Name: dna electroporation, isolation and imaging of myofibers
Uploaded: 2015-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health NS047726, NS072027 und AR052646 unterstützt gewährt.

Die Methoden in dieser Studie wurden im ethischen Übereinstimmung mit der Northwestern University Feinberg School of Medicine Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt genehmigten Richtlinien. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden zu minimieren. 1. Experimentelles Verfahren zur in vivo Elektroporation des M. flexor digitorum brevis (FDB) Muskelbündel in Maus- <ol><li> Design Plasmide zur Expression in vivo einen Promotor verwendet, bekannt, in Säugetierzellen zu exprimieren (zB Cytomegalovirus, CMV) oder im Muskel (zB Muskelkreatinkinase, MCK) 6,7. Größere Plasmide können auf den unteren Ebenen zum Ausdruck bringen. Der CMV-Promotor wurde umfassend 6,7 verwendet. </li><li> Reinige Plasmide aus E. coli mit Endotoxin-freien Bedingungen den Anweisungen des Herstellers. Löse das Plasmid in sterile, endotoxinfrei TE Puffer bei 2-5 &amp; mgr; g Plasmid / ul. </li><li> Verdünnen und aliquotieren das Plasmid zu einem concentration von 20 ug DNA in 10 ul sterilem endotoxinfreiem TE (2 ug / ul) Puffer pro Injektion in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie eine aliquote Menge pro Injektion. </li><li> Verdünnen Sie die Lager von Hyaluronidase, um mit sterilem Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium 1x (PBS - / -) was eine Endkonzentration von 8 Einheiten. Aliquot 10 ul verdünnt Hyaluronidase pro Injektion in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Betäuben die Maus mit 2,5% Isofluran, bis sediert und reagiert nicht mehr bis zum Schwanz oder Zehen Kneifen. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einem Heizkissen oder Wärmetisch zur normalen Körpertemperatur zu halten. </li><li> Reinigen Sie die Fußballen der Maus mit einer alternierenden Anwendung einer Povidon-Iod-Peeling und Alkohol dreimal unter Verwendung eines Prep-Technik von der Nadel Website Ursprung und strahlende nach außen. Diese Technik hält die Nadel Website in einem aseptischen Zustand, Minimierung Erreger Einführung. </li><li> Spritzen Sie die Fußballen von the Maus mit 10 ul 1x-Hyaluronidase-Lösung (2 mg / ml = 8 Einheiten) zwischen der Haut und den Muskel unter Verwendung einer sterilen 1 ml-Spritze. Hyaluronidase verdaut Komponenten der extrazellulären Matrix zu effizienteren Eintrag der Plasmid in Muskelfasern ermöglichen. Geben Sie an der Basis der Ferse und vorab die Nadel in Richtung der Zehen. Langsam lassen Sie die Flüssigkeit, wenn die Nadel zurückgezogen wird. Die Injektionsstelle unter die Haut dehnt sich und beginnen, rosa drehen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 auf der kontralateralen Fuß. </li><li> Trennen Sie die Anästhesie und die Maus wieder in den Käfig. Lassen Sie die Maus, um in vollem Umfang von der Anästhesie erholen. </li><li> Warten Sie 2 Stunden. </li><li> Wiederholen Sie die betäubende und Fuß Sterilisationsverfahren, die Schritte 1.5 und 1.6. </li><li> Spritzen Sie die verdünnte Plasmid-DNA in den Fußballen auf die gleiche Weise wie die Hyaluronidase. Sicherzustellen, dass das maximale Volumen beträgt 20 &amp; mgr; l oder weniger. Für Dual-Plasmid-Expressions injizieren 20 ug jedes Plasmids mit einem maximalen Volumen von 20 &amp;# 181; l oder weniger. </li><li> Wiederholen Sie den Plasmid-Injektion auf der kontralateralen Fußballen oder verwenden Sie den kontralateralen Fuß für Steuereinspritzungen. </li><li> Auf dem Fuß, die zunächst eingespritzt wurde, heben Sie die Haut von der Unterstreichung Muskel mit feinen Pinzette und legen Sie eine 27 G-Nadel durch die Kugeln der Haut in der Nähe der Zehen