Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health NS047726, NS072027 und AR052646 unterstützt gewährt.

Die Methoden in dieser Studie wurden im ethischen Übereinstimmung mit der Northwestern University Feinberg School of Medicine Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt genehmigten Richtlinien. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden zu minimieren. 1. Experimentelles Verfahren zur in vivo Elektroporation des M. flexor digitorum brevis (FDB) Muskelbündel in Maus- <ol><li> Design Plasmide zur Expression in vivo einen Promotor verwendet, bekannt, in Säugetierzellen zu exprimieren (zB Cytomegalovirus, CMV) oder im Muskel (zB Muskelkreatinkinase, MCK) 6,7. Größere Plasmide können auf den unteren Ebenen zum Ausdruck bringen. Der CMV-Promotor wurde umfassend 6,7 verwendet. </li><li> Reinige Plasmide aus E. coli mit Endotoxin-freien Bedingungen den Anweisungen des Herstellers. Löse das Plasmid in sterile, endotoxinfrei TE Puffer bei 2-5 &amp; mgr; g Plasmid / ul. </li><li> Verdünnen und aliquotieren das Plasmid zu einem concentration von 20 ug DNA in 10 ul sterilem endotoxinfreiem TE (2 ug / ul) Puffer pro Injektion in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie eine aliquote Menge pro Injektion. </li><li> Verdünnen Sie die Lager von Hyaluronidase, um mit sterilem Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium 1x (PBS - / -) was eine Endkonzentration von 8 Einheiten. Aliquot 10 ul verdünnt Hyaluronidase pro Injektion in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Betäuben die Maus mit 2,5% Isofluran, bis sediert und reagiert nicht mehr bis zum Schwanz oder Zehen Kneifen. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einem Heizkissen oder Wärmetisch zur normalen Körpertemperatur zu halten. </li><li> Reinigen Sie die Fußballen der Maus mit einer alternierenden Anwendung einer Povidon-Iod-Peeling und Alkohol dreimal unter Verwendung eines Prep-Technik von der Nadel Website Ursprung und strahlende nach außen. Diese Technik hält die Nadel Website in einem aseptischen Zustand, Minimierung Erreger Einführung. </li><li> Spritzen Sie die Fußballen von the Maus mit 10 ul 1x-Hyaluronidase-Lösung (2 mg / ml = 8 Einheiten) zwischen der Haut und den Muskel unter Verwendung einer sterilen 1 ml-Spritze. Hyaluronidase verdaut Komponenten der extrazellulären Matrix zu effizienteren Eintrag der Plasmid in Muskelfasern ermöglichen. Geben Sie an der Basis der Ferse und vorab die Nadel in Richtung der Zehen. Langsam lassen Sie die Flüssigkeit, wenn die Nadel zurückgezogen wird. Die Injektionsstelle unter die Haut dehnt sich und beginnen, rosa drehen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 auf der kontralateralen Fuß. </li><li> Trennen Sie die Anästhesie und die Maus wieder in den Käfig. Lassen Sie die Maus, um in vollem Umfang von der Anästhesie erholen. </li><li> Warten Sie 2 Stunden. </li><li> Wiederholen Sie die betäubende und Fuß Sterilisationsverfahren, die Schritte 1.5 und 1.6. </li><li> Spritzen Sie die verdünnte Plasmid-DNA in den Fußballen auf die gleiche Weise wie die Hyaluronidase. Sicherzustellen, dass das maximale Volumen beträgt 20 &amp; mgr; l oder weniger. Für Dual-Plasmid-Expressions injizieren 20 ug jedes Plasmids mit einem maximalen Volumen von 20 &amp;# 181; l oder weniger. </li><li> Wiederholen Sie den Plasmid-Injektion auf der kontralateralen Fußballen oder verwenden Sie den kontralateralen Fuß für Steuereinspritzungen. </li><li> Auf dem Fuß, die zunächst eingespritzt wurde, heben Sie die Haut von der Unterstreichung Muskel mit feinen Pinzette und legen Sie eine 27 G-Nadel durch die Kugeln der Haut in der Nähe der Zehen in einer Position senkrecht zu der heilen Zehenlinie