Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Yale Klima und Energie Institut und der US National Science Foundation unterstützt.

Ein. Aufzucht Grasshoppers unter Stress und Stress Free AGB <ol><li> Mit 0,5 m 2 kreisförmige, geschlossene Mesokosmen zur Auswanderung oder Einwanderung von Tierarten (Abbildung 1) zu verhindern. Konstruieren Mesokosmen mit 2,4 m Länge 1,5 m hoch ¼ &quot;Mesh Aluminium-Zaun als ein Gerüst. Bedecken Sie den Zaun mit 2,5 m Länge 1,75 m hohe Aluminium-Fenster-Screening über die Ober-und Unterseite des Zauns gefaltet und geheftet zusammen falten. Registriert das Fechten Enden, um einen geschlossenen Kreis zu bilden und dann die überlappende Fenster Stapelfasern Screenen zusammen, um eine Dichtung zu schaffen. Den Mesokosmos in den Boden im Bereich von gräbt ein 10 cm tief von 4 cm breiten Graben um die Basis des mesocosom, sinken die in Mesokosmos der Graben und dann stampfen die Grasnarbe des Grabens um den versunkenen Teil des Mesokosmen. Staple ein rundes Stück Fenster-Screening an die Spitze der Mesokosmen. </li><li> Array Mesokosmen in einer replizierten gepaart experimentellen design im Feld. Plot Standorte sollten ausgewählt werden, um die Pflanzenarten Nämlichkeitskontrollen und relativen Abdeckung passen. Sink Käfigen 10 cm in den Boden am Grundstück Ort. </li><li> Mit einem Sweep net, sammeln frühen (2 nd) instar grasshopper Nymphen und lagern sie in den Mesokosmen an natürlichen Felddichten. </li><li> Mit einem Sweep net, erfassen Individuen einer beherrschenden sit-and-wait Jagd (nicht Web Weben) spider Raubtierarten. Kleber schloss die Spinne Cheliceren (Mundwerkzeuge verwendet, um Beute zu unterwerfen) mit schnell trocknenden Zement entkoppelt Risiko Effekte aus tatsächlichen Überleben Auswahl Bevorzugung einzelner Heuschrecken mit besseren Fähigkeiten spider Prädation entziehen. Stock die Spinnen bei Felddichten um ein Mesokosmen von jedem Paar. Dies wird der Stress-Behandlung sein. Mesokosmen ohne Spinnen wird die stressfreie Behandlung. </li><li> Lassen grasshopper Nymphen zu spät (4 th und 5 th) instar Stufen zu entwickeln. Sammle alle Personen aus den Käfigen und randomly weisen Personen aus jedem Käfig auf eine der drei nachfolgenden Assay Gruppen: (1) Validierung von physiologischen Stress Zustand, (2) Validierung der Verschiebung im Körper elementaren Stöchiometrie, (3) die mikrobielle Zersetzung. </li></ol> 2. Validieren Grasshopper Spannungszustand <ol><li> Messen grasshopper Standard metabolische Rate (SMR), als die Rate der Kohlendioxid-Emissionen ( <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> ) In einer aus eventuellen Durchströmung Respirometrie System mit einem Luftdurchsatz von 200 ml / min. Entfernen Wasserdampf, indem strömende Luft durch ein Trockenmittel. </li><li> Nach Nahrungsentzug von 16 h (Wasser sollte vorhanden sein), wiegen einzelne Heuschrecken (± 0,1 mg), und legen Sie sie in transparent 50 ml (9,2 cm L x 2,0 cm D) Respirometer Kammern und es ihnen ermöglichen, von der Handhabung für mindestens erholen 10 Minuten vor Beginn der Messungen. </li><li> Unter konstanten durchschnittlichen Umgebungstemperatur<html> Temperatur (± 1% Standardfehler Variation) innerhalb der Kammer Respirometer, analysieren ausgeatmete Luft mittels einer Infrarot-CO 2-Analysator (z. B. Qubit S151-1 ppm Auflösung). Messen Sie den Mittelwert minimalen Steady-State- <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> für 10 min. </li><li> Der Analysator bietet fraktionierten CO 2-Konzentration (parts-per-million), doch SMR sollte als Wert berichtet werden, so muss man die Aufnahmen als transformierte <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> = FR i ( <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> - <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg"/> ) / {1 - <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> [1 - (1/RQ)]}, wobeiiles/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg &quot;/&gt; = aus eventuellen fraktionierten CO 2-Konzentration; <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> = Excurrent fraktionierten CO 2-Konzentration, FR = Durchfluss (ml min -1); RQ = respiratorischen Quotienten, übernahm gleich 0,85 in pflanzenfressenden Tieren. </li></ol> 3. Validieren Umschalttaste in Body Elemental Stöchiometrie <ol><li> Bewerten Carbon: Stickstoff (C: N)-Gehalt einer Probe von Heuschrecken aus dem Feld Mesokosmen gesammelt. </li><li> Reduzieren Variation in C: N aufgrund der jüngsten Verzehr von Lebensmitteln, indem grasshopper Darminhalt unter einem Binokular. </li><li> Freeze-Dry den leeren Darm und Körper für 48 Stunden und dann schleifen die einzelnen Karkasse und gut zu einem homogenen Pulver. </li><li> Messen C: N-Gehalte des Pulvers unter Verwendung einer CNH Autoanalyzer. </li></ol> 4.Mikrobiellen Abbau <ol><li> Ort repliziert Paar PVC Kragen (15,4-cm dia., Eingesetzt ~ 4 cm in den Boden) im Bereich Website (3C). Entfernen Sie alle Vegetation innerhalb sie über Clipping an der Bodenoberfläche. Diese Halsbänder sind für die Zersetzung Maßnahmen verwendet. Zusätzlich zu etablieren eine Reihe von PVC Kragen über das Feld Website als 13 C natürlich reichlich Kontrollen (siehe unten), zu denen weder Heuschrecken noch Gras-Wurf hinzugefügt handeln. </li><li> Um ein Kragen in jedem Paar hinzuzufügen 2 intakt, gefriergetrocknete Kadaver von Heuschrecken (Aufnahme der Biomasse aufgenommen) aufgezogen mit predator Risiko wie oben beschrieben mit Feld-Käfigen beschrieben. Zum anderen Kragen in jedem Paar hinzuzufügen 2 intakte gefriergetrockneten Tierkörper ohne predator Risiko aufgezogen. </li><li> Bedecken Sie die PVC Kragen mit einem Bildschirm zur Heuschrecke Entfernung durch Aasfresser aus den Parzellen zu verhindern und ließ die Heuschrecke Karkassen für 40 Tage zersetzen. </li><li> Während Karkassen zersetzt werden, label Gras-litter mit 13 C. <ol><li> Konstrukt eine klare Plexiglas Kammer (60 cm x 60 cm x 1,5 m) mit einem Einlaß und Auslaßventil (Abbildung 3B). </li><li> Sink ein Quadrat 60 cm x 60 cm Holzrahmen mit einer Gummidichtung mit Silikonfett 5 cm in den Boden (3B) beschichtet. </li><li> Schieben der Kammer über dem Holzrahmen so daß die Kammer abgedichtet durch den Gummi (3B) wird. </li><li> Schließen Sie die Kammer Einlässe Druckgasflaschen mit 99 Atom-% 13 CO 2. Pflanzen im Inneren der Kammer wird mit 13 C, wo CO 2-Konzentrationen bei Umgebungstemperatur Niveau gehalten werden beschriftet werden (weil erheben Konzentrationen verändert Pflanzen Kohlenstoff Partitionierung). Umgebungs Ebenen werden durch nur pulsierende markiertem CO 2 für kurze Zeiträume aufrechterhalten. Außerdem sind Kammer Temperaturen überwacht und Kammern werden entfernt, wenn die Temperaturen 5 ° C eine Reichweitebove Umgebungstemperatur. </li><li> Eine Woche nach der Markierung, vergleichen δ 13 C des Grases-Wurf mit natürlichen Häufigkeit von Werten aus einer Stichprobe von identischen Grasarten mit einer Thermo DELTAplus Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (Thermo, San Jose, CA, USA) gesammelt. </li></ol></li><li> Nach 40 Tagen, 10 g luftgetrocknete 13 C-markierten Gras-Wurf auf jeden Kragen, die zuvor mit Heuschrecke Karkassen geändert worden. </li><li> Überwachen Sie die Mineralisierung von Gras-Wurf in situ in 75 Tagen durch Kappung jeden Kragen und Verfolgung sowohl insgesamt Bodenatmung und die Atmung von 13 CO 2. Dies geschieht mit Hilfe eines Durchfluss-Kammer-Technik, wo Gasproben aus jedem Kragen überwacht werden, in Echtzeit, für 8 min jeweils mit Cavity Ring-Down-Spektroskopie (CRDS; Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA; Modell: G1101 -i). CRDS ermöglicht es, gleichzeitig verfolgen sowohl Gesamt-und δ 13 Cder Bodenatmung. </li><li> Schätzen Sie den Beitrag von 13 C-markierten Gras-Wurf insgesamt Bodenatmung mit Isotopen Mischen Gleichungen. Die Menge an Gras-Wurf abgeleiteten CO 2 wird wie folgt berechnet: (. Δ 13 C Atmung - δ 13 C nat.abn) C Gras-Wurf stammt = C insgesamt × / (δ 13 C Gras-Wurf - δ 13 C nat . ABN), wobei C gesamt die Gesamtmenge an C veratmet während einer gegebenen Messung ist, ist δ 13 C Atmung die δ 13 C-C der ausgeatmete für Kragen mit markiertem Gras Einstreu, δ 13 C nat.abn geändert. ist der Mittelwert δ 13 C von ausgeatmete C in den drei natürlichen Häufigkeit Kragen (dh diejenigen, die nicht mit Einstreu wurden geändert) und δ 13 C Gras-Wurf wird die δ 13 C des Grases Wurf hinzugefügt, um die Zusammenarbeitllars. </li><li> Überwachung sowohl Bodentemperatur und Feuchtigkeit über das Experiment mit handgehaltenen Sonden, um Unterschiede in Bodenatmung durch Unterschiede in der Temperatur und Feuchtigkeit zu korrigieren. </li><li> Obwohl für den Feldeinsatz bestimmt sind, das Cavity Ring-Down-Spektroskopie Instrument (Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA; Modell: G1101-i) sind Lesungen empfindlich auf Bewegung. Daher sollte man errichten eine Basis Messstation zentral zu allen der Grundstücke mit PVC Kragen, und schließen Sie das Gerät an den Kragen mit Längen von PVC-Schlauch. </li></ol>

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Reihenfolge der hier vorgestellten Methoden sollten systematische Messung der Art und Weise Stress in Spezies, die oberirdischen Nahrungsnetze erlauben kann prime mikrobiellen Gemeinschaften in einer Weise, die zur Veränderung der anschließenden Zersetzung der Streu führen. Die Methoden sind ideal für das Studium Ökosysteme Arthropoden Verbraucher und krautigen Pflanzen umfasst, weil intakte Nahrungsketten räumlich abgegrenzt werden kann und sich in Mesokosmen. Räumliche Variabilität kann bestehen aufgrund Gradienten im Hintergrund Bodenfeuchte, Bodentemperatur, Anlagen Nährstoffgehalt, etc. Das Design der Studie erlaubt es, array mescosms und PVC Kragen entlang räumlichen Umwelt Gradienten blockieren und dadurch Konto für solche umweltbedingte Variation bei der Analyse für Effekte. Obwohl für den Feldeinsatz bestimmt sind, das Cavity Ring-Down-Spektroskopie Instrument (Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA; Modell: G1101-i) sind Lesungen sensitive auf Bewegung. Daher sollte man errichten eine Basis Messstation zentral zu allen der Grundstücke mit PVC Kragen, und schließen Sie das Gerät an den Kragen mit Längen von PVC-Schlauch. Soil Streuzersetzung traditionell durch Einschließen bekannten Mengen von Müll in Fiberglas Mesh-Taschen, Ablegen der Säcke auf der Bodenoberfläche auf dem Feld und in regelmäßigen Abständen erneut die Messung der Säcke Müll Verschwindensrate (Zersetzung) Quantifizierung gemessen worden. Die Einschränkung dieser Methode ist, dass man unfähig ist, das Schicksal der zerlegt Angelegenheit zu verfolgen oder zu bestimmen, den Beitrag bis 2 Mineralisierung der Bodenverbesserung (hinzugefügt Wurf) aus dem Hintergrund Boden CO 2 Mineralisierung CO ist. Die Tracer-Methode unter Verwendung von markierten CO 2 hier vorgestellten lindert diese logistische Einschränkung. Ecosystem Ökologie und Biogeochemie haben unter dem Arbeitstitel Paradigma betrieben, weil uneaten Anlage-Wurf umfasst die Mehrheit der Detritus, sind unterirdische Ökosystem-Prozesse nur marginal von Biomasse Eingänge aus höheren trophischen Ebenen in der oberirdischen Nahrungsnetze, wie Pflanzenfresser sich 6 beeinflusst. Allerdings gibt es immer mehr Belege dafür, dass die Arten in höheren trophischen Ebenen von Ökosystemen einen tiefgreifenden Einfluss auf