in einer Position senkrecht zu der heilen Zehenlinie des Fußes. Nehmen Sie einen zweiten sterilen 27 G-Nadel und legen Sie sie horizontal durch die Haut an der Ferse. Ort Nadeln parallel zueinander ~ 1 cm auseinander. </li><li> Verwenden Krokodilklemmen, Klemmelektroden zu den parallelen Nadeln dafür, dass die Nadeln nicht miteinander in Berührung kommen. Die Verwendung von Modelliermasse können die Klammern zu befestigen. </li><li> Verbinden Elektroden zu einem elektrischen Stimulator. </li><li> Elektroporieren den Muskel durch Anwenden 20 Impulse, 20 msec Dauer / jedes bei 1 Hz, bei 100 V / cm. Die Zehen können mit Stimulation zucken. </li><li> Wiederholen Sie die Stimulationsverfahren auf der kontralateralen Fuß, falls erforderlich. </li><li>Nadeln zu entfernen. Wischen Sie den Fußballen Povidoniod Gestrüpp. </li><li> Schalten Sie die Anästhesie. Bringen Sie die Maus, um die Erholung Käfig und Überwachungstätigkeit. Wenn das Verfahren wurde durchgeführt, wie erwartet, sollte das Tier normale Gehfähigkeit innerhalb von 30 Minuten wieder zu erlangen und zeigen keinen Unterschied in der Gehfähigkeit oder Aktivitätsniveau von vor der Einspritzverhalten. Daher werden keine post-Verfahren Analgetika nötig. Bei der Wiederherstellung, bringen Sie das Tier zum Tiergehege. Achtung: Die Proteinexpression kann so früh wie 48 Stunden nach der Elektroporation untersucht werden. Allerdings, mehr vollständige Wiederherstellung nach der Elektroporation zu ermöglichen, ziehen wir die Isolierung und Untersuchung von Muskelfasern 7 - 14 Tage nach der Elektroporation 10. Expression untersucht werden, solange 4 Wochen nach der Elektroporation werden. </li></ol> 2. Experimentelles Verfahren zur Isolierung des M. flexor digitorum brevis (FDB) Fibers <ol><li> Thaw Kollagenase. Für jede FDB Bündel bereiten zwei Vertiefungen in einer 12-Well-Gewebekulturplatte. In einer gut hinzufügen, 1 ml vorgewärmtes Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium sowie Rinderserumalbumin (DMEM + BSA) und in der anderen auch 1 ml vorgewärmten Ringers Lösung. Darüber hinaus fügen Sie frisches 10 ml 1x Ringers Lösung für die 35 mm Sylgard Gericht. </li><li> Opfern das Tier durch CO 2 oder Narkosegas Inhalation, gefolgt durch Genickbruch oder eine andere Methode, um den Tod zu gewährleisten. </li><li> Entfernen Sie die Hinterfüße oberhalb des Sprunggelenks mit einem sauberen Rasierklinge und tauchen in 1x Ringer-Lösung in den 35 mm Sylgard Gericht. </li><li> Pin einen Fuß eng, Sohle nach oben, auf die Sylgard Gericht mit 30 G Nadeln durch jede der 5 Zehenspitzen und am Knöchel. </li><li> Beginnend am Knöchel, schnippeln die Haut gerade an der Seite des Fußes entlang der Haaransatz in Richtung der Zehen, darauf achten, nicht nick die Muskeln unter der Haut. Wiederholen Sie auf der anderen Seite des Fußes. </li><li> Halten Sie die Haut an der Unterseite des oberen Sprunggelenks mit feinen Pinzette, schneiden Sie die Haut über der Ferse. </li><li> Anheben der HautKlappe mit einer Pinzette, zeigen Sie mit einer Schere in Richtung auf die Haut, um nicht nick der Muskel. Snip die zugrunde liegende Bindegewebe, die Haut effektiv zu entfernen. </li><li> So entfernen Sie die FDB Muskelbündel schneiden die großen Sehne an der Ferse, um die Sehne vom Knochen zu befreien. Halten Sie die Sehne mit einer Pinzette, sezieren die FDB Bündel von der großen weißen Sehne sorgfältig Entfernen von Bindegewebe mit einer Schere auf die FDB angebracht. Wenn man es richtig macht das Bündel leicht abheben der zugrunde liegenden Sehnen enthüllt hellen weißen Sehnen, die zu den einzelnen Ziffern. Schneiden Sie die FDB an den Sehnen in der Nähe von den Zehen zu befreien das Bündel aus dem Fuß. </li><li> Legen Sie die gesamte