Bisulfit Umwandlung Protokoll Ein Standardprotokoll für die Umwandlung von 2 ug genomische DNA wird nachfolgend beschrieben. Kleinere oder größere Mengen von genomischer DNA (100 pg-200 ug) kann auch Bisulfit erfolgreich behandelt werden. Diese Reaktionsbedingungen Ergebnis in vollständigem Umsatz (99,5 bis 99,7%) von fast allen Ziel-DNA-Sequenz 3. 1. DNA-Präparation Bereiten Sie Proben durch Inkubation genomischer DNA mit Bisulfit DNA Lysis Buffer (2 g t-RNA, 280 ng / ul Proteinase K, 1% SDS) in einem Gesamtvolumen von 18 ul für 1 Stunde bei 37 ° C. Hinweis: Dies ist wichtig, zu erreichen maximale Bisulfit Umwandlung, insbesondere mit DNA aus klinischen Proben, bei denen es noch Protein mit der DNA verbunden sein können, isoliert. 2. DNA Denaturierung <ol><li> Denaturieren 2 pg DNA in einem Volumen von 20 ul durch Zugabe von 2 ul frisch zubereitet 3M NaOH zu einer endgültigen conzentration von 0,3. </li><li> Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 15 min in einem Wasserbad, durch Inkubation bei 90 ° C folgte für 2 min in einem Heizblock. Anschließend wird der Röhrchen auf Eis für 5 min. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4 ° C für 10 s bei 10.000 g, um sicherzustellen, dass die DNA ist an der Unterseite des Rohres. </li></ol> 3. Bisulfit Desaminierung Sulfonierung &amp; Hydrolytische Desaminierung <ol><li> Bereiten Sie frische Lösungen von 10 mM Chinol und gesättigten Natriummetabisulfit pH 5,0 (7,6 g Na 2 S 2 O 5 mit 464 ul 10 M NaOH, aus bis zu 15 ml mit Wasser). Die Lösung von gesättigten Natriumbisulfit wird durch vorsichtiges Umdrehen des Reagenz / H 2 O-Gemisch erreicht, mit einem Minimum an Misch-und Entlüftung. Falls erforderlich, den pH-Wert mit 10 M NaOH, für die vollständige Auflösung der Metabisulfit Hinweis:. Da es sich um eine gesättigte Lösung ist, können kleine Klümpchen noch ungelöst. </li><li> Add 208ul der gesättigten Metabisulfit und 12 ul 10 mM Chinol die denaturierte DNA (20 ul), in einem Endvolumen von 240 ul bis zu einer Endkonzentration von 2,31 m bisulphite/0.5mM Chinol, pH 5,0. Vorsichtig mischen alle Reagenzien und Zentrifuge für 10 Sek. um sicherzustellen, dass alle der Tröpfchen sind an der Unterseite des Rohres. </li><li> Overlay die Proben mit 200 ul Mineralöl. Inkubieren Sie die Proben bei 55 ° C in einem Wasserbad, für 4-16 Stunden. Die Länge der Bisulfit-Behandlung ist abhängig von der Quantität und Qualität der DNA umgewandelt werden. Für die DNA von schlechter Qualität oder degradierte DNA, begrenzen die Inkubationszeit bis 4 Stunden. Hinweis: Es ist wichtig, dass der Bisulfit-Konvertierung stattfindet in der Dunkelheit, um Oxidation zu vermeiden, so dass, wenn das nicht möglich ist wickeln Sie das Röhrchen in Folie vor der Inkubation . </li><li> Am Ende der entsprechenden Inkubationszeit, drehen Sie das Röhrchen kurz in einer Mikrozentrifuge um sicherzustellen, dass alle Flüssigkeit am Boden des Röhrchens. </li><li> Recover der Bisulfit behandelte DNAunter der Ölschicht durch vorsichtiges Pipettieren die DNA-Lösung aus dem Boden des Röhrchens, ohne dabei irgendeine der Mineralöl. </li></ol> Entsalzung <ol start="5"><li> Entfernen Sie alle freien Bisulfitionen, indem sie durch eine Entsalzungssäule und Eluieren in 50 ul Milli-Q-Wasser (MQH 2 O). Je nach Menge und Qualität der genomischen DNA und wie es hergestellt wird, können verschiedene Entsalzungssäulen