Research in Die Spagnoli Labor. wird von der Helmholtz-Gemeinschaft, FP7-IRG-2008-ENDOPANC Zuschuss und ERC-2009-Ab HEPATOPANCREATIC Stipendium finanziert.

Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Technik, die ursprünglich in Percival und Slack 9 beschrieben und optimiert für die konfokale Mikroskopie angepasst. Ein. Beschichtung von Glass Bottom Kultur Dishes Die folgenden Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank durchgeführt werden. <ol><li> Pancreatic Explantate werden in 35-mm-Petrischalen mit 20-mm Durchmesser Glas Mikrowell Boden (zB MatTek Corporation) kultiviert. Verwenden Sie ein Glasboden Gericht pro Explantat Kultur und für die gesamte Dauer der Kultur. Am Tag vor der Präparation und Isolierung der Pankreas Knospen, beschichten Glasboden Vertiefungen, die mit Fibronektin. </li><li> Verdünnen sterile Fibronektin in Zellkultur-grade Wasser zu einer 50 ug / ml Endkonzentration und fügen Sie eine minimale Lautstärke von ihm (~ 150 ul) in der 20-mm Mikrotiter der MatTek Platten über die gesamte Glasfläche (1E). Die Schalenin einem 4 ° C Kühlschrank für Übernacht-Inkubation. </li><li> Am Tag der Dissektion absaugen Fibronektin, spülen Sie die Mikrotiterplatten mit Zellkultur-grade Wasser und ein Mindestvolumen von 150 ul BME (Basal Medium Eagle) Medium mit Pen / Strep (1%), Glutamin (1% ergänzt ) und 50 ug / ml Gentamicin [Dissection Medium]. Lassen Sie die beschichteten Platten in der Laminarströmungshaube bis zu seiner Platte die Explantate. </li></ol> Wenn nicht alle Fibronektin-beschichteten Schalen verwendet werden, können diese gespeichert werden für bis zu 1 Woche bei 4 ° C. Lassen Sie sich nicht die Gerichte trocknen, füllen sie mit Dissection Medium und legen Sie sie in den Kühlschrank stellen. Neben Fibronektin wurden Pankreas Explantate wurden erfolgreich auf verschiedenen Substraten, wie Laminin 9, Matrigel 10,11 oder mikroporösen Membranen 12 kultiviert. Wegen ihrer Auswirkungen auf Verzweigungen, verwenden wir Fibronektin 9 als Substrat. 2. Dissection von DØrsal Pancreatic Bud E11.5 - E12.5 Maus Embryonen <ol><li> Zeitgesteuerten-schwangeren weiblichen Mäusen während der embryonalen Tag (E) 11,5 oder 12,5 geopfert und Embryonen werden gesammelt, indem Sezieren Instrumenten zuvor mit 70% Ethanol gereinigt. Legen Sie die seziert Gebärmutter in 10-cm-Platten mit eiskaltem PBS mit 50 ug / ml Gentamicin ergänzt. </li><li> Unter einem Stereomikroskop mit Beleuchtung von oben, separate der Gebärmutter in einzelne Embryo Segmenten mit kleinen Schere oder Dumont Pinzette vorsichtig abziehen dem Muskel der Gebärmutter und entfernen Sie die einzelnen Embryonen, die durch die decidua umgeben sind. Verwenden Sie Standard-Embryos Präparation Techniken 13 um die Embryonen zu entlarven und entfernen Sie den Dottersack und Amnion. Anschließend Entfernen des Oberkörpers des Embryos (oberhalb der Leber) und der Schwanzbereich. Dies ermöglicht Exposition der inneren Organe (1B). Übertragen der Mittelkörper der Embryonen in 10-cm-Platten mit eiskaltem BME Dissektion Medium. </li><li> JetztVerwenden Sie nur Durchleuchtung von unten zu visualisieren und zu den dorsalen Pankreas Knospe unter dem Stereomikroskop sezieren. Sanft, öffnen Sie die Mitte Körper des Embryos, indem Sie einen seitlichen Einschnitt mit einer Pinzette. Suchen Sie den Magen und die Milz. Die dorsale Pankreas Knospe ist seitlich an dem hinteren Bereich des Magens (1C) befestigt. Mit Dumont Pinzette, sezieren entfernt die dorsale Pankreas Knospe von benachbarten Strukturen, wie der Magen und Milz, aber verlassen einige Mesenchym um die Epithel (Abbildung 1D). Mit einem Glas Pasteurpipette, übertragen die isolierte Keim in eine 35-mm-Petrischale mit kaltem BME Dissektion Medium mit 10% fötalem Kälberserum [Kultur Medium] ergänzt. Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Pankreas isoliert sind. Wenn Bauchspeicheldrüsen von verschiedenen Genotypen isoliert sind, bewahren Sie diese getrennt mit Nunc 4-Well-Platten. </li></ol> 3. Plating und Kultur Pancreatic Explantate Finale platten der Explantate erfolgt in Gewebekultur Raum und / oder in unmittelbarer Nähe zu der Gewebekultur-Inkubator durchgeführt, um physische Bewegung der Kulturen zu minimieren. <ol><li> Unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube ersetzt die BME Dissection Medium in den fibronektinbeschichtete MatTek Gerichte mit ~ 150 ul BME Kulturmedium bei 37 vorgewärmt ° C. </li><li> Vorsichtig, übertragen Sie die Bauchspeicheldrüse Explantate in beschichteten MatTek Gerichte (ein Explantat pro Schale) für langfristige Kultur mit einem Glas Pasteur Pipette. Um sicherzustellen Ausbreitung während der Kultur kann die Mesenchym umgebenden Explantate leicht zerrissen werden, falls notwendig, mit einer feinen Nadel. </li><li> Sanft legen die Kulturen in einer Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für einige Stunden, bis die Explantate auf den Glasboden Vertiefungen anzubringen. Sobald sie gebunden sind, füllen die MatTek Gerichte mit 1,5 ml bis 2 ml BME Kulturmedium vorgewärmt bei 37 ° C. Der Tag der Dissektion wird als Tag 0 bezeichnet. </li><li> Mannipulation der pankreatischen Explantatkulturen wird unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank durchgeführt. Die BME Kulturmedium wird jeden zweiten Tag gewechselt, sofern experimentellen Anforderungen unterschiedlichen Zeitpunkten (z. B. Inkubation der Explantate mit chemischen Mitteln) diktieren. Die Explantate können in diesem Zustand für 5 Tage bis zu einer Woche kultiviert. </li></ol> 4. Whole-mount Immunfluoreszenz Färbeprotokoll für Pancreatic Explantate Alle Schritte des Immunfluoreszenz-Protokoll (ab Fixierung an Bildgebung) sind in der gleichen MatTek Gericht, das bessere Bilder liefert als ein Kunststoff-Boden versehenen Schale durchgeführt. Nach der Fixierung kann Pankreas Explantatkulturen daher keine unter sterilen Bedingungen gehalten werden. <ol><li> Absaugen BME Kulturmedium und waschen das Explantat einmal mit 2 ml 1X PBS. </li><li> Für Explantat Fixierung ersetzen PBS mit 2 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) und die Schale auf Eis für 20 min. Schwenken Sie die Platte vorsichtig von Zeit zuZeit, sondern vermeiden rocken Plattformen, wie das Explantat könnte zu lösen. </li><li> Entfernen PFA und waschen Sie die Explantat dreimal mit 2 ml 1X PBS für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Block mit 2 ml Blockierungslösung (PBS 1X + 0,1% Triton-X + 3% Serum Esel) für mindestens 30 min bei RT. </li><li> Verdünnte Primärantikörpers in Blockierungslösung und füge ~ 150 ul der Verdünnung direkt in das 20-mm Mikrovertiefung der MatTek Platten über die gesamte Oberfläche Explantat für eine Inkubation über Nacht bei 4 ° C. Um körperliche Bewegungen zu minimieren, fügen primären Antikörpers an den Explantaten direkt in den Kühlraum (4 ° C). Um Verdunstung zu verhindern, vor der Zugabe des Antikörpers, platzieren die MatTek Platten in einer feuchten Kammer inkubiert. </li><li> Am nächsten Tag Entfernen der Antikörper-Lösung und dreimal mit 2 ml 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) für jeweils 30 min bei RT. </li><li> Verdünnen sekundären Antikörper in Blockierungslösung [nach den Empfehlungen des Herstellers, wir benutzen Esel Alexa Fluor Farbstoffe sekundären antiGremien auf 1:750 verdünnt] und fügen Sie ~ 150 ul der Verdünnung direkt in der 20-mm Mikrotiter der MatTek Platten, die das gesamte Explantat Oberfläche, für 1-2 h Inkubation bei RT im Dunkeln. Für nukleare Gegenfärbung gehören Hoechst zusammen mit sekundären Antikörper Verdünnung. Um Verdunstung zu verhindern, vor der Zugabe des Antikörpers, platzieren die MatTek Platten in einer feuchten Kammer inkubiert. </li><li> Waschen dreimal mit 2 ml 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) für jeweils 30 min bei RT. </li><li> Vor der Montage, einmal abwaschen mit 1X PBS Tween-20 zu entfernen. Montieren, indem ein Tropfen wässrigen Medium (mit Anti-Fading) in den 20-mm