des Fußes. Nehmen Sie einen zweiten sterilen 27 G-Nadel und legen Sie sie horizontal durch die Haut an der Ferse. Ort Nadeln parallel zueinander ~ 1 cm auseinander. </li><li> Verwenden Krokodilklemmen, Klemmelektroden zu den parallelen Nadeln dafür, dass die Nadeln nicht miteinander in Berührung kommen. Die Verwendung von Modelliermasse können die Klammern zu befestigen. </li><li> Verbinden Elektroden zu einem elektrischen Stimulator. </li><li> Elektroporieren den Muskel durch Anwenden 20 Impulse, 20 msec Dauer / jedes bei 1 Hz, bei 100 V / cm. Die Zehen können mit Stimulation zucken. </li><li> Wiederholen Sie die Stimulationsverfahren auf der kontralateralen Fuß, falls erforderlich. </li><li>Nadeln zu entfernen. Wischen Sie den Fußballen Povidoniod Gestrüpp. </li><li> Schalten Sie die Anästhesie. Bringen Sie die Maus, um die Erholung Käfig und Überwachungstätigkeit. Wenn das Verfahren wurde durchgeführt, wie erwartet, sollte das Tier normale Gehfähigkeit innerhalb von 30 Minuten wieder zu erlangen und zeigen keinen Unterschied in der Gehfähigkeit oder Aktivitätsniveau von vor der Einspritzverhalten. Daher werden keine post-Verfahren Analgetika nötig. Bei der Wiederherstellung, bringen Sie das Tier zum Tiergehege. Achtung: Die Proteinexpression kann so früh wie 48 Stunden nach der Elektroporation untersucht werden. Allerdings, mehr vollständige Wiederherstellung nach der Elektroporation zu ermöglichen, ziehen wir die Isolierung und Untersuchung von Muskelfasern 7 - 14 Tage nach der Elektroporation 10. Expression untersucht werden, solange 4 Wochen nach der Elektroporation werden. </li></ol> 2. Experimentelles Verfahren zur Isolierung des M. flexor digitorum brevis (FDB) Fibers <ol><li> Thaw Kollagenase. Für jede FDB Bündel bereiten zwei Vertiefungen in einer 12-Well-Gewebekulturplatte. In einer gut hinzufügen, 1 ml vorgewärmtes Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium sowie Rinderserumalbumin (DMEM + BSA) und in der anderen auch 1 ml vorgewärmten Ringers Lösung. Darüber hinaus fügen Sie frisches 10 ml 1x Ringers Lösung für die 35 mm Sylgard Gericht. </li><li> Opfern das Tier durch CO 2 oder Narkosegas Inhalation, gefolgt durch Genickbruch oder eine andere Methode, um den Tod zu gewährleisten. </li><li> Entfernen Sie die Hinterfüße oberhalb des Sprunggelenks mit einem sauberen Rasierklinge und tauchen in 1x Ringer-Lösung in den 35 mm Sylgard Gericht. </li><li> Pin einen Fuß eng, Sohle nach oben, auf die Sylgard Gericht mit 30 G Nadeln durch jede der 5 Zehenspitzen und am Knöchel. </li><li> Beginnend am Knöchel, schnippeln die Haut gerade an der Seite des Fußes entlang der Haaransatz in Richtung der Zehen, darauf achten, nicht nick die Muskeln unter der Haut. Wiederholen Sie auf der anderen Seite des Fußes. </li><li> Halten Sie die Haut an der Unterseite des oberen Sprunggelenks mit feinen Pinzette, schneiden Sie die Haut über der Ferse. </li><li> Anheben der HautKlappe mit einer Pinzette, zeigen Sie mit einer Schere in Richtung auf die Haut, um nicht nick der Muskel. Snip die zugrunde liegende Bindegewebe, die Haut effektiv zu entfernen. </li><li> So entfernen Sie die FDB Muskelbündel schneiden die großen Sehne an der Ferse, um die Sehne vom Knochen zu befreien. Halten Sie die Sehne mit einer Pinzette, sezieren die FDB Bündel von der großen weißen Sehne sorgfältig Entfernen von Bindegewebe mit einer Schere auf die FDB angebracht. Wenn man es richtig macht das Bündel leicht abheben der zugrunde liegenden Sehnen enthüllt hellen weißen Sehnen, die zu den einzelnen Ziffern. Schneiden Sie die FDB an den Sehnen in der Nähe von den Zehen zu befreien das Bündel aus dem Fuß. </li><li> Legen Sie die gesamte Muskelbündel in der auch das