verwendet werden. Wir verwenden routinemäßig Promega Wizard Clean up Spalten, da diese Spalten geeignet zum Entfernen der SDS in der Vorbereitung der DNA verwendet vor der Umwandlung sind. </li></ol> Alkali Desulfonierung <ol start="6"><li> Die Bisulfit-Addukt wird aus dem Uracil Ring Desulfonierung entfernt. Desulphonate indem 5,5 ul frisch zubereitet 3M NaOH bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M, dann inkubieren die Proben bei 37 ° C für 15 min. </li><li> Kurz zentrifugieren und fügen 1 ul t-RNA (10 mg / ml). </li> &lt;li&gt; neutralisiert man die Lösung durch die Zugabe von 33 ul von Ammoniumacetat (NH 4 O Ac), pH 7,0 bis zu einer Endkonzentration von 3M. </li><li> Ethanol-Fällung der DNA durch Zugabe von 330 ul eiskaltem 100% Ethanol, gut mischen durch Umdrehen. Leave at-20μC für 1 h bis über Nacht. Zentrifuge bei 14.000 g für 15 min bei 4 ° C. Entfernen Sie alle Spuren von Überstand und an der Luft trocknen die gefällte DNA für ~ 20 min. </li><li> Re-suspend das DNA-Pellet in 50 ul / ug von 0,1 TE (10 mM Tris-HCL, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) oder H 2 O. Lassen Sie bei Raumtemperatur ca. 2 Stunden. Gelegentlich Wirbel der Rohre, um die DNA zu gewährleisten ist gelöst, gefolgt von einer schnellen Zentrifuge. </li><li> Verwenden Sie sofort für die PCR-Amplifikation, oder bei -20 ° C für 1-10 Jahre, je nach Menge und Qualität der DNA. </li></ol> 4. PCR-Amplifikation Primer Design <ol><li> Effektives Design von PCR-Bisulfit-Konvertierung-spezifische Primer ist Crucial dafür, dass effiziente, unvoreingenommene Verstärkung komplett konvertierter DNA auftritt. Die folgenden Richtlinien werden verwendet, um Primer-Design zu unterstützen. </li></ol> Primer Design Guidelines <img src="files/ftp_upload/3170/3170list1.jpg" /> Thermocyling <ol start="2"><li> Zur Prüfung auf proportional PCR-Amplifikation von methylierter und nicht methylierter DNA, verwenden Sie einen 50:50 Methylated / Unmethylierte voll Bisulfit umgewandelt Kontrollprobe und verstärken mit der Bisulfit-Konvertierung-spezifische Primer unter den optimierten PCR-Reaktionsbedingungen (Abbildung 3). Für die 50:50 Methylated: Unmethylierte Kontrolle, in vitro Sssl methylierte DNA und entweder ganze Genom amplifiziert (WGA) DNA oder Vollblut DNA zu verwenden. Bitte beachten Sie, dass einige Gene natürlicherweise in Blut methyliert werden und daher in diesen Fällen ist es am besten, nur WGA DNA als &quot;Unmethylierte&quot; zu kontrollieren. </li><li> Bereiten PCR-Amplifikation Reaktionsmischungen in 100 &amp; mu; l Aliquots mit 2 ul der Bisulfit-konvertierte genomische DNA, 200 uM dNTPs, 1 uM Primer, 1,5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCL, pH 8,3 und 0,15 ul Taq-Polymerase. </li><li> In einem Temperaturgradienten Thermocycler, stellen Sie den Lauf-Reaktion in einem Gradienten + / - 3 ° C von der vorhergesagten Tm der Primer über 10 Tuben </li></ol><img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170table1.jpg" /><ol start="5"><li> Um zu testen, dass die methylierte und nicht methylierter Amplikons im Verhältnis wurden verstärkt, kann das Amplikon mit einer informativen Restriktionsenzym, wie Taq 1 (TCGA), dass methylierte DNA verdauen verdaut werden, aber nicht verdauen methylierter DNA, wenn die Restriktionsenzymstelle ist verändert nach Bisulfit-Konvertierung in TTGA. Das Ausmaß der Verdauung kann