unterirdische Prozesse 1,4,5 haben. Die hier vorgestellte Methode steht die Quantifizierung des Beitrags der höheren trophischen Ebenen zu verbessern, entweder direkt durch Biomasse aus Karkasse Abscheidung (z. B. 12, 13) oder Ausscheidung und egestion (z. B. 14, 15) oder indirekt durch Veränderung der Pflanzengesellschaft Zusammensetzung (z. B. 9 ) auf Ökosystem Nährstoffkreislauf. Solche Quantifizierung kann helfen, zeigen die Mechanismen, durch die Tiere zu kontrollieren Dynamik von Ökosystemen als Teil einer konzertierten Anstrengung zur Verbesserung und Überarbeitung des aktuellen Arbeitsverzeichnisses Paradigma der biotischen Kontrolle über das Funktionieren von Ökosystemen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagens oder Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Cavity Ring Down Spektroskop </td><td> Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA </td><td> Model # G1101-i </td><td></td></tr><tr><td> CO2 Respirometer </td><td> Qubit-Systeme, Kingston, ON, Canada </td><td> Model # S151 </td><td></td></tr><tr><td> 13C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 372382 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrophotometer </td><td> Thermo, San Jose CA, USA </td><td> Modell: Delta V Plus Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie Spektralphotometer </td><td></td></tr></tbody></table>

linking predation risk, herbivore physiological stress and microbial decomposition of plant litter

Die Quantität und Qualität von Detritus in den Boden bestimmt die Geschwindigkeit der Zersetzung durch mikrobielle Gemeinschaften sowie recycle von Stickstoff (N) und Kohlenstoff (C)-Sequestrierung 1,2. Streu umfasst die Mehrheit der Detritus 3, und so wird davon ausgegangen, dass die Zersetzung nur marginal von Biomasse Eingänge von Tieren wie Pflanzen-und Fleischfresser 4,5 beeinflusst. Jedoch kann Fleischfresser mikrobielle Zersetzung Pflanzenstreu über eine Kette von Wechselwirkungen in dem Prädationsrisiko verändert die Physiologie ihres herbivore Beute, die wiederum ändert Bodenmikroorganismen Funktionieren wenn die herbivore Karkassen 6 zerlegt beeinflussen. Eine physiologische Stressantwort von Pflanzenfressern auf die Gefahr der Plünderung können die C: N elementare Zusammensetzung von herbivore Biomasse 7,8,9, weil Stress aus Prädationsrisiko erhöht herbivore basalen Energiebedarf dass Nährstoff-Systeme mit begrenzten Kräften herbivores, um ihren Verbrauch von N-reichen Ressourcen zu verlagern, um Wachstum und Reproduktion C-reichen Kohlenhydrat Ressourcen unterstützen zu unterstützen erhöhten Stoffwechsel 6. Pflanzenfresser haben eine begrenzte Fähigkeit, überschüssige Nährstoffe zu speichern, so betonte Pflanzenfresser scheiden N als sie erhöhen Kohlenhydrat-C-Verbrauch 7. Letztlich Beute gestresst durch Prädation Risiko erhöhen ihren Körper C: N-Verhältnis 7,10, so dass sie schlechtere Qualität Ressourcen für die mikrobiellen Pool wahrscheinlich aufgrund der geringeren Verfügbarkeit von labile N für mikrobielle Enzymproduktion 6. So hat Zersetzung von Tierkörpern von gestressten Pflanzenfresser eine stimulierende Wirkung auf das Funktionieren des mikrobiellen Gemeinschaften, die spätere Fähigkeit verringert sich der Mikroben Pflanzenstreu 6,10,11 zersetzen. Wir präsentieren Ihnen die Methodik zur Verknüpfung zwischen Prädationsrisiko und Streuzersetzung durch Bodenmikroben bewerten. Wir beschreiben, wie: Erbrechen Stress Pflanzenfresser aus Prädationsrisiko; measicher, dass diese Stress-Reaktionen, und messen Sie die Auswirkungen auf die mikrobielle Zersetzung. Wir nutzen Erkenntnisse aus einem Modell Wieseoekosystem, das die Jagd Spinne predator (Pisuarina mira), eine dominante grasshopper Pflanzenfresser (Melanoplus femurrubrum) und eine Vielzahl von Gras und forb Pflanzen 9.