DMEM + BSA. </li><li> Wiederholen Sie auf der kontralateralen Fuß. </li><li> Sobald alle FDB Muskeln isoliert, fügen Sie 100 ul von Kollagenase in jede Vertiefung DMEM + BSA und Muskeln. </li><li> Überprüfen Sie den Erfolg der Elektroporation auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop vor dem Aufschluss. Wenn getan properly, nach oben von 90% Transfektionseffizienz erzielt werden. </li><li> Inkubieren der Platte in einer befeuchteten, 37 ° C-Inkubator bei 10% CO 2 für ca. 1 Std. Die Inkubationszeit kann je nach Krankheitsmodell und Hintergrund und die Menge von Kollagenase variieren. </li><li> Nach 1 Stunde sorgfältig überweisen Sie den FDB-Bundle zum Brunnen, die nur Ringerlösung. </li><li> Man reibt die FDB Bündels in der gut mit der Ringer-Lösung unter Verwendung einer 1 ml Pipette. Schneiden Sie das Ende der Pipettenspitze mit einem sauberen Rasierklinge, so dass das Bündel kann leicht durch die Pipettenspitze passieren. Verreiben Sie vorsichtig die Muskeln (~ 15-mal) so dass die Bündel, um sich parallel zu der Spitze vorbei und. Intakten Fasern werden in die Ringer-Lösung fallen ab. Wenn Fasern nicht leicht fallen aus dem Bündel, legen Sie die Muskeln wieder in Kollagenase-Lösung. </li><li> Teller der isolierten Fasern auf dem Teller ~ 500 ul pro Platte. </li><li> Erlauben der Muskel in der Vertiefung für 15 Minuten zu verdauen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.152,17 bis das Bündel in der Größe abnimmt und die Mehrheit der Fasern aus dem Bündel (üblicherweise insgesamt 2-3 mal) dissoziiert. Sobald dissoziiert der Muskel leicht durch eine 1 ml Pipettenspitze gelangt. </li><li> Lassen Fasern zu befestigen, um die Schale für mindestens 15 min. Frisch Ringers-Lösung kann in Abhängigkeit von Zeitbeschränkungen an der Platte aufgenommen werden, um restliche Kollagenase verdünnen oder verändert. Hinweis: Die Fasern sind nun bereit für die Bildgebung. </li></ol> 3. Versuchsdurchführung zur Visualisierung von Laserinduzierte Membranschädigung mit konfokale Mikroskopie <ol><li> Lastfasern unmittelbar vor dem Gebrauch mit 300 ul von 2,5 uM FM 1-43 FM 4-64 Farbstoff in Ringers Lösung Bildgebung. Generell Bildfasern 15 min bis 2 h nach der Isolierung. Allerdings können Fasern bis zu 24 Stunden nach der Isolierung abgebildet werden. </li><li> Setzen Sie den Glasboden Teller auf einem konfokalen Mikroskop mit einem UV-Laser und einem 60X / 63X Ziel ausgestattet. </li><li> Suchen Sie eine Faser. Stellen Sie sicher, die Faser fest verbundenin die Schale durch Antippen der Mikroskopbasis. Fasern, die bei der Spaltung beschädigt wurden auszuschließen. Beschädigte Fasern können Membran Blasen, Aufnahme hoher FM Farbstoff, Locke enthalten oder biegen intensiv. </li><li> Um Membranschäden auf der Faser zu induzieren, positionieren Sie den Sarkolemma im Zentrum des Abbildungsfenster mit einem Feld weg von Kernen. Konzentrieren Sie sich auf die Sarkolemma mit der FM-Farbstoff-Kanal, so dass das Sarkolemm ist extrem scharf. </li><li> Setzen Sie den ROI Fadenkreuz auf dem Sarkolemma Verwendung des FM 4-64 Kanal. </li><li> Bestrahlen einer 1 Pixel Punkt bei 80% Leistung für 3 Sekunden (~ 350 nm x 350 nm-Bereich). FM Farbstoff wird die Zelle an der Stelle der Verletzung geben. Leistung und Zeit eingestellt werden kann zur Erhöhung oder Verringerung der Fläche Insult. </li><li> Machen Sie Bilder von der Faser vor Beschädigungen, zum Zeitpunkt der Beschädigung, alle 2 Sek post-Schäden, danach alle 10 Sekunden bis zu 5 min. Timing kann je nach Bedarf eingestellt werden. Einzelne Bilder können zum Zeitraffer-Filme in Bild J. umgewandelt werden </li><li> Wiederholen Sie die Schritte3,3 bis 3,7 auf bis zu 3 Fasern pro Gericht. </li></ol>