Mikrotiter der MatTek Platten. Sanft, decken die Explantat mit einem Deckglas. Luftblasen vermeiden. </li><li> Explantate auf MatTek Platten können unter Standardbedingungen Phasenkontrastmikroskopie oder konfokalen Mikroskopie angesehen werden, abhängig von den Zielen des Experiments. Für die konfokale Mikroskopie Analyse verwenden wir ein Zeiss LSM 700 invertierten Einstellung. Richten Sie geeignete Laser für Fluorophore unsed.. Wählen Sie ein Ziel, das will Bild den gewünschten Bereich des Pankreas Explantat. Ein Wasser-10X Immersionsobjektiv geeignet ist, die gesamte Explantat in dem Sichtfeld zu halten. A 40X Wasser-oder Öl-Immersions-Ziele sind geeignet, um auf spezifische Bereiche des Pankreas Explantats mit einer höheren Auflösung zu konzentrieren. Die Explantate kann optisch geschnitten und dann die erworbenen Z-Stapel rekonstruiert in 3D, mit der entsprechenden Software. </li></ol> 5. Live-cell Imaging Protokoll von Bauchspeicheldrüsenkrebs Explantate <ol><li> Klimakammer Setup: Verwenden Sie eine Schutzgehäuse und eine kleine Inkubationskammer [mit Temperatur-und CO 2-Regelung], die auf dem Mikroskoptisch sitzt. Ordnungsgemäße Kultivieren der embryonischen Bauchspeicheldrüse erfordert eine stabile Temperatur von 37 ° C und einer kontrollierten Atmosphäre von befeuchteten 5% CO 2. Geeignete Räume sind von verschiedenen Herstellern erhältlich (ZB Zeiss, Nikon, Olympus). Montieren Sie die Heizung ein und schalten Sie ihn eint mindestens 1 Stunde vor Imaging startet, damit die Geräte zum Aufwärmen und Gleichgewicht CO 2-Gehalt von 5%. </li><li> Für Zeitraffer-Aufnahmen von Pankreas Explantatkulturen, verwenden wir einen Zeiss LSM 700 inversen Mikroskop. Für Laser und objektive Auswahl siehe Punkt 4.10. </li><li> Lassen Sie das Pankreas Explantat gut mit dem Glasboden-Teller legen, bevor die Live-Bildgebung. [Wir in der Regel live imaging ab Tag 1]. In einer Laminarströmungshaube absaugen und ersetzen Sie das Explantat Medium durch frisches BME Kulturmedium mit optimaler nährstoffarmen Bedingungen starten. </li><li> Übertragen Sie leicht die Explantate auf dem Mikroskop Zimmer und legen Sie die MatTek Gericht im Inkubationskammer in den Probenhalter des konfokalen Mikroskops. </li><li> Bereiten Sie das Ziel (z. B. fügen Öl oder Wasser-Medium nach der Wahl Immersionsobjektiv) und konzentrieren sich auf die Region von Interesse in dem Explantat. Schließen Sie die Klimakammer richtig. Um die Verdunstung während der Zeitraffer zu verhindernAkquisition mit Wasser-Immersions-Objektive, an Stelle von Wasser empfiehlt es sich, viskose Immersionsflüssigkeiten, die im Handel erhältlich sind (z. B. Zeiss Immersol W) verwenden. </li><li> Richten Sie Laserintensität, Z-Stapel Erfassungsparameter und Zeitintervall (siehe auch Beiträge zu Troubleshooting). Starten Sie das Experiment. </li><li> Nach der Bebilderung, Export Z-Stacks und allen Zeitpunkten und analysieren sie mit geeigneter Software (zB ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens). </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Dorsalen Pankreas Knospen (zusammen mit dem umgebenden Mesenchym) wurden aus Mausembryonen zwischen E11.5 und E12.5 und plattiert direkt am Glasboden Kulturschalen (Abbildung 1) seziert. Blutgefäße sind in dem Mesenchym umgebenden Epithel und visualisiert werden kann durch Immunfärbung für den endothelialen Marker PECAM 12 (Daten nicht gezeigt). Nach zwei Tagen der Kultur-, Bauchspeicheldrüsen-Explantaten underwent signifikanten Wachstum und begonnen, sich in verzweigte epithelialen Strukturen, deren Kerne waren positiv für den pankreatischen Transkriptionsfaktor Pdx1 (2A-C) anzuordnen. Die durchschnittliche Dicke der z-Pankreas-Explantate am Tag 3 der Kultur ist 60-80 um. Die Oberfläche und das Volumen der Explantate können unter Verwendung geeigneter Software (zB Huygens) werden. Morphologie und Immunfluoreszenz Analysen zeigten, dass Pankreas Explantate mit diesem Protokoll in vivo frühen pankreatischen Differenzierung und