Nutation die Embryonen bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag waschen die Embryonen bei Raumtemperatur 6 mal für 15 Minuten in PBT. Bereiten Sie AP-Puffer (siehe Herstellung von Lösungen). </li><li> Waschen Sie die Embryonen bei Raumtemperatur 2 mal für 10 Minuten in AP-Puffer. Bereiten NBT / BCIP entwickelt Lösung (siehe Herstellung von Lösungen). </li><li> Übertragen Sie die Embryonen NBT / BCIP. Lassen Sie den Fleck in der Dunkelheit zu entwickeln. </li><li> Stoppen Sie die Entwicklung durch das Waschen der Embryonen 3 mal in PBT für je 5 min. </li><li> Für Bildaufnahme montieren die Embryonen in 0,6% niedrig schmelzender Agarose oder 3% Methylcellulose, und Bilder aufzunehmen, mit einem umgekehrten oder aufrechten zusammengesetzte Mikroskop. </li><li> Photoactivated Proben können zur späteren Analyse (Färbung stabil bleibt) durch Dehydratisierung von ihnen in einer abgestuften EtOH waschen gespeichert werden. Folgen Sie den Schritten 4,4 bis 4.7 zur Dehydratisierung der Proben. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Photoaktivierung von caged Fluorescein-Dextran. (A, B) Hellfeld-und Fluoreszenz-Bild einer Seitenansicht Zebrafisch Embryo im Stadium vor 13/14-somite Photoaktivierung. (C, D) Der Embryo bei the13/14-somite Bühne war in einer der Somiten (Pfeil) mit einer Wellenlänge von 740 nm photoaktivierte, Scan-Zeit von 31 Sekunden beendet, und eine mittlere Laserleistung von 47 mW. Post-Aktivierung, (d) Fluoreszenz von uncaged Fluorescein-Dextran beobachtet wird. Orientierung: Dorsal (rechts), Ventral (links). Maßstabsbalken 100 um. <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Immundetektion von Fluorescein-Dextran Käfig. Abbildung 2 zeigt die Immunfärbung uncaged Fluorescein-Dextran in einem 18/19 hpf Zebrafischembryo. An der 10-Somiten-Stadium eine kleine Region des Embryos wurde in den seitlichen Mesoderm mit dem gleichen Laser-Parameter in Abbildung 1 angegeben aktiviert. Mit dem Verfahren Immundetektion, identifiziert den Pfeil der aktivierten Region mit minimaler Hintergrundfärbung. Orientierung: Dorsal (oben), Ventral (unten). Maßstabsbalken 100 um.

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	<li>Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mEosFP-based+green-to-red+photoconvertible+subcellular+probes+for+plants.">mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants.</a> Plant physiology. 154, 1573-1587 .</li><li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).</li><li>Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature. 6, 153-159 (2009).</li><li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein.">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature protocols. 1, 960-967 (2006).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).</li><li>Watanabe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-organelle+tracking+by+two-photon+conversion.">Single-organelle tracking by two-photon conversion.</a> Optics express. 15, 2490-2498 (2007).</li><li>Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+embryonic+blood+in+zebrafish:+multi-+and+unipotential+lineages+are+segregated+at+gastrulation.">Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation.</a> Developmental cell. 16, 744-755 (2009).</li><li>Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindling+fluorescent+proteins+for+precise+in+vivo+photolabeling.">Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling.</a> Nature. 21, 191-194 (2003).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).</li><li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos.">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model.">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li><li>Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gridlock+signalling+pathway+fashions+the+first+embryonic+artery.">Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery.</a> Nature. 414, 216-220 (2001).</li><li>Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+progenitor+for+haematopoietic+and+endothelial+lineages+in+the+zebrafish+gastrula.">A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula.</a> Nature. 443, 337-339 (2006).</li><li>Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Labeling+of+Zebrafish+Cells+with+Laser+Uncagable+Fluorescein+Dextran.">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran.</a> J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).</li><li>Niemz, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , (2003).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+and+gene+expression.">Analysis of protein and gene expression.</a> Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