<ol>
	<li>Blau, H. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micropeptide+encoded+by+a+putative+long+noncoding+RNA+regulates+muscle+performance.">A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance.</a> Cell. 160, 595-606 (2015).</li><li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation.">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).</li><li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. 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Es gibt keine Interessenkonflikte.

Die Verwendung der Elektroporation zur fluoreszenzmarkierten Proteine ​​in vivo zu untersuchen ist besonders für die Untersuchung von Muskeln aufgrund der Abwesenheit von geeigneten Zellinie Modelle, die die gesamte Zellstruktur des Muskels originalgetreu geeignet. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Elektroporation und hochauflösende konfokale Mikroskopie, detaillierte Darstellung von Protein-Lokalisierung und Translokation nach der Laser Verwundung bereitzustellen. Diese Methode läs...

Einzelne Muskelfasern sind groß, hoch organisierte Syncytial-Zellen. Es gibt einige Zellkulturmodelle für Muskel; jedoch haben diese Modelle als ihre wichtigste Einschränkung, dass sie nicht vollständig zu reifen Muskelfasern unterscheiden. Beispielsweise werden die C2C12 und L6-Zelllinien von Mäusen und Ratten, jeweils 1-4 abgeleitet sind. Unter den Bedingungen der Serumentzug, die einkernigen &quot;Myoblasten-like&quot; Zellen aufhören Proliferation, Zellzyklus Entzug zu unterziehen, und geben Sie in die myogenen Programm bildet kernige Zellen mit Sarkomere, die so genannte Myotuben. Bei längerer Kulturbedingungen kann Myotuben Kontraktionseigenschaften aufweisen und &quot;zucken&quot; in der Kultur. Menschlichen Zelllinien wurden auch jetzt 5 etabliert. Neben diesen immortalisierten Zellinien können einkernige Myoblasten aus Muskel- und unter den gleichen Bedingungen von Serumentzug wird Myotuben Form isoliert werden. Diese Zelllinien und Primär Myoblastenkulturen sind hoch verwendenvoll, da sie die mit Plasmiden transfiziert oder transduziert mit Viren und zur Basiszelle biologische Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind diese Zellen, selbst wenn veranlasst, Myotuben zu bilden, fehlt vielen der wichtigsten Merkmale von reifen Muskel Organisation. Insbesondere sind Myotuben viel kleiner als einzelnen reifen Muskelfasern und nicht über die normale Form der Muskelfasern. Kritisch Myotuben fehlt Quer (T-) Tubuli, die membranartige Netzwerk für effiziente Ca 2+ Freisetzung der gesamten myoplasm erforderlich. Eine alternative Methode zur primären Myoblasten oder myogenen Zelllinien bringt mit reifen Muskelfasern. Transgenese verwendet werden, um die Expression von markierten Proteinen herzustellen, jedoch ist dieses Verfahren kostenintensiv und zeitraubend ist. In vivo Elektroporation von Maus-Muskel wurde als ein bevorzugtes Verfahren zu seiner Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit 6-10 entstanden. Verfahren zur in vivo Elektroporation und effiziente Isolierung von Muskelfasern have für die Maus flexor digitorum brevis (FDB) Muskel 6 optimiert. Die Verfahren können leicht durchgeführt werden und sind minimal-invasive in vivo-Expression von Plasmiden zu induzieren. Dieser Ansatz wird jetzt mit hochauflösenden bildgebenden Verfahren einschließlich Bildgebung nach der Laser Störung des Sarkolemma 6,7 kombiniert. Die Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen und die Expression von Fluoreszenz-markierten Proteine ​​können verwendet werden, um zellbiologische Prozesse in reifen Muskelfasern zu überwachen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td>Dissection Media 
			Dilution: 50ml +100g BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type II</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Fiber Digestion 
			Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>877229</td>
			<td>Fiber Digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Fiber Digestion and Imaging 
			Dilution: 146 mM NaCl 
			5 mM&#160;&#160; KCl 
			2 mM&#160;&#160; CaCl2 
			1 mM&#160;&#160; MCl2 
			10mM HEPES 
			pH7.4 in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Pipettes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-C-R</td>
			<td>Digestion</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>94-120-71</td>
			<td>Digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide 30G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305128</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (-/-)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST by Dumont</td>
			<td>#5/45</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4913</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500260</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Dissection media 
			Dilution: 100mg / 50ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 60mm dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08772B</td>
			<td>Dissection- used to hold sylgard</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator&#160;</td>
			<td>Grass</td>
			<td>s88x</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>Radio Shack</td>
			<td>270-356</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triadine</td>
			<td>Aplicare</td>
			<td>82-220</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Glide 27G needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305136</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>SIU-V</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>2146</td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Injection 
			Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40&#181;l 5x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329420</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
			<td>Injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass bottom Microwell dish</td>
			<td>MaTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 4-64</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T-13320</td>
			<td>Microscopy 
			Dilution: Final 2.5 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM 1-43</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T-35356</td>
			<td>Microscopy 
			Dilution: Final 2.5 ug/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>Plasmid Purification</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna electroporation, isolation and imaging of myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

Elektroporation ist eine minimal invasive Technik, die effizient stellt gereinigte Plasmid-DNA in der flexor digitorum brevis (FDB) Muskelbündel (Figur 1A). Sieben Tage nach der Transfektion fluoreszenzmarkierten Proteins in isolierter Muskelfasern (1B) visualisiert. Isolated Fasern werden dann ausgestrichen und für die Bildgebung vorbereitet auf einem konfokalen Mikroskop. Fasern können laserinduzierte Schädigung unterzogen werden. FM Farbstoff kann...

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DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

dna-electroporation-isolation-and-imaging-of-myofibers

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Aufrufe.  Northwestern University. This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure. 

Serie: DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Forschung

Biologie

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Elektroporation von Mykobakterien

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Reduzierte Gravitationsbereich Hardware Demonstrationen eines Prototyps Miniaturisierte Durchflusszytometer und Companion Microfluidic Mischtechnik

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...