morphogenetischen Ereignisse 5,10,11,14 (Abbildung 2) rekapituliert kultiviert. Pancreatic Explantate am Tag 4 der Kultur erlebte typischen &quot;Spitze und Stamm&quot; Segregation des Epithels 8, Anzeige CPA1 + Vorläuferzellen an den Spitzen der epithelialen Filialen (2C) und differenzierten Insulin + und Glucagon + Zellen als Cluster im Kofferraum organisiert (Abbildung 2D ). Darüber hinaus ist die Bauchspeicheldrüsenc Epithel in den ex vivo Kulturen zeigten ordnungsgemäße Organisation des Cytoskeletts und Zellpolarität, mit apikalen Lokalisation von F-Aktin (Abbildung 2E, in grün) und b1-Integrin an den Basalmembranen (2E, in rot). (; Mausstamm ist am Jackson Laboratory mT / mg) (Abbildung 3) Pankreas Verzweigung in Echtzeit zu untersuchen, wurden embryonale Pankreas Explantate aus dem Dual-color fluoreszierenden Reporter Mausstamm membrane-Tomato/membrane-Green 15 isoliert. Standbilder aus einem Zeitraffer-Film mT / mg Pankreas Explantate in Kultur gezüchtet werden in Abbildung 3 dargestellt. Die Lokalisation des mT fluoreszierendes Protein an Membranstrukturen umreißt Zellmorphologie und ermöglicht Auflösung feiner zelluläre Prozesse, so dass die Zelle Umbau und Migration über die Zeit zu verfolgen. Nach einer 12-Stunden-Zeitraffer-Experiment mT Fluoreszenzsignal lebensfähig bleibt und VerschlechterungCTable, obwohl dessen Intensität reduziert wird, wahrscheinlich aufgrund Lichtschäden (Abbildung 3). Technische Lösungen zur Vermeidung oder Verringerung Lichtschäden und Phototoxizität sind in der Diskussion Abschnitt diskutiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des dorsalen Pankreas Knospe Dissektion von E12.5 Maus-Embryo. (A) Hellfeld Bild von E12.5 Maus-Embryo. Der Oberkörper des Embryos (oberhalb der Leber) und Heckbereich werden entfernt, um den mittleren Körper (B) zu isolieren. Die Schnitte werden durch rote gestrichelte Linien dargestellt. (C) Ferner Dissektion Ergebnissen der Exposition des Magens und Duodenums Region (angedeutet durch den gestrichelten Kasten). Die dorsale Pankreas Knospe (siehe roter gestrichelter Kreis) ist an der Basis des Magens und neben der Milz Primordium. Der seziert dorsalen Pankreas Knospe (D) mit einer Pasteurpipette in die Mikrotiterplatten von einem Glasboden Schale mit BME Kulturmedium (E transferiert, F). Abkürzungen: sto (Magen), sp (Milz), dp (dorsalen Pankreas Knospe), Duo (Zwölffingerdarm). Maßstabsbalken, 1000 um (A, C). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" /> Abbildung 2. Whole-mount konfokalen Immunfluoreszenz Analyse des Pankreas Explantatkulturen. (A) Hellfeld Bilder von Pankreas-Explantate am Tag 1 und Tag 2 von ex vivo Kultur. Red gepunktete Linie zeigt Einleitung Verzweigung des Epithel. (B) 3D-Rekonstruktion von whole-mount Immunfärbung für Pdx1 am Tag 3 Pankreas Kultur. Pancreatic Explantate zeigten Tubuli Pdx1 + Zellen, die eine umfangreiche Verzweigung um 48 hr der Kulturen. (C) Whole-Mount-Immunfärbung von Tag 3 Pankreas Explantat mit Antikörpern gegen den basolateralen Membran Marker E-Cadherin (ECAD), tip Vorläuferzellen Marker, Carboxypeptidase 1 (CPA1) und Phospho-Histon H3 (pHH3). Die meisten der mitotischen aktive pHH3 +-Zellen kolokalisiert an den peripheren Tipps mit CPA1 + Zellen. Gestrichelte lines anzuzeigen Spitze der Zweige. (D) Whole-Mount-Immunfärbung für endokrine Linie Marker, Insulin (Ins) und Glucagon (Gluca) am Tag 3. Gelbe Pfeile zeigen Cluster Ins + und Gluca + Zellen. Einsatz (D &#39;) mit höherer Vergrößerung von einer der endokrinen Zellen-Clusters. (E) Whole-Mount-Immunfärbung von Tag 3 Pankreas Explantat für Pdx1, β1 Integrin (β1int) und F-Aktin (Fact). Mesenchymale Zellen (Sternchen) unter Pdx1-positive Epithelzellen durchsetzt. Bilder in C, D und E dargestellt sind einzelne Abschnitte des konfokalen optischen Z-Reihe. Maßstabsbalken, 100 um (A, B); 50 um (CE). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter Live-Cell-Imaging von ex vivo kultivierten pankreatischen Explantat. (AD) Frames von einem Zeitraffer-Film eines Pankreas Explantat aus einer mT / mG Maus transgenen Embryos. Minute: Time of Imaging wird in Stunden angezeigt. Das Explantat wurde abgebildet ab Tag 1. Z-Stapel-Aufnahmenwurden mit einem 40X Ölimmersionsobjektiv alle 12 min für insgesamt 15 Stunden erfasst. Die gestrichelten Linien zeigen den Filialen und Grenze zwischen Epithel und Mesenchym kippen. Maßstab, 50 um.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Sobald pankreatischen Schicksal angegeben, durchlaufen Pankreas-Vorläuferzellen umfangreiche Proliferation, Differenzierung und Morphogenese zu bilden schließlich ein reifes und funktionalen Organs 2,4. Derzeit dauert, wie Verzweigen in der Bauchspeicheldrüse und wie es um Vorläuferzellen Proliferation und Differenzierung verbunden ist weitgehend unbekannt. Pancreatic Explantatkulturen stellen ein ideales System zur Aufklärung dieser Prozesse ex vivo 5,9,11. Durch die Kombination von ...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Antikörper: Carboxypeptidase E-Cadherin F-Actin Glucagon Insulin β1-Integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histon H3 </td><td> AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma Bank Zelluläre Signalübertragung </td><td> 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medium Eagle (BME) </td><td> Sigma </td><td> B1522-500ML </td><td> Kept unter sterilen Bedingungen </td></tr><tr><td> Zellkultur Wasser </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td&gt; <td> Kept unter sterilen Bedingungen </td></tr><tr><td> Kulturschalen (Glasboden), 35-mm- </td><td> MatTek Konzern </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr><tr><td> Donkey Serum </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ml </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Kälberserum Gold- </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td> Kept unter sterilen Bedingungen </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> Lager Sol. 1 mg / ml in Zellkultur-Wasser </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> Kept unter sterilen Bedingungen </td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> Kept unter sterilen Bedingungen </td></tr><tr><td> 4-well Multischalen </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskope: Inverted konfokalen Mikroskop (LSM 700) Stereomikroskop (Discovery V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> Ziele: C-Apochromat 10x / 0,45 W M27 (Arbeit. dist 1,8 mm;. Bildtiefe ~ 100 mm); C-Apochromat 40x / 1,2 W Korr M27 (Arbeit. dist 0,28 mm;. ~ Bildtiefe 50 um) Durchleuchtung von unten und Glasfaser-Beleuchtung von oben </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Roth </td><td> 0.335,3 </td><td> Stammlösung 20% </td></tr><tr><td> Pasteur Pipette (Glas), 150 mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td> Gehalten in sterile cEDINGUNGEN </td></tr><tr><td> Petrischalen, 60 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen, 35 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH 7,4 </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Kept unter sterilen Bedingungen </td></tr><tr><td> Federschere 8 mm Klinge gebogen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15023-10 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> Uhrmacher-foreceps Dumont # 5 </td><td> Roth </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas

Die Bauchspeicheldrüse steuert wichtige Funktionen unseres Körpers, einschließlich der Produktion von Verdauungsenzymen und Regulierung des Blutzuckerspiegels 1. Obwohl in den letzten zehn Jahren viele Studien zu einer festen Grundlage für das Verständnis der Bauchspeicheldrüse Organogenese beigetragen haben, bestehen große Lücken in unserem Wissen über frühe Bauchspeicheldrüse Bildung 2. Ein vollständiges Verständnis dieser frühen Ereignisse Einblick in die Entwicklung dieses Organs zu schaffen, sondern auch in unheilbaren Krankheiten, die die Bauchspeicheldrüse zielen, wie Diabetes oder Bauchspeicheldrüsenkrebs. Schließlich