Die Autoren bedanken sich bei Dr. Deirdre Nelson für hilfreiche Kommentare und für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse DE019244, DE019197 und DE021841 um ML, F32DE02098001 um SJS und C06 RR015464 der University at Albany, SUNY finanziert.

Das Protokoll enthält vier wesentliche Schritte, wie in Abbildung 1 dargestellt. Alle Schritte werden ausführlich beschrieben. Adenovirus Konstruktion und viralen Reinigung sollte vor der Organraub zur Verwendung in der genetischen Transduktion seziert epithelialen Rudimente durchgeführt werden. Alle Standard-BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen sollten bei der Arbeit mit Adenoviren werden. Ein. Maus Embryonale submandibularis (SMG) Ernte und Mikrodissektion <ol><li> Einschläfern timed-schwangeren weiblichen Mäusen (Auszuchtstamm CD-1-oder ICR) mit CO 2 Narkose, durch Genickbruch und Ernte Saiten Maus-Embryonen am embryonalen Tag 13 (E13, 3-5 Epithelknospen) folgenden Verfahren durch den institutionellen IACUC zugelassen, gefolgt Ausschuss. Der Tag der vaginalen Plug Entdeckung wird als E0 bezeichnet. Speicheldrüsen können auch geerntet und auf dem E12 Bühne kultiviert werden, wenn es eine einzige primäre Knospe und Stiel mit Klüften gerade erst anfangenzu initiieren. SMGs vor diesem Zeitpunkt erfordern unterschiedliche Kulturbedingungen als die hier angegebenen. </li><li> Übertragen Embryos Strings in sterile 10 cm Zellkulturschalen mit 25 ml DMEM / Ham &#39;s F12 Medium (F12) fehlen Phenolrot (Life Technologies) und ergänzt mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (Pen-Strep gefüllt, Life Technologies). </li><li> Mit einem sterilen Skalpell (# 11 Klingen) und Pinzette (# 5, Fine Science Tools, 11252-20), entfernen Sie die Embryonen aus den Säcken in einem separaten 10 cm Schale mit 25 ml DMEM/F12 + Pen-Strep. </li><li> Sever die Embryos Köpfe mit einer abgewinkelten kurz unterhalb des Unterkiefers. </li><li> Isolieren Sie die unteren Kiefer aus den Köpfen unter einem Stereomikroskop Seziermikroskop mit einem Durchlicht Basis (Nikon SMZ645 oder gleichwertig) mit einem Schnitt unterhalb des Oberkiefers. Legen Sie die Gewebe auf der Oberseite eine zusätzliche Stück Glas anstatt direkt auf dem Glas Bestandteil des Mikroskops. </li><li> Sammeln Sie die unteren Kiefer in 3 ml DMEM/F12 + Pen-Strep in einem sterilen 35 mm Gewebekulturschale. </li><li> Platzieren eines Unterkiefers Scheibe auf dem Präpariermikroskop Stufe, so dass die Zunge auf der Unterseite der Scheibe ist, aber in Richtung der 12:00-Uhr-Position zeigt. </li><li> Mit einer Seite von zwei gekreuzten Pinzette in einem scissoring Bewegung, entfernen und entsorgen Sie die untere 1/3 rd des Unterkiefers Scheibe. </li><li> Drehen der Scheibe um 90 ° nach rechts (wenn rechtshändige) und, unter Verwendung eines scissoring Schnitt mit der Zange, schneiden den oberen Teil des Unterkiefers Scheibe (ohne Schneiden der Zunge) zur Hälfte in die Scheibe. </li><li> Ziehen Sie die überschüssige Gewebe entfernt und entfernen Sie die Maschinenpistolen unter aussetzen. Es wird eine an jeder Seite in der Nähe der Basis der Zunge liegen. </li><li> Mit einem Paar Pinzette halten das Gewebe durch die Zunge, verwenden Sie die anderen Pinzette, um die SMG necken weg von der Zunge. Wiederholen Sie dies für die anderen Drüse. </li><li> Sammeln Sie die mikrodissezierten Speicheldrüsen in 3 ml DMEM/F12 + Pen-Strep in eine neue sterile 35 mm Gewebe-Kulturschale. Hinweis: Die größeren submandibularis (3-5 Epithelknospen) zusammen mit dem angeschlossenen kleineren sublingualis (1 Knospe) kultiviert werden können intakt durch Überspringen zu Schritt 4 und Durchführen der Schritte 4,1, 4,3 und 4,4, wie zuvor beschrieben 2,8. </li></ol> 2. SMG Epithelial Rudiment Separation <ol><li> Platz 5 (oder mehr) Speicheldrüsen in einen Glasboden, Durchmesser 50 mm Mikrotiter Schale (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) mit 200 ul balanced salt Hank-Lösung (HBSS fehlt Ca + + oder Mg + +, Life Technologies) mit 0,4% (v / v) Dispase (Life Technologies, cat. Nr. 17105-041) und Inkubation für 15 min bei 37 ° C. </li><li> Nach der Inkubation mit einem sterilen 200 ul Pipettenspitze vorsichtig absaugen das Dispase-Lösung, ohne die Drüsen. Sofort im 200 ul DMEM/F12 Medium mit 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, mit einer 0,22 um Filter vorsterilisierten), um die Dispase neutralisieren. </li> &lt;li&gt; Unter einem Binokular mit einer Pinzette mit feinen Spitzen (# 5 Dumostar, Fine Science Tools, 11295-20), sanft trennen den gelösten Mesenchym aus der ganzen SMG Epithelknospen und Kanäle, wobei darauf zu verlassen, das Epithel intakt . </li><li> Pre-wet eine sterile 200 ul Pipettenspitze mit DMEM/F12-BSA Medien und vorsichtig pipettieren Sie die Epithelzellen Rudimente in eine neue 50 mm Durchmesser Mikrowell Schale mit 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep. Verwenden Sie ein hochwertiges 200 ul Pipettenspitze mit einem glatten Rand. </li><li> In der Schale, die Mesenchym Stücke enthält, verwerfen alle