visualisiert werden durch Agarosegelelektrophorese (Abbildung 3A). Alternativ können SYBRGreen (0,2 ul von 1:1000 Verdünnung) der PCR-Reaktion hinzugefügt unddas Ausmaß der Methylierung kann durch Ausführen Wärme Dissoziation Grundstücke in einer real-time PCR Thermocycler (Abbildung 3B) beurteilt werden. </li><li> PCR Reaction Mix, MgCl 2-Konzentration und Thermocycling Bedingungen müssen möglicherweise angepasst werden, um PCR-Effizienz zu erhöhen oder proportional PCR-Amplifikation von methylierter und nicht methylierter PCR-Fragmente zu gewährleisten. </li><li> Nachdem die PCR-Bedingungen optimiert sind, kann die PCR-Amplifikation von Bisulfit-konvertierte Proben durchgeführt werden. Hinweis: Sobald die Tm ist optimiert einem Temperaturgradienten PCR müssen nicht verwendet werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für Bisulfit-PCR-Amplifikation Optimierung ist in Abbildung 3 dargestellt. Optimal PCR-Amplifikation Bedingungen sollten methylierter und nicht methylierter Amplikons in Proportion und ohne Vorurteile zu verstärken. 3A zeigt ein Agarosegel mit einem Temperaturgradienten PCR-Amplifikation Profil aus einer Mischung von 50% methylierter und nicht methylierter DNA. The PCR-Produkte wurden mit einem Restriktionsenzym, Taq 1 (TCGA), dass methylierte verdauen (M) DNA behandelt worden, aber nicht (U) DNA methyliert verdauen als Restriktionsenzymstelle von Bisulfit-Konvertierung in TTGA verändert wird. Eine gleiche Menge geschnittenen und ungeschnittenen PCR-Produkt ist zu erwarten, wenn methylierte und nicht methylierter DNA im Verhältnis verstärkt wird. Es kann auf diesem Gel zu erkennen, dass die optimale thermocyling Bedingungen für nicht-Bias-Amplifikation Mit 56,1 ° C (T). Vollständige Umsetzung der Bisulfit-DNA kann auch durch Vergärung mit Cytosin-Ort-spezifische Enzym wie Hpa III (CCGG) analysiert werden. Hpa III wird nur verdauen, wenn die Konvertierung ist fehlgeschlagen, da die Restriktionsstelle gepflegt werden. Wenn die Konvertierung abgeschlossen ist die Restriktionsstelle wird TCGG oder TTGG je nach Methylierungsstatus der DNA umgewandelt werden. Komplette Bisulfit DNA Konvertierung kann in Abbildung 3A (H) zu sehen. 3B zeigt ein Echtzeit-Dissoziation Plot,kann auch als ein Werkzeug, um festzustellen, ob es irgendeine Verstärkung Bias auf die Temperatur, bei der die verschiedenen Moleküle distanzieren Basis verwendet werden. In dieser Figur ist ersichtlich, dass die PCR wurde verstärkt methyliert (M) und nicht methylierter (U) DNA im Verhältnis von einer Mischung aus 50% methylierter und nicht methylierter DNA im Vergleich zur Kontrollgruppe Amplifikation von voll methylierter und nicht methylierter DNA, die bei 82.1μC distanzieren werden und 78.9μC jeweils. Nach der Optimierung der thermocyling und Reaktionsbedingungen Bisulfit behandelten Proben können mit spezifischen Strang und Bisulfit-spezifischen Primern in einem Einzel-oder halb verschachtelte PCR-Reaktion amplifiziert werden. Das resultierende PCR-Fragmente können sichtbar gemacht werden durch Agarosegelelektrophorese und sequenziert entweder direkt (Abbildung 4A) oder durch Klonierung und Sequenzierung. Nach Klonierung und Sequenzierung der Methylierungsstatus der einzelnen Moleküle können in Tabellenform ausgegeben werden, in einer Bisulfit-Karte (Abbildung 4B), der Heterogenität der VisualisierungMethylierung. Hoher Durchsatz quantitative