Muskelbündel in der auch das DMEM + BSA. </li><li> Wiederholen Sie auf der kontralateralen Fuß. </li><li> Sobald alle FDB Muskeln isoliert, fügen Sie 100 ul von Kollagenase in jede Vertiefung DMEM + BSA und Muskeln. </li><li> Überprüfen Sie den Erfolg der Elektroporation auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop vor dem Aufschluss. Wenn getan properly, nach oben von 90% Transfektionseffizienz erzielt werden. </li><li> Inkubieren der Platte in einer befeuchteten, 37 ° C-Inkubator bei 10% CO 2 für ca. 1 Std. Die Inkubationszeit kann je nach Krankheitsmodell und Hintergrund und die Menge von Kollagenase variieren. </li><li> Nach 1 Stunde sorgfältig überweisen Sie den FDB-Bundle zum Brunnen, die nur Ringerlösung. </li><li> Man reibt die FDB Bündels in der gut mit der Ringer-Lösung unter Verwendung einer 1 ml Pipette. Schneiden Sie das Ende der Pipettenspitze mit einem sauberen Rasierklinge, so dass das Bündel kann leicht durch die Pipettenspitze passieren. Verreiben Sie vorsichtig die Muskeln (~ 15-mal) so dass die Bündel, um sich parallel zu der Spitze vorbei und. Intakten Fasern werden in die Ringer-Lösung fallen ab. Wenn Fasern nicht leicht fallen aus dem Bündel, legen Sie die Muskeln wieder in Kollagenase-Lösung. </li><li> Teller der isolierten Fasern auf dem Teller ~ 500 ul pro Platte. </li><li> Erlauben der Muskel in der Vertiefung für 15 Minuten zu verdauen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.152,17 bis das Bündel in der Größe abnimmt und die Mehrheit der Fasern aus dem Bündel (üblicherweise insgesamt 2-3 mal) dissoziiert. Sobald dissoziiert der Muskel leicht durch eine 1 ml Pipettenspitze gelangt. </li><li> Lassen Fasern zu befestigen, um die Schale für mindestens 15 min. Frisch Ringers-Lösung kann in Abhängigkeit von Zeitbeschränkungen an der Platte aufgenommen werden, um restliche Kollagenase verdünnen oder verändert. Hinweis: Die Fasern sind nun bereit für die Bildgebung. </li></ol> 3. Versuchsdurchführung zur Visualisierung von Laserinduzierte Membranschädigung mit konfokale Mikroskopie <ol><li> Lastfasern unmittelbar vor dem Gebrauch mit 300 ul von 2,5 uM FM 1-43 FM 4-64 Farbstoff in Ringers Lösung Bildgebung. Generell Bildfasern 15 min bis 2 h nach der Isolierung. Allerdings können Fasern bis zu 24 Stunden nach der Isolierung abgebildet werden. </li><li> Setzen Sie den Glasboden Teller auf einem konfokalen Mikroskop mit einem UV-Laser und einem 60X / 63X Ziel ausgestattet. </li><li> Suchen Sie eine Faser. Stellen Sie sicher, die Faser fest verbundenin die Schale durch Antippen der Mikroskopbasis. Fasern, die bei der Spaltung beschädigt wurden auszuschließen. Beschädigte Fasern können Membran Blasen, Aufnahme hoher FM Farbstoff, Locke enthalten oder biegen intensiv. </li><li> Um Membranschäden auf der Faser zu induzieren, positionieren Sie den Sarkolemma im Zentrum des Abbildungsfenster mit einem Feld weg von Kernen. Konzentrieren Sie sich auf die Sarkolemma mit der FM-Farbstoff-Kanal, so dass das Sarkolemm ist extrem scharf. </li><li> Setzen Sie den ROI Fadenkreuz auf dem Sarkolemma Verwendung des FM 4-64 Kanal. </li><li> Bestrahlen einer 1 Pixel Punkt bei 80% Leistung für 3 Sekunden (~ 350 nm x 350 nm-Bereich). FM Farbstoff wird die Zelle an der Stelle der Verletzung geben. Leistung und Zeit eingestellt werden kann zur Erhöhung oder Verringerung der Fläche Insult. </li><li> Machen Sie Bilder von der Faser vor Beschädigungen, zum Zeitpunkt der Beschädigung, alle 2 Sek post-Schäden, danach alle 10 Sekunden bis zu 5 min. Timing kann je nach Bedarf eingestellt werden. Einzelne Bilder können zum Zeitraffer-Filme in Bild J. umgewandelt werden </li><li> Wiederholen Sie die Schritte3,3 bis 3,7 auf bis zu 3 Fasern pro Gericht. </li></ol>