nicht-mesenchymale Gewebe einschließlich der sublingualen Drüsen und alle freistehenden submandibularis Knospen. </li></ol> 3. Adenoviralen Infektion Epithelial Rudiments <ol><li> Make 200 ul Virusinfektion Medien durch Verdünnen des Adenovirus von Interesse in DMEM/F12 + Pen-Strep und in ein Mikrozentrifugenröhrchen, so dass der Titer der resultierenden Lösung 1x10 8 -10 9 PFUs ist. Dieoptimale Titer für verschiedene Viren erforderlich kann variieren. Es ist wichtig, Cäsiumchlorid (CsCl)-gereinigte virale Zubereitungen zur optimalen Aufnahme Effizienz zu verwenden. </li><li> Entfernen Sie die Medien aus der Schüssel mit den fünf epithelialen Rudimente. Schnelles Hinzufügen von 200 ul der Infektion Medien, halten die Rudimente nassen zu allen Zeiten. Die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit dem Virus und Entsorgung kontaminierter Pipettenspitzen. Desinfizieren Sie alle Virus-kontaminierten Oberflächen mit 10% Bleichlösung. </li><li> Verschieben Sie die Epithelzellen Rudimente weit voneinander entfernt mit einer Pinzette, um sie nicht zusammenkleben und ihnen zu ermöglichen, um die Unterseite der Platte zu begleichen. Inkubieren Rudimente in viralen Medien für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Während der Inkubation, trennen Sie die Ansätze, wenn sie nahe beieinander bewegen. Übermäßige rocking oder Bewegung ermöglicht die Drüsen zu verklumpen. </li><li> Nach der Inkubation, entfernen die viralen-haltigen Medien und entsorgen entsprechend, kümmert sich nicht um die r störenudiments. Fügen Sie 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep. Wiederholen Sie diesen wash mindestens zwei weitere Male und ersetzen mit 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep Medien. Diese Waschmittel sind kritisch für alle Viren, die nicht stark mit den Epithelien befestigt zu entfernen und um die Infektion der Mesenchym verhindern. </li><li> Inkubieren epithelialen Rudimente mit 200 ml DMEM/F12, enthaltend 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356.231) für 20 min. Wir finden, dass diese kurze Inkubation in Matrigel die Regression von vorhandenen Klüften minimiert während der anfänglichen Züchtungsperiode, aber dieser Schritt kann entfallen, wenn die Exposition gegenüber Matrigel nicht erwünscht verzichtet werden. </li></ol> 4. Ex vivo Kultur rekombinierte SMGs <ol><li> Legen Sie jedes Rudiment, ein zu einer Zeit, mit einem Pre-wet 200 ul Pipettenspitze auf einem gekerbten (klein geschnitten) 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch Membranfilter (Whatman) schwimmt über 200 ul von Kulturmedien ( 5 Rudimente / Filter) in einem Glasboden-Mikrotiterplatte. Die Kulturmedienist: DMEM/F12 + Pen-Strep die 50 ug / ml Transferrin und 150 ug / ml Ascorbinsäure, wie zuvor 2,8 beschrieben. Transferrin ist bekannt, dass das Überleben zu stimulieren und Verzweigung Morphogenese der Speicheldrüse und andere Organe Explantate 9. Zusatz von Ascorbinsäure wurde gezeigt, stimulieren SMG Verzweigung. 10. Es ist bekannt, dass als Cofaktor in vielen Hydroxylierungsreaktionen von Stoffwechselwegen (wie Prolin Hydroxylierung während Kollagen Faserbildung 11) wirken und stimuliert auch Fibronectin und Laminin Produktion in anderen Organexplantaten 12. </li><li> Entfernen Sie so viel Medien auf der Oberseite des Filters wie möglich nach Zugabe jeder Epithelzellen Rudiment. Too much media auf der Oberseite des Filters kann der Filter zu sinken, während weniger Medien macht Platzierung der Rudimente und Mesenchym viel einfacher. Excess Medien können entweder mit einer Pipettenspitze oder mit einer Pinzette, um die Medien zwischen den Spitzen greifen entfernt werden. </li><li> Ort Mesenchym Stücke stammen from drei vor vier Drüsen auf der Oberseite und / oder um jeden epithelialen Rudiment. Nehmen Sie etwaige zusätzliche Medien, die rund um die Drüsen auf die Bewegung des Mesenchym weg von den Grundlagen zu vermeiden. Mesenchym stammt aus mehr Drüsen ist nicht förderlich, aber weniger kann sich nachteilig auf epithelialen Rudiment Wachstum. </li><li> Inkubieren rekombinierten SMGs in einem befeuchteten Inkubator (95% Luft / 5% CO 2) bei 37 ° C für 48 -72 h, wie gewünscht. </li><li> Erwerben Hellfeld und / oder fluoreszierende Bilder von Live-Drüsen bei 0 h (falls gewünscht), 2 Stunden nach Rekombination und alle 24 Stunden danach auf einer invertierten, aufrecht, oder Stereo-Lichtmikroskop mit einer Digitalkamera mit einem 4x oder 5x Vergrößerung Ziel ausgestattet erfassen die gesamte rekombinierten Drüse in einem einzelnen Frame Ansicht. Bilder der Speicheldrüse zeigen die besten Kontrast entweder mit dem Hellfeld Einstellung oder die entsprechende Phase Ring platziert einen Teil des Weges in den Strahlengang (das ist nicht voll automatisierte Mikroskope möglich). Standard Phasenkontrast keinet notwendig, da die Drüse ist dick und schafft Kontrast. </li><li> An den gewünschten Zeitpunkten, können rekombinierte SMGs für 20 Minuten mit Fixiermittel Lösung von 2% Paraformaldehyd (PFA) in 1X PBS, enthaltend 5% (w / v) Saccharose (besser zu erhalten internen zellulären Struktur, indem die Zellen in gemacht festgesetzt ein isosmotische Zustand). Anders als 4% PFA, 2% PFA wird bewahren eine signifikante Menge des GFP-Signals, wenn das Fixiermittel vollständig nach der Fixierung entfernt wird. Drüsen können für bis zu speichernden 1 Woche in 1X PBS im Dunkeln bei 4 ° C bis whole mount Immunzytochemie und konfokale Bildgebung durchgeführt, wie zuvor berichtet 3,6,13-15. Idealerweise sollte Immunzytochemie und Bildgebung bald nach Fixierung durchgeführt werden, um die beste Bildqualität zu erhalten. Drüsen kann auch in RIPA-Puffer für SDS-PAGE durch Western-Blotting-Analyse verfolgt, lysiert werden. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die ex vivo epitheliale-mesenchymale Rekombination Technik wurde erstmals für submandibular Speicheldrüsen im Jahr 1981 16 veröffentlicht. Bei diesem Protokoll, wir auf die ursprüngliche Methode erweitern, unter Verwendung adenoviraler Infektion Epithelzelle Genexpression im Kontext eines rekombinierten Drüse manipulieren. Wir zeigen, dass ein Prozentsatz der Epithelzellen mit dem Adenovirus infiziert sind, während der Prozentsatz an Zellen, die infiziert sind, hängt von den Eigenschaften des ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM / Ham &#39;s F12 Medium ohne Phenolrot </td><td> Life Technologies </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin und Streptomycin </td><td> Life Technologies </td><td> 15070-163 </td><td> 10X Lager </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Life Technologies </td><td> 17105-041 </td><td> Frieren Sie den einmaligen Gebrauch Aliquots bei-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Fraction V, niedrige Endotoxin </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Sollte hohe Titer (1x10 10 pfu / ml) betragen. CsCl gereinigten Viren sind wirksamer als säulengereinigt Viren in diesem Assay. </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td&gt; Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> Verdünnt auf 2% in PBS mit 5% Sucrose (w / v) </td></tr><tr><td> 1X Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) </td><td> Life Technologies </td><td> 70011-044 </td><td> Hergestellt aus 10X Lager </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Life Technologies </td><td> 14175095 </td><td> kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenol Red </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml Stammlösung in DMEM/F12 Medien. Frieren Einweg-Aliquots bei-20C </td></tr><tr><td> L-Ascorbinsäure (Vitamin C) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> 75 mg / ml Stammlösung in DMEM/F12 media.Freeze Einweg-Aliquots bei-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Liste der Reagenzien für SMG Rekombination Protokoll erforderlich. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 cm sterile Plastikschalen </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Nicht-Gewebekultur-behandelten Platten können ebenfalls verwendet werden. </td></tr><tr><td> Stereo Binokular mit Durchlichtbasis </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Jede Stereo Präpariermikroskop können verwendet, das eine Durchlichtbasis werden. </td></tr><tr><td> 35 mm-Gewebekulturschalen </td><td> Falke </td><td> 353001 </td><td> Nicht-Gewebekultur-behandelten Platten können ebenfalls verwendet werden. </td></tr><tr><td> 50 mm Durchmesser Mikrowell Gerichten </td><td> MatTek Konzern </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch Membranfilter </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> 13 mm Durchmesser, 0,1 mm Porengröße </td></tr><tr><td> Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop </td><td> Carl Zeiss, USA </td><td> Axio Observer Z1 </td><td> Jede Fluoreszenzmikroskop (aufrecht, inverted oder Stereo Präpariermikroskop) kann zum GFP-Expression bei geringer Vergrößerung überwachen mit angeschlossenem digitalen Kamera werden. </td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Konfokale Mikroskopie ist notwendig, um detaillierte Zellstrukturen zu sehen. Jede Konfokalmikroskop können verwendet werden. </td></tr><tr><td> Timed-schwangeren weiblichen Mäusen, Stamm CD-1-oder ICR </td><td> Charles River Labs </td><td></td><td> Embryonen werden am Tag 13 (mit Tag der Plug Entdeckung als Tag 0 bezeichnet) geerntet. </td></tr><tr><td> Skalpellklingen Nr. 11 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Skalpellgriff # 3 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Zangen inox-Legierung, 0,05 X 0,02 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11252-20 </td><td> Ideal für die Ernte Drüsen aus Embryonen </td></tr><tr><td&gt; Dumont Nr. 5 Zangen dumostar Legierung, 0,05 X 0,01 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295-20 </td><td> Feine Spitzen zum Entfernen von Mesenchym aus Epithel erforderlich. Wolframnadeln können ebenfalls verwendet werden. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 2. Ausrüstung in SMG Rekombination Protokoll verwendet. </td></tr></tbody></table>