Methylierungsanalyse kann vorgeformten Einsatz von Technologie, wie sie von der Sequenom EpiTYPER Methode genutzt werden. Mit dieser Methode ist Bisulfit-konvertierter DNA mit Bisulfit spezifischen PCR amplifiziert und gefolgt von einem proprietry Spaltung Prozess. Die resultierenden Fragmente werden durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie mit dem spezifischen Spektrum abhängig von der Anwesenheit von methylierter Cytosine (Abbildung 5A) quantifiziert. Eine Zusammenfassung der Methylierung Verhältnisse in der Probe kann dann in Form von einem Epigramm (Abbildung 5B) oder Methylierung Plot (Abbildung 5C) extrapoliert werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig1.jpg" /> Abbildung 1. Methylierte CpG schematisch. In der normalen Zelle, Promotor-assoziierten CpG-Inseln sind überwiegend nicht methylierter (grau), während CpG sites innerhalb Gen Körper spärlich und meist methyliert (rot) sind. Das Panel auf der rechten Seite erweitert die molekulare StrukturAbbildung der DNA an einer einzelnen CpG Website und zeigt Methylierung mit einer CH3-Molekül auf Kohlenstoff 5 von Cytosin. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig2.jpg" /> Abbildung 2. . Chemische Umwandlung schematische Analyse der DNA-Methylierung beinhaltet vier Stufen, wie gezeigt, Denaturierung, Bisulfit-Konvertierung, PCR-Amplifikation und-analyse. In der rechten Seite, sind Änderungen an den Cytosin-Molekül, das während der Bisulfit-Konvertierung auftreten dargestellt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig3.jpg" /> Abbildung 3. Optimierung der PCR-Amplifikation. A. Agarosegelelektrophorese mit einem Temperaturgradienten PCR-Amplifikation Profil aus einer Mischung von 50% methylierter und nicht methylierter DNA. Fragmente wurden entweder mit Taq1 (T) oder HpaIII (H), die methylierte DNA und nicht Bisulfit-konvertierter DNA bzw. zu verdauen verdaut worden. B. Wärme Dissoziationskurve Analyse zeigt eine Gleichungl Anteil von methylierter und nicht methylierter DNA (rote Linie 50/50 Mischung), um die Regelverstärkung von permethylierten (rosa Linie, M) und nicht methylierter DNA (grüne Linie, U), die bei 82,1 ° C und 78,9 ° C bzw. distanzieren verglichen. <img alt="Abbildung 4a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4a.jpg" /> <img alt="Abbildung 4b" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4b.jpg" /> Abbildung 4. Beispiel für die direkte Sequenzierung und eine Bisulfit-Karte. A. Sequence Spur von drei verschiedenen Zelllinien mit CpG sites in gelb hervorgehoben. Zell-Linie X zeigt 100% Methylierung an allen drei CpG während Zelllinien Y und Z unterschiedlichem Ausmaß der Methylierung als durch überlappende G / A-Signale erkennen zu zeigen. B. Repräsentative Bisulfit Karte zeigt die Dichte der Methylierung (rote Punkte) an den einzelnen CpG sites, wie durch direkte Sequenzierung der einzelnen Klone bestimmt. <img alt="Abbildung 5a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig5a.jpg" /> Abbildung 5. Hochdurchsatz DNA-Methylierungs-Analyse mit Sequenom. A. Spectrum Ansicht mit Sequenom epiTYPER Technologie. DNA-Fragmente Display spezifische Spektren, je nach Menge der DNA-Methylierung zu präsentieren. B. Epigram Zusammenfassung der Anteil der DNA-Methylierung bei jedem CpG site für vier verschiedene Zelllinien. C. Methylierung Inhaltsangabe aus dem Sequenom Epigram abgeleitet.