<html> Dieses Papier beschreibt eine vielseitige Methode für einzelne Zelle Schicksal Zuordnung auf dem Photoaktivierung von caged Fluorescein-Dextran basiert. Uncaging von caged Fluorescein-Dextran in einzelnen Zellen erfolgt mittels Zwei-Photonen-Absorption aus einem Mai Tai Femtosekundenlaser gekoppelt an die Zeiss LSM 510 META konfokalen Mikroskop. Uncaged Fluorescein-Dextran in photoaktivierte Zellen schnell visualisiert mit Hilfe eines einfachen Verfahrens Immunhistochemie. In diesem Protokoll werden die Zwei-Photonen-Absorption Wellenlänge für Photoaktivierung von caged Fluorescein-Dextran 740 nm. Diese Wellenlänge wurde experimentell durch photoaktivierenden caged Fluorescein-Dextran injiziert Wildtyp Embryonen bestimmt. Die Anregungswellenlänge des Lasers wurde von 600 bis 800 nm variiert, und das Vorhandensein oder Fehlen von Fluorescein-Fluoreszenz post-Aktivierung wurde qualitativ bestimmt. Wir fanden, dass 740 nm am stärksten Fluorescein-Signal nach der Aktivierung erzeugt. Idealerweise sollte 740 nm für alle Modell-Systemen arbeiten, aber wir raten Testen einer Bandbreite von Wellenlängen, um die optimale Zwei-Photonen-Anregungswellenlänge für Ihre Probe zu bestimmen. In Käfigen Fluorescein-Dextran injiziert Wildtyp Embryonen, für jeden Zwei-Photonen-Anregungswellenlänge testeten wir auch variiert die durchschnittliche Laserleistung. Für eine Anregungswellenlänge von 740 nm, eine mittlere Laserleistung von 47 mW erzeugt eine stärkere Fluorescein-Signal an der aktivierten Region im Vergleich zur durchschnittlichen Laserleistungen zu senken. Höhere durchschnittliche Laserleistungen nicht produzieren stärkere Fluorescein-Signale, sondern induzierte Ablation des Gewebes. Da Femtosekunden-Laserpulsen bei Ablation von biologischem Gewebe 15 sind effiziente, empfehlen wir die Bestimmung der Schwelle mittlerer Laserleistung für Photoaktivierung, dass Gewebeablation vermeidet. Zwei-Photonen-Absorption liegt in einem kleinen Volumen Interaktion. Um eine ordnungsgemäße Aktivierung von caged Fluorescein-Dextran, muss die Zelle in die richtige Fokus gebracht werden. In dem obigen Protokoll wurden GFP-positiven Zellen gleichzeitig unter weißem Licht abgebildet, um Zell-Fokus zu bestätigen. Daher ist weißes Licht Übernahme zusätzlich zu den anderen Kanälen sinnvoll. Nach der Bestätigung Zelle zu konzentrieren, schlägt unser Protokoll Vergrößerungsglas der aktivierten Zelle. Ein Zoomfaktor von 50 bis 70 vorgeschlagen wird, hängt jedoch von diesem Wert auf die Größe der ausgewählten Zelle. Die Erhöhung der Zoom-Isolate der aktivierten Zelle von benachbarten Zellen, und die Grenzen der Scan-Bereich für Zwei-Photonen-Aktivierung. Idealerweise sollte der Scan-Bereich decken einen großen Bereich der Zelle. Detektion von einzelnen aktivierten Zellen erfordert, dass die Hintergrundfärbung minimal sein. In der oben Immundetektion Protokoll ist es wichtig, dass die Probe in Blocking-Puffer für 5 bis 6 Stunden (Schritt 4,13) blockiert ist. Bei der Entwicklung mit NBT / BCIP, uncaged Fluorescein-Dextran sollte sichtbar in 10 bis 20 Minuten. Wenn Hintergrundfärbung stark ist, schlagen wir vor, eine längere Sperrzeit und zusätzliche Wäschen an den Antikörper (Schritt 4,17) zu entfernen. Abbildungen 1 und 2 liefern repräsentative Ergebnisse Photoaktivierung und Immundetektion. In Abbildung 1, Anfang der 1 - bis 2-Zell-Stadium Wildtyp Embryonen wurden mit caged Fluorescein-Dextran injiziert. Die Embryonen wurden bis Mitte Somitogenese angehoben und montiert in niedrig schmelzender Agarose in die seitliche Ausrichtung. Abbildung 1 (a, b) zeigen Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder des Embryos vor Photoaktivierung. Der Nachweis, dass der Embryo uncaged geblieben ist, ist durch das Fehlen von Fluorescein-Fluoreszenz in Abbildung 1 (b) gezeigt. Eine kleine Region innerhalb eines Somiten wurde mit einer Wellenlänge von 740 nm für 31 Sekunden mit einer mittleren Laserleistung von 47 mW, Abbildung 1 (, Pfeil c) aktiviert. Post-Aktivierung, Zwei-Photonen-Uncaging von Fluorescein-Dextran aufgetreten, als durch die Fluoreszenz von den aktivierten Bereich, Abbildung 1 (d; Pfeil). Die Aktivierung war nicht durch Laserablation begleitet, da die somitic Gewebe intakt geblieben, Abbildung 1 (c). Abbildung 2 zeigt die