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Es gibt keine Interessenkonflikte.

Die Verwendung der Elektroporation zur fluoreszenzmarkierten Proteine ​​in vivo zu untersuchen ist besonders für die Untersuchung von Muskeln aufgrund der Abwesenheit von geeigneten Zellinie Modelle, die die gesamte Zellstruktur des Muskels originalgetreu geeignet. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Elektroporation und hochauflösende konfokale Mikroskopie, detaillierte Darstellung von Protein-Lokalisierung und Translokation nach der Laser Verwundung bereitzustellen. Diese Methode läs...

Einzelne Muskelfasern sind groß, hoch organisierte Syncytial-Zellen. Es gibt einige Zellkulturmodelle für Muskel; jedoch haben diese Modelle als ihre wichtigste Einschränkung, dass sie nicht vollständig zu reifen Muskelfasern unterscheiden. Beispielsweise werden die C2C12 und L6-Zelllinien von Mäusen und Ratten, jeweils 1-4 abgeleitet sind. Unter den Bedingungen der Serumentzug, die einkernigen &quot;Myoblasten-like&quot; Zellen aufhören Proliferation, Zellzyklus Entzug zu unterziehen, und geben Sie in die myogenen Programm bildet kernige Zellen mit Sarkomere, die so genannte Myotuben. Bei längerer Kulturbedingungen kann Myotuben Kontraktionseigenschaften aufweisen und &quot;zucken&quot; in der Kultur. Menschlichen Zelllinien wurden auch jetzt 5 etabliert. Neben diesen immortalisierten Zellinien können einkernige Myoblasten aus Muskel- und unter den gleichen Bedingungen von Serumentzug wird Myotuben Form isoliert werden. Diese Zelllinien und Primär Myoblastenkulturen sind hoch verwendenvoll, da sie die mit Plasmiden transfiziert oder transduziert mit Viren und zur Basiszelle biologische Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind diese Zellen, selbst wenn veranlasst, Myotuben zu bilden, fehlt vielen der wichtigsten Merkmale von reifen Muskel Organisation. Insbesondere sind Myotuben viel kleiner als einzelnen reifen Muskelfasern und nicht über die normale Form der Muskelfasern. Kritisch Myotuben fehlt Quer (T-) Tubuli, die membranartige Netzwerk für effiziente Ca 2+ Freisetzung der gesamten myoplasm erforderlich. Eine alternative Methode zur primären Myoblasten oder myogenen Zelllinien bringt mit reifen Muskelfasern. Transgenese verwendet werden, um die Expression von markierten Proteinen herzustellen, jedoch ist dieses Verfahren kostenintensiv und zeitraubend ist. In vivo Elektroporation von Maus-Muskel wurde als ein bevorzugtes Verfahren zu seiner Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit 6-10 entstanden. Verfahren zur in vivo Elektroporation und effiziente Isolierung von Muskelfasern have für die Maus flexor digitorum brevis (FDB) Muskel 6 optimiert. Die Verfahren können leicht durchgeführt werden und sind minimal-invasive in vivo-Expression von Plasmiden zu induzieren. Dieser Ansatz wird jetzt mit hochauflösenden bildgebenden Verfahren einschließlich Bildgebung nach der Laser Störung des Sarkolemma 6,7 kombiniert. Die Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen und die Expression von Fluoreszenz-markierten Proteine ​​können verwendet werden, um zellbiologische Prozesse in reifen Muskelfasern zu überwachen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td>Dissection Media&lt;br/&gt; Dilution: 50 ml +100 g BSA</td></tr><tr><td>Collagenase, Type II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>Fiber Digestion&lt;br/&gt; Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)</td></tr><tr><td>Falcon 12-well dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>877229</td><td>Fiber Digestion</td></tr><tr><td>Ringers Solution</td><td></td><td></td><td>Fiber Digestion and Imaging&lt;br/&gt; Dilution: 146 mM NaCl&lt;br/&gt; 5 mM&amp;nbsp;&amp;nbsp; KCl&lt;br/&gt; 2 mM&amp;nbsp;&amp;nbsp; CaCl2&lt;br/&gt; 1 mM&amp;nbsp;&amp;nbsp; MCl2&lt;br/&gt; 10 mM HEPES&lt;br/&gt; pH7.4 in H2O</td></tr><tr><td>1 ml Pipettes</td><td>Axygen</td><td>T-1000-C-R</td><td>Digestion</td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Personna</td><td>94-120-71</td><td>Digestion</td></tr><tr><td>Precision Glide 30 G needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>Dissection</td></tr><tr><td>1x PBS (-/-)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Dissection</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-366-794</td><td>Dissection</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST by Dumont</td><td>#5/45</td><td>Dissection</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-4913</td><td>Dissection</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td>Dissection</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Dissection media&lt;br/&gt; Dilution: 100 mg/50 ml DMEM</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>08772B</td><td>Dissection- used to hold sylgard</td></tr><tr><td>Clay</td><td></td><td></td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Stimulator&amp;nbsp;</td><td>Grass</td><td>s88x</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Clamps</td><td>Radio Shack</td><td>270-356</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Triadine</td><td>Aplicare</td><td>82-220</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Precision Glide 27 G needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305136</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Simulator</td><td>Grass</td><td>SIU-V</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Covidien</td><td>2146</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>Injection&lt;br/&gt; Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 &amp;micro;l 5x stock</td></tr><tr><td>1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>329420</td><td>Injection</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Injection</td></tr><tr><td>35 mm glass bottom Microwell dish</td><td>MaTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Microscopy</td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Life Technologies</td><td>T-13320</td><td>Microscopy&lt;br/&gt; Dilution: Final 2.5 ug/ml</td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Life Technologies</td><td>T-35356</td><td>Microscopy&lt;br/&gt; Dilution: Final 2.5 ug/ml</td></tr><tr><td>Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Plasmid Purification</td></tr></tbody></table>