genetic modification and recombination of salivary gland organ cultures

Branching Morphogenese tritt während der Entwicklung vieler Organe und die embryonale Maus submandibularis (SMG) ist ein klassisches Modell für die Untersuchung der Verzweigung Morphogenese. In der sich entwickelnden SMG beinhaltet dieses Verfahren iterativen Schritten von epithelialen Knospe und Kanal Formation, um letztendlich Anlass zu einem komplexen verzweigtes Netzwerk von Acini und Leitungen, die zu erzeugen und zu modifizieren / transportieren den Speichel bzw. in die Mundhöhle 1 dienen - 3. Das Epithel-assoziierten Basalmembran und Aspekte der mesenchymalen Abteil, einschließlich der Mesenchymzellen, Wachstumsfaktoren und der extrazellulären Matrix, die von diesen Zellen produziert werden, sind für die Verzweigungsmechanismus, obwohl, wie die zellulären und molekularen Ereignisse koordiniert bleibt kaum verstanden 4 . Die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die epithelialen Morphogenese unser Verständnis von Entwicklungsstörungen Mechanismen und bietet einen Einblick in mögliche Regenerationtive Medizin Ansätze. Solche Studien wurden aufgrund des Mangels an effektiven Methoden zur genetischen Manipulation der Speicheldrüse Epithel behindert. Derzeit stellt adenovirale Transduktion die effektivste Methode für die Ausrichtung Epithelzellen in der Erwachsenenbildung Drüsen in vivo 5. Doch in embryonalen Explantate behindert dichten Mesenchym und die Basalmembran umgibt die Epithelzellen viralen Zugang zu den Epithelzellen. Wenn die Mesenchym entfernt wird, kann das Epithel transfiziert mit Adenoviren werden, und wieder aufgenommen werden kann epithelialen Rudimente Verzweigungsmittel Morphogenese in Gegenwart von Matrigel oder Laminin-111 6,7. Mesenchym-free epithelialen Rudiment Wachstum erfordert auch zusätzliche Nahrungsergänzung mit löslichen Wachstumsfaktoren und nicht vollständig rekapitulieren Verzweigung Morphogenese, wie es in intakten Drüsen 8 auftritt. Hier beschreiben wir eine Technik, die adenovirale Transduktion von Epithelzellen und Kultur der transfizierten e erleichtertpithelium mit zugehörigen Mesenchym. Nach Mikrodissektion der embryonalen Maschinenpistolen, Entfernung des Mesenchym und Virusinfektion des Epithels mit einem GFP-haltigen Adenovirus zeigen wir, dass das Epithel sich spontan rekombiniert mit nichtinfizierten Mesenchym rekapituliert intakten SMG glandulären Strukturen und Verzweigungsmittel Morphogenese. Die gentechnisch veränderten epithelialen Zell-Population kann leicht überwacht werden unter Verwendung von Standard Fluoreszenzmikroskopie Methoden, wenn Fluoreszenz-markierten adenovirale Konstrukte verwendet werden. Das Gewebe Rekombination hier beschriebene Verfahren ist derzeit das wirksamste und zugänglich Verfahren zur Transfektion von epithelialen Zellen mit einem Wildtyp-oder mutierten Vektor innerhalb eines komplexen 3D Gewebekonstrukt, das keine Erzeugung transgener Tiere.