<ol>
	<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+genomic+sequencing:+systematic+investigation+of+critical+experimental+parameters.">Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.</a> Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+bisulphite+modification+and+analysis.">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

DNA-Methylierung Analyse durch Sequenzierung von Bisulfit-konvertierter DNA ist ein gut etabliertes und vielseitige Methode, dass die Identifizierung und Quantifizierung von DNA-Methylierung bei single nucleotide Auflösung ermöglicht. Allerdings stützt sich Bisulfit Umwandlung und anschließende Analyse auf der Prämisse, dass die DNA wurde vollständig mit allen methylierten Cytosin wird in Uracil deaminiert und nur methylierte Cytosine verbleibenden un-reaktive umgewandelt. Wenn die Konvertierung nicht vollständig ist, können Probleme mit der Analyse ergeben sich da nicht umgesetzte unmethylierte Cytosine kann fälschlicherweise als methylierte Cytosine interpretiert werden. Bisulfit Umwandlung kann in verschiedenen Phasen optimiert werden, um den Prozentsatz der Umwandlung zu maximieren. Für die DNA vollständig umgestellt werden sie zuerst muss einzelsträngige, so dass Cytosinresten der Bisulfit-Ionen ausgesetzt sind. Der erste Schritt, DNA-Denaturierung, ist kritisch und kann die Quelle der unvollständigen Umwandlung werden, wenn die DNA nicht vollständig denaturiert. Um zu gewährleisten,dass die DNA vollständig denaturiert wird, ist es wichtig, dass die Reaktion Parameter einschließlich Entfernung aller assoziierten Protein, geeignete Salzkonzentration, Inkubationstemperatur und geeignet ist, um DNA in einzelsträngige Konformation zu halten sind. Es ist wichtig, an die frische 3M NaOH verwenden und für eine angemessene Inkubationszeit ermöglichen. Wenn die DNA widersteht Denaturierung, können einige Modifikationen, um das Protokoll einschließlich der Ausweitung des Inkubationszeit auf 30 Minuten oder Fragmentierung der DNA vor der Denaturierung zu erleichtern DNA-Denaturierung. Darüber hinaus können Einzelstrang-DNA (ssDNA) re-Glühen zu DNA (dsDNA) während der Bisulfit-Konvertierung Reaktion zu verdoppeln. Durchführung der Reaktion bei einer höheren Temperatur (90-95 ° C) entweder periodisch oder kontinuierlich während der Bisulfit-Reaktion kann Hilfe der Aufrechterhaltung der ssDNA. Es ist jedoch wichtig zu wissen, dass DNA-Abbau stark bei diesen höheren Temperaturen beschleunigt. Verschiedene Reagenzien können ebenfalls hinzugefügt, um re-Glühen von th stören werdene DNA-Stränge, wie Harnstoff. Die Konzentration von DNA und deren Qualität kann auch Auswirkungen auf die Effizienz der Bisulfit-Reaktion und ultimative PCR-Ausbeute. DNA-Abbau ist eine Einschränkung der Bisulfit-Konvertierung Protokoll. Die chemische Behandlung der DNA werden verschiedene Brüche in ssDNA und einige der harten Bedingungen, die für komplette Bisulfit Konversion einschließlich High Bisulfit-Konzentration, lange Inkubationszeiten können DNA-Abbau zu beschleunigen. Unter dem Standard-Reaktionsbedingungen beschrieben, ist die DNA-Abbau nicht ein allgemeines Problem jedoch, wenn Protokoll Änderungen eingeführt werden, wie Sequenzen, die