Immundetektion von uncaged Fluorescein-Dextran. Eine kleine Region im lateralen Mesoderm eines 10-Somiten-Stadium Embryo photoaktivierte mit dem gleichen Laser-Parameter wie in Abbildung 1 erwähnt. Der Embryo wurde erhoben und verarbeitet unter Verwendung der Schritte 4.1 bis 4.20. Der Pfeil in Abbildung 2 lokalisiert die Region aktiviert, da durch die Ansammlung von blauen Niederschlages angezeigt. Nur die aktivierten Lage ist klar, ohne störende Hintergrundfärbung erkannt. Herstellung von Lösungen: 1 X PBT (1 L) 100 ml 10 X PBS 2 g BSA 10 ml 20% Tween 10 X PBS (1 L) 80 g NaCl 2 g KCl 6,1 g Na 2 HPO 4 1,9 g KH 2 PO 4 ddH 2 O auf 1 L pH auf 7,3 4% Paraformaldehyd (160 ml) 32% Paraformaldehyd (zwei 10-ml-Fläschchen) 8 mL 20 X PBS 132 ml ddH 2 O jove_content &quot;&gt; AP-Puffer (50 mL) 1 mL 5 M NaCl 2,5 ml 1 M MgCl 2 5 mL 1 M Tris pH 9,5 250 ul 20% Tween 41,25 mL ddH 2 O Antikörper-Lösung (für 1 Probe) 5,5 ul Aceton Pulver 40 ul PBT 0,8 ul LS 0,1 ul Anti-Fluorescein-AP-Antikörper 2% LS (360 ul für 1 Probe) 7,2 ul 100% LS 352,8 ul PBT 1 X Danieau Medien (1 L) ‡ 11,6 ml 5 M NaCl 700 ul 1 M KCl 400 ul 1 M MgSO 4 600 ul 1 M Ca (NO 3) 2 5 mL 1 M HEPES ddH 2 O auf 1 L pH auf 7,6 einstellen ‡ Danieau ist eine ideale Salzlösung für die Aufzucht dechorionated Zebrabärblinge. Andere Medien verwendet werden können, vorausgesetzt, sie sind isotonische Lösungen mit richtig Osmolarität (~ 300 mOsm für Zebrafisch) NBT Lager (1 ml) 50 mg Nitro Blue Tetrazolium 0,7 ml Dimethylformamid Anhydrid 0,3 ml ddH 2 O BCIP Lager (1 ml) 50 mg 5-Brom-4-Chlor-3-indolylphosphat 1 mL Dimethylformamid Anhydrid NBT / BCIP Entwicklerlösung 1 mL AP-Puffer 4,5 ul NBT Lager 3,5 ul BCIP Lager Acetonpulver <ol><li> Wählen Sie 20 ausgewachsene Fische und frieren sie in flüssigem Stickstoff. </li><li> Grind der gefrorenen Fisch mit einem Mörser und Stößel, um ein Pulver. </li><li> Übertragen Sie die Fische Pulver in ein 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Füllen Sie den konischen Rohr mit 100% Aceton. Vortex die Röhre. </li><li> Drehen Sie das Rohr bei max rpm für 10 Minuten. Überstand verwerfen. </li><li> Waschen des Pellets noch 3-mal in 100% Aceton und drehen Sie das Rohr bei max rpm für 10 Minuten. Mit dem letzten Waschgang der Überstand sollte klar. </li><li> Add 100% Aceton, das Pellet wieder und lassen das Rohr bei Raumtemperatur stehen gelassen. Je dichter Teilchen entscheiden wird, während die feineren Partikel in der Schwebe bleiben. </li><li> Dekantieren die feinen Partikel in eine neue Röhre. Aliquot des Pulvers Lösung in getrennten Röhren und lagern Sie sie bei -20 ° C. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> CMNB-caged Fluoreszein SE </td><td> Invitrogen </td><td> C20050 </td></tr><tr><td> 10 kDa Aminodextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1860 </td></tr><tr><td> Zeba Desalt Spin Column </td><td> Durchstechen </td><td> 89889 </td></tr><tr><td> Low Agarose </td><td> Amresco </td><td> 0815-100G </td></tr><tr><td> Natriumborat </td><td> Amresco </td><td> 1131117-100G </td></tr><tr><td> Tricaine Methylsulfonat / MS222 </td><td> Research Organics </td><td> 1347A </td></tr><tr><td> Anti-Fluorescein-AP </td><td> Roche </td><td> 11376622 </td></tr><tr><td> Blocking-Puffer </td><td> Roche Applied Sciences </td><td> 11 096 176 001 </td></tr><tr><td> Maleinsäure </td><td> Sigma </td><td> MO375-500G </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15714 </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Sigma </td><td> I8377-250mg </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> Fischer Scientific </td><td> PI-34040 </td></tr><tr><td> Mikroinjektor </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-2000 </td></tr><tr><td> LabTek chambered Deckglas Dias </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 155380 </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Invitrogen </td><td> AM2544 </td></tr><tr><td> Lamb Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 16070096 </td></tr><tr><td> LSM 510 META NLO </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> 20X 0,8 NA Air apochromatische Ziel </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Transparente Gelbfilter </td><td> Theatre House Inc. </td><td> Roscolux Filterschicht Farbe: 312 </td></tr></tbody></table>