Die Strömung der großen experimentellen Schritte ist in 1 skizziert. Ein Beispiel eines intakten SMG, einem isolierten Epithelzellen Rudiment, und seine entsprechende Mesenchym sind in Abbildung 2 gezeigt. Hellfeld Bilder von rekombinierten Maschinenpistolen, die zu unterziehen Verzweigungsmittel Morphogenese bei kultivierten ex vivo für die angegebenen Zeiten, in Abbildung 3 dargestellt fort. Rekombinierte Drüsen für 48 hr exprimieren epi...

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Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Eine Technik, genetisch zu manipulieren Epithelzellen innerhalb der gesamten<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierten embryonalen Maus submandibularis (SMGs) mit viralen Gentransfer beschrieben. Diese Methode nutzt die angeborene Fähigkeit der SMG Epithel und Mesenchym spontan nach der Trennung und Infektion von Epithelzellen Rudimente mit adenoviralen Vektoren rekombinieren.

Genetic Modification und Rekombination von Speicheldrüsen Organkulturen

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

genetic-modification-recombination-salivary-gland-organ

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Aufrufe.  University at Albany, SUNY. Eine Technik, genetisch zu manipulieren Epithelzellen innerhalb der gesamten Ex vivo Kultivierten embryonalen Maus submandibularis (SMGs) mit viralen Gentransfer beschrieben. Diese Methode nutzt die angeborene Fähigkeit der SMG Epithel und Mesenchym spontan nach der Trennung und Infektion von Epithelzellen Rudimente mit adenoviralen Vektoren rekombinieren.

Serie: Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissection der Dünndarm-und Speicheldrüsen von Ae. aegypti Moskitos

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Forschung

Biologie

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

Genetische Modifikation von Cyanobakterien durch Konjugation mit dem CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and the Plasmodium parasites that cause malaria, accumulate in the secretory cavities of SG cells. Here, they are poised for transmission to their vertebrate hosts during a subsequent blood meal. As adult glands form as an elaboration of larval SG duct bud remnants that persist beyond early pupal SG histolysis, the larval SG is an ideal target for interventions that limit disease transmission. Understanding larval SG development can help develop a better understanding of its morphology and functional adaptations and aid in the assessment of new interventions that target this organ. This video protocol demonstrates an efficient technique for isolating, fixing, and staining larval SGs from Anopheles gambiae mosquitoes. Glands dissected from larvae in a 25% ethanol solution are fixed in a methanol-glacial acetic acid mixture, followed by a cold acetone wash. After a few rinses in phosphate-buffered saline (PBS), SGs can be stained with a broad array of marker dyes and/or antisera against SG-expressed proteins. This method for larval SG isolation could also be used to collect tissue for in situ hybridization analysis, other transcriptomic applications, and proteomic studies.

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

The adult mosquito salivary gland (SG) is required for the transmission of all mosquito-borne pathogens to their human hosts, including viruses and parasites. This video demonstrates efficient isolation of the SGs from the larval (L4) stage Anopheles gambiae mosquitoes and preparation of the L4 SGs for further analysis.

Dissektion und Immunfärbung von Larven-Speicheldrüsen von Anopheles gambiae Mücken

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...