werden diese Informationen generieren Konzept für die Entwicklung Zell-Ersatz-Therapien im Rahmen des Diabetes. Während der Embryogenese, stammt die Bauchspeicheldrüse aus unterschiedlichen embryonalen Auswüchse der dorsalen und ventralen foregut Endoderm am embryonalen Tag (E) 9,5 im Maus-Embryo 3,4. Beide Auswüchse evaginate in das umgebende Mesenchym als feste Epithelienl Knospen, die Proliferation unterziehen, Verzweigung und Differenzierung eine ausgereifte Orgel 2,5,6 generieren. Jüngste Beweise haben vorgeschlagen, dass das Wachstum und die Differenzierung von Pankreas-Zelllinien, einschließlich der Insulin produzierenden β-Zellen, auf ordnungsgemäße gewebespezifischen Architektur, epitheliale Zelle Remodellierung und Positionierung innerhalb des Pankreas Epithel Verzweigungsmittel 7,8 abhängt. Doch wie Verzweigungen Morphogenese auftritt und mit der Proliferation und Differenzierung in der Bauchspeicheldrüse koordiniert ist weitgehend unbekannt. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass die derzeitigen Wissen über diese Entwicklungsprozesse bisher fast ausschließlich auf der Analyse von festen Proben herangezogen, während morphogenetischen Ereignisse hochdynamisch sind. Hier berichten wir über eine Methode zum Präparieren und Kultivieren von embryonalen Maus-Pankreas Knospen ex vivo am Glasboden Gerichte, die direkte Visualisierung der Entwicklung von Pankreas (Abbildung 1) zu ermöglichen. Dieser Kulture-System ist ideal für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie entwickelt und vor allem Live-Cell-Imaging. Pancreatic Explantate können nicht nur von Wildtyp-Maus-Embryonen hergestellt werden, sondern auch aus gentechnisch veränderten Mauslinien (zB transgenen oder Knockout), so dass Echtzeit-Studien von mutierten Phänotypen. Darüber hinaus ist diese ex vivo Kultursystem wertvolle um die Wirkungen von chemischen Verbindungen auf Bauchspeicheldrüsenentwicklung studieren, ermöglicht, um quantitative Daten über die Proliferation und das Wachstum, die Dehnung, Verzweigungsgrad, Tubulogenese und Differenzierung zu erreichen. Zusammenfassend stellt die Entwicklung eines ex vivo Pankreas Explantatkultur Methode mit hochauflösenden bildgebenden kombiniert eine starke Plattform für die Beobachtung morphogenetischen und Differenzierung Ereignisse, wie sie in den Entwicklungsländern Maus-Embryo auftreten.

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A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultur und Manipulation von embryonalen Maus Bauchspeicheldrüse. Dies stellt eine hervorragende<em&gt; Ex vivo</em&gt; System zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Bauchspeicheldrüse Entwicklung, einschließlich der Morphogenese, Differenzierung und Wachstum. Pankreas Knospe Explantate kann für mehrere Tage kultiviert werden und in einer Reihe von verschiedenen Anwendungen, einschließlich whole-mount Immunfluoreszenz und Live-Bildgebung.

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

13.6K Aufrufe.  Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultur und Manipulation von embryonalen Maus Bauchspeicheldrüse. Dies stellt eine hervorragende Ex vivo System zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Bauchspeicheldrüse Entwicklung, einschließlich der Morphogenese, Differenzierung und Wachstum. Pankreas Knospe Explantate kann für mehrere Tage kultiviert werden und in einer Reihe von verschiedenen Anwendungen, einschließlich whole-mount Immunfluores...

Serie: A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Ein System zur Kultivierung Iris Pigmentepithelzellen nach Lens Regeneration in Newt Study

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Ein 3D-System für Züchtung menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut-und-Live-Darstellung von Migration Melanoblasten

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Kultur-System, um Schilddrüsenentwicklungsstudie

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...