dna electroporation, isolation and imaging of myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

Elektroporation ist eine minimal invasive Technik, die effizient stellt gereinigte Plasmid-DNA in der flexor digitorum brevis (FDB) Muskelbündel (Figur 1A). Sieben Tage nach der Transfektion fluoreszenzmarkierten Proteins in isolierter Muskelfasern (1B) visualisiert. Isolated Fasern werden dann ausgestrichen und für die Bildgebung vorbereitet auf einem konfokalen Mikroskop. Fasern können laserinduzierte Schädigung unterzogen werden. FM Farbstoff kann...

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DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Aufrufe.  Northwestern University. This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure. 

Serie: DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of human myoblasts. Several mouse models have been created but they either do not truly represent the human physiopathology of the disease or are not representative of the broad spectrum of mutations found in humans. The immortalization of human primary myoblasts is an alternative to this limitation; however, it is still dependent on muscle biopsies, which are invasive and not easily available. In contrast, skin biopsies are easier to obtain and less invasive to patients. Fibroblasts derived from skin biopsies can be immortalized and transdifferentiated into myoblasts, providing a source of cells with excellent myogenic potential. Here, we describe a fast and direct reprogramming method of fibroblast into a myogenic lineage. Fibroblasts are transduced with two lentiviruses: hTERT to immortalize the primary culture and a tet-inducible MYOD, which upon the addition of doxycycline, induces the conversion of fibroblasts into myoblasts and then mature myotubes, which express late differentiation markers. This quick transdifferentiation protocol represents a powerful tool to investigate pathological mechanisms and to investigate innovative gene-based or pharmacological biotherapies for neuromuscular disorders.

This protocol describes the conversion of skin fibroblasts into myoblasts and their differentiation into myotubes. The cell lines are derived from patients with neuromuscular disorders and can be used to investigate pathological mechanisms and to test therapeutic strategies.

Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Forschung

Genetik

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Biologie

Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new muscle fibers under the right conditions. Although SCs can be harvested from muscle tissue and cultured in vitro, the resulting myoblast cells are not very effective in promoting myogenesis when transplanted into host muscle. Surgically exposing the host muscle and grafting segments of donor muscle tissue, or the isolated muscle fibers with their SCs onto host muscle, promotes better myogenesis compared to myoblast transplantation. We have developed a novel technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME). MIME involves passing a surgical needle through the host muscle, drawing a piece of donor muscle tissue through the needle track, and then leaving the donor tissue embedded in the host muscle so that it may act as a source of SCs for the host muscle. Here we describe in detail the steps involved in performing MIME in an immunodeficient mouse model that expresses a green fluorescent protein (GFP) in all of its cells. Immunodeficiency in the host mouse reduces the risk of immune rejection of the donor tissue, and GFP expression enables easy identification of the host muscle fibers (GFP+) and donor-cell-derived muscle fibers (GFP-). Our pilot data suggest that MIME can be used to implant an extensor digitorum longus (EDL) muscle from a donor mouse into the tibialis anterior (TA) muscle of a host mouse. Our data also suggest that when a myotoxin (barium chloride, BaCl2) is injected into the host muscle after MIME, there is evidence of donor-cell-derived myogenesis in the host muscle, with approximately 5%, 26%, 26% and 43% of the fibers in a single host TA muscle showing no host contribution, minimal host contribution, moderate host contribution, and maximal host contribution, respectively.

Minimally Invasive Muscle Embedding MIME - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis

We describe a novel experimental technique that we call Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME), which is based on the evidence that skeletal muscle tissue contains viable myogenic cells that can facilitate donor-cell-mediated myogenesis when implanted into a host muscle.

Minimal-Invasive Muskel einbetten (MIME) - eine neuartige experimentelle Technik, Spender-Zell-vermittelten Myogenesis zu erleichtern

Skeletal muscle possesses regenerative capacity due to tissue-resident, muscle-fiber-generating (myogenic) satellite cells (SCs), which can form new ...

Medizin

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear positioning occurs during skeletal muscle differentiation. Muscle fibers (myofibers) are multinucleated cells formed by the fusion of muscle precursor cells (myoblasts) derived from muscle stem cells (satellite cells) that undergo proliferation and differentiation. Correct nuclear positioning within myofibers is required for the proper muscle regeneration and function. The common procedure to assess myoblast differentiation and myofiber formation relies on fixed cells analyzed by immunofluorescence, which impedes the study of nuclear movement and cell behavior over time. Here, we describe a method for the analysis of myoblast differentiation and myofiber formation by live cell imaging. We provide a software for automated nuclear tracking to obtain a high-throughput quantitative characterization of nuclear dynamics and myoblast behavior (i.e., the trajectory) during differentiation and fusion.

Skeletal muscle differentiation is a highly dynamic process, which particularly relies on nuclear positioning. Here, we describe a method to track nuclei movements by live cell imaging during myoblast differentiation and myotube formation and to perform a quantitative characterization of nuclei dynamics by extracting information from automatic tracking.

Nutzung von Live Imaging Track Kerne während Myoblast Differenzierung und Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

Enzymatische Isolierung und Charakterisierung von Mausmuskelfasern variabler Länge

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal with the short fibers of the flexor digitorum brevis (FDB), which restrains the scope of results dealing with fiber types, limits the amount of biological material available, and impedes a clear connection between cellular physiological phenomena and previous biochemical and dynamical knowledge obtained in other muscles.
This paper describes how to obtain intact fibers from six muscles with different fiber type profiles and lengths. Using C57BL/6 adult mice, we show the muscle dissection and fiber isolation protocol and demonstrate the suitability of the fibers for Ca2+ transient studies and their morphometric characterization. The fiber type composition of the muscles is also presented. When dissociated, all muscles rendered intact, living fibers that contract briskly for more than 24 h. FDB gave short (&#60;1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) and peroneus longus (PL) gave intermediate (1-3 mm), while extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL), and soleus muscles released long (3-6 mm) fibers.
When recorded with the fast dye Mag-Fluo-4, Ca2+ transients of PDQA, PL, and EHL fibers showed the fast, narrow kinetics reminiscent of the morphology type II (MT-II), known to correspond to type IIX and IIB fibers. This is consistent with the fact that these muscles have over 90% of type II fibers compared with FDB (~80%) and soleus (~65%). Moving beyond FDB, we demonstrate for the first time the dissociation of several muscles, which render fibers spanning a range of lengths between 1 and 6 mm. These fibers are viable and give fast Ca2+ transients, indicating that the MT-II can be generalized to IIX and IIB fast fibers, regardless of their muscle source. These results increase the availability of models for mature skeletal muscle studies.

Autor im Rampenlicht: Isolierung langer Muskelfasern aus den Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen zur Untersuchung der Erregungs-Kontraktions-Kopplung zwischen Fasertypen

We describe a protocol to obtain enzymatically dissociated fibers of different lengths and types from six muscles of adult mice: three of them already described (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) and three of them successfully dissociated for the first time (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...