single cell fate mapping in zebrafish

Die Fähigkeit, differenziert label Einzelzellen hat wichtige Auswirkungen in der Entwicklungsbiologie. Zum Beispiel bestimmen, wie hämatopoetischen, lymphatischen und Blutgefäß-Linien in sich entwickelnden Embryonen entstehen erfordert Schicksal Mapping und Abstammung Verfolgung von undifferenzierten Vorläuferzellen. Kürzlich photoaktivierbaren Proteine, die zählen: haben Eos 1, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, pKindling 8 und KikGR 9, 10 breites Interesse als Zell-Tracing-Sonden aufgenommen. Das Fluoreszenzspektrum von diesen lichtempfindlichen Proteine ​​lassen sich mit UV-Anregung umgewandelt werden, so dass eine Population von Zellen aus benachbarten unterscheiden. Allerdings kann die photoefficiency des aktivierten Protein Grenze langfristige Zelltracking 11. Als Alternative zu photoaktivierbaren Proteine ​​hat caged Fluorescein-Dextran weithin in Embryo-Modell Systeme 7, 12-14 verwendet. Traditionell zu Uncage Fluorescein-Dextran, UV-Anregung aus einem Fluoreszenz-Lampe Haus oder ein einzelnes Photon UV-Laser verwendet wurde, jedoch begrenzen solchen Quellen die räumliche Auflösung der Photoaktivierung. Hier berichten wir über ein Protokoll, das Schicksal Karte, Linie zu verfolgen und erkennen einzigen markierten Zellen. Einzelne Zellen in Embryonen mit caged Fluorescein-Dextran injiziert werden mit Nahinfrarot-Laser-Pulsen aus einem Titan-Saphir-Femtosekundenlaser erzeugt photoaktivierte. Dieser Laser ist in allen Zwei-Photonen konfokalen Mikroskopen wie dem LSM 510 META NLO-Mikroskop in diesem Dokument verwendet üblich. Da biologisches Gewebe ist transparent für Nah-Infrarot-Bestrahlung 15 kann die Laserpulse tief im Inneren des Embryos ausgerichtet sein, ohne Uncaging Zellen oberhalb oder unterhalb der ausgewählten Bildebene. Daher ist nicht-lineare Zwei-Photonen-Absorption nur im geometrischen Mittelpunkt bewogen, Fluorescein-Dextran in einer einzigen Zelle Uncage. Zum Nachweis der Zelle mit uncaged Fluorescein-Dextran, beschreiben wir eine einfache immunhistochemischen 16 bis schnell visualisieren activated cell. Die Aktivierung und Detektion Protokoll in diesem Beitrag vorgestellte ist vielseitig und kann zu jedem Modell aufgebracht werden. Hinweis: Die Reagenzien werden in diesem Protokoll kann in der Tabelle am Ende des Artikels angehängt gefunden werden.

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Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Eine Methode ist beschrieben, um einzelne Zellen mit einem Käfig fluoreszierenden Proteins mit Zwei-Photonen-Absorption aus einer Ti photoaktivieren: Sapphire Femtosekunden-Laser-Oszillator. Um das Schicksal der Karte photoaktivierte Zelle, ist die Immunhistochemie verwendet. Diese Technik kann auf jeden Zelltyp angewendet werden.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Aufrufe.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Eine Methode ist beschrieben, um einzelne Zellen mit einem Käfig fluoreszierenden Proteins mit Zwei-Photonen-Absorption aus einer Ti photoaktivieren: Sapphire Femtosekunden-Laser-Oszillator. Um das Schicksal der Karte photoaktivierte Zelle, ist die Immunhistochemie verwendet. Diese Technik kann auf jeden Zelltyp angewendet werden.

Serie: Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Forschung

Biologie

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark und Track Cells In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Generierung von Dispersed präsomitischen Mesoderm Zellkulturen für Imaging der Zebrafisch-Segmentierung Uhr in Einzelzellen

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Identifizierung von MyoD Interaktom Gekoppelt Mit Tandem Affinity Purification zu Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...