refraktär auf Umwandlung sind, für die DNA-Templates, die abgebaut oder von schlechter Qualität, wie FFPE Proben werden dann DNA-Abbau kann eine erhebliche Einschränkung geworden. Formalin fixiert, in Paraffin eingebetteten (FFPE) und degradierte DNA-Proben werden effektiv umgewandelt und verstärkt Bisulfit mit diesem ProtokollAber Änderungen, um sicherzustellen, dass die DNA nicht weiter abgebaut werden empfohlen. Die Verwendung eines Trägers RNA, wie t-RNA wird empfohlen. Auch Glykogen als Träger hinzugefügt werden, wenn DNA-Konzentration ist gering (&lt;200 ng). Da DNA aus FFPE Geweben isoliert ist bereits fragmentiert und weitere Fragmentierung erfolgt bei Desaminierung, muss darauf geachtet werden weitere Abbau zu minimieren. Nicht-Fragment DNA weiter vor Denaturierung und begrenzen die Inkubationszeit für die Bisulfit-Reaktion zu 4 Stunden. Design-Amplikons nicht größer als 300 bp durch fragmentierte DNA. Ein weiterer Faktor, PCR-Amplifikation beeinflussen können, dass Bisulfit Umwandlung von nicht methylierten Cytosin die Komplexität der DNA-Vorlage reduziert. Die folgenden Primer-Design-Protokoll in Abschnitt 4.1, erhöhte Primer Länge und nested PCR beschrieben können alle dazu beitragen, Spezifität und PCR Ausbeute zu erhöhen. Schließlich ist da die DNA-Vorlage in bisulph verändertite Wandlung, Verstärkung Bias kann ein Problem sein. Stellen Sie sicher, dass proportional PCR-Amplifikation von methylierter und nicht methylierter Vorlagen mit einer Kontrollgruppe 50/50 M / U DNA-Mix wird überprüft, wie im Protokoll beschrieben, siehe Abbildung 3. Stellen Sie außerdem sicher, dass Amplifikation nur umgewandelt Vorlagen auftritt mit HpaIII Restriktionsenzym und Gelelektrophorese (Abbildung 3). Die PCR-Bedingungen müssen möglicherweise durch Variation der Temperatur und / oder Magnesium-Konzentration oder Verlängerung Erweiterung optimiert werden. Einige Vorlagen werden als besonders problematisch und Primer-Position kann angepasst werden müssen oder degenerierte Primer können verwendet werden müssen. Next Generation Sequencing-Techniken entwickeln sich rasant zu einer ähnlichen Auflösung zu erreichen, um genomische Sequenzierung Bisulfit und dritten Generation Einzelmolekül-Sequenzierung hat das Potenzial, für die Analyse von sowohl primärer DNA-Methylierung und ohne die Notwendigkeit für Bisulfit-Sequenzierung zu ermöglichen. Doch weit verbreitete Verfügbarkeit und specificity dieser Techniken noch einige Zeit weg. Bisulfit-Sequenzierung genomischer ist der Goldstandard in der Methylierungsanalyse und ist ein robustes Protokoll. Das Verfahren wurde bis zu dem Punkt, wo die gemeinsamen Probleme und Einschränkungen gelöst haben Fortschritte gemacht und die Anwendungen von einzelnen Gen-Analysen mit hohem Durchsatz und ganze Genom-Analyse von Clark et al erweitert. 2006 4. Troubleshooting-Richtlinien und weitere Empfehlungen sind in Tabelle 1 dargestellt. Es wird vorgeschlagen, dass die optimale Vorgehensweise, zunächst folgen Sie den Standard-Protokoll und nur vorstellen Modifikation, ob und wann ein Problem auftaucht ist. <img src="/files/ftp_upload/3170/3170table2.jpg" alt="Tabelle 2" /> Tabelle 1. Richtlinien für die Problembehebung

<ol><li> Natriummetabisulfit (Ajax Finechem) </li><li> Hydrochinon (Merck) </li><li> Wizard DNA-clean-up System (Promega) </li></ol>

dna methylation: bisulphite modification and analysis

Epigenetik beschreibt die vererbbare Veränderungen in der Gen-Funktion, die unabhängig voneinander auftreten, um die DNA-Sequenz. Die molekulare Grundlage der epigenetischen Genregulation ist komplex, aber im Wesentlichen um Modifikationen an der DNA selbst oder die Proteine, mit denen DNA assoziiert. Der überwiegende epigenetische Veränderung der DNA in Säugetier-Genomen ist die Methylierung von Cytosin Nukleotide (5-MeC). DNA-Methylierung enthält Anweisungen, um die Genexpression Maschinen wie, wo und wann das Gen ausgedrückt werden sollte. Das primäre Ziel-Sequenz für die DNA-Methylierung in Säugetieren ist 5&#39;-CpG-3 &#39;-Dinukleotide (Abbildung 1). CpG-Dinukleotide sind nicht gleichmäßig über das Genom verteilt, sondern sind in Regionen repetitive genomische Sequenzen und CpG &quot;Inseln&quot; gewöhnlich mit Gen-Promotoren (Abbildung 1) assoziiert konzentriert. DNA-Methylierungsmuster sind früh in der Entwicklung, gegründet moduliert und im Gewebe spezifische Differenzierung gestört in vielen Erkrankungen wie Krebs. Um understand die biologische Rolle von DNA-Methylierung und deren Rolle in der menschlichen Krankheit, präzise, ​​effiziente und reproduzierbare Methoden zur Erkennung und Quantifizierung von einzelnen 5-MECs. Das Protokoll für die Bisulfit-Konvertierung ist der &quot;Goldstandard&quot; für die DNA-Methylierung und erleichtert die Identifizierung und Quantifizierung von DNA-Methylierung bei single nucleotide Auflösung. Die Chemie der Cytosin-Desaminierung von Natriumbisulfit in drei Schritten (Abbildung 2). (1) Sulfonierung: Der Zusatz von Bisulfit an die 5-6 Doppelbindung von Cytosin (2) Hydrolic Desaminierung: hydrolytische Desaminierung der resultierenden Cytosin-Bisulfit-Derivat geben einen Uracil-Bisulfit-Derivat (3) Alkali Desulfonierung: Die Entfernung der Sulfonat Gruppe durch eine Alkalibehandlung zu Uracil. Bisulfit bevorzugt desaminiert Cytosin zu Uracil in Einzelstrang-DNA, während die 5-MeC ist refraktär gegenüber Bisulfit-vermittelte Desaminierung. Nach PCR-Amplifikation ist Uracil verstärktwie Thymin, während 5-MeC Rückstände als Cytosine bleiben, so dass methylierte CpG von methylierter CpG durch Vorhandensein eines Cytosin &quot;C&quot; versus Thymin &quot;T&quot;-Rest werden während der Sequenzierung aus. DNA-Modifikation durch Bisulfit-Konvertierung ist ein gut etabliertes Protokoll, das für viele Methoden der DNA-Methylierung Analyse genutzt werden können. Da der Nachweis von 5-MeC von Bisulfit-Konvertierung wurde zuerst von Frommer et al. 1 und Clark et al. 2, Methoden um Bisulfit-Konvertierung von genomischen DNA-Konto für die Mehrheit der neuen Daten auf Basis von DNA-Beweis gestellt. Verschiedene Methoden der post-PCR-Analyse kann verwendet werden, je nach dem Grad der Spezifität und Auflösung der Methylierung erforderlich. Klonierung und Sequenzierung ist immer noch die am leichtesten zugängliche Methode, die single nucleotide Auflösung für Methylierung der gesamten DNA-Molekül geben kann.

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DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Der Goldstandard für die DNA-Methylierung ist genomische Sequenzierung von Bisulfit-konvertierter DNA. Diese Methode nutzt die erhöhte Empfindlichkeit von Cytosin verglichen mit 5-Methylcytosin (5-MeC) zu Desaminierung unter sauren Bedingungen Bisulfit. Unmethylierte Cytosine kann von methylierter Cytosine nach PCR-Amplifikation der Ziel-genomischer DNA unterschieden werden.

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

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Research

JoVE Journal

Biology

104.2K Aufrufe.  Garvan Institute of Medical Research. Der Goldstandard für die DNA-Methylierung ist genomische Sequenzierung von Bisulfit-konvertierter DNA. Diese Methode nutzt die erhöhte Empfindlichkeit von Cytosin verglichen mit 5-Methylcytosin (5-MeC) zu Desaminierung unter sauren Bedingungen Bisulfit. Unmethylierte Cytosine kann von methylierter Cytosine nach PCR-Amplifikation der Ziel-genomischer DNA unterschieden werden.

Serie: DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS Bauelementherstellung und Oberflächenmodifizierung

Forschung

Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Bestimmung der DNA-Methylierung von geprägten Genen in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

Genetic Modification und Rekombination von Speicheldrüsen Organkulturen

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Reduzierte Gravitationsbereich Hardware Demonstrationen eines Prototyps Miniaturisierte Durchflusszytometer und Companion Microfluidic Mischtechnik

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.