Ein Beispiel Grundstück von grasshopper Standard-Stoffwechsel im Stress und stressfrei sind in Abbildung 2 dargestellt. Aufgrund Körpermasse Unterschiede zwischen den einzelnen Heuschrecken, und die Tatsache, dass metabolische Rate mit einem Body Mass schwankt, sollten Grundstücke metabolische Rate in Bezug auf grasshopper Körpermasse zu präsentieren. Parallel Trends für die verschiedenen Behandlungen zeigen, dass metabolische Rate steigt als konstantes Vielfaches der Standard metabolische Rate (dh es gibt keine Körpermasse x Stoffwechselrate Interaktion) für alle gestressten Menschen. Grasshopper Körper C und N elementaren Inhalten in Gefahr und ohne Risiko sind in Tabelle 1 dargestellt. Es ist bemerkenswert, dass es eine sehr kleine (4%) Abweichung in Körper C: N-Verhältnis zwischen den Behandlungen. Dennoch können diese kleinen Unterschiede in große Unterschiede im Gras Streuzersetzung durch den mikrobiellen Pool (Abbildung 3) zu übersetzen. </p&gt; Hinzufügen Gras Wurf PVC Kragen zuvor mit gestressten oder Stress-free Heuschrecken geändert führt zu unterschiedlichen Graden der Streuzersetzung, wie in den Kurven beschreiben wider kumulieren CO 2-Freisetzung aus dem Boden durch mikrobielle Atmung (Abbildung 3). Experimente sollten überwacht kumulieren, bis Kurven beginnen zu sättigen werden. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Stress </td><td> Stress Free </td></tr><tr><td> Kohlenstoff (%) </td><td> 48,44 ± 0,32 </td><td> 44,73 ± 0,46 </td></tr><tr><td> Stickstoff (%) </td><td> 12,11 ± 0,08 </td><td> 11,62 ± 0,12 </td></tr><tr><td> Carbon: Nitrogen </td><td> 4,00 ± 0,03 </td><td> 3,85 ± 0,04 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Vergleich der chemischen Zusammensetzung der Heuschrecke herbivore Autocasses von Bedingungen, in denen sie konfrontiert Prädationsrisiko (Stress) und in dem Prädationsrisiko abwesend war (stressfrei). Die Werte sind Mittelwerte ± 1 Standardfehler. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Illustration der Ausgestaltung des Feldes Mesokosmen in dem Experiment und Gesamtschema des experimentellen Evaluierung des Risikos Wirkungen auf Streuzersetzung verwendet. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Ein Grundstück von herbivore Standard metabolische Rate in Bezug auf herbivore Körpermasse. Die Daten werden in zwei Klassen nach experimentellen Behandlung unterteilt: Heuschrecken aus Mesokosmen mit Prädatoren (Räuber), um Stress zu induzieren, und Mesokosmen, ohne Raubtiere (Kontrolle) und somit ohne Stress. Die Daten stammen aus D. Halwenaund ABl Schmitz 2010, unveröffentlicht. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig3.jpg" alt="Abbildung 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061fig3highres.jpg"/> Abbildung 3. Kurven beschreiben kumulativen CO 2-Freisetzung durch die mikrobielle Pool, während Zersetzung experimentellen Gras Wurf Eingänge in PVC Kragen. Dargestellten Werte sind Mittelwerte ± 1 Standardfehler. Die Grafik zeigt, dass Böden mit gestressten grasshopper Schlachtkörper (Raubtier) Ergebnis in 19% niedriger (ANOVA F 1,6 = 9,06, p &lt;0,05) Pflanzenstreu Abbauraten als Böden mit stressfrei grasshopper Karkassen (Kontrolle) grundiert. Grundiert Der Einschub zeigt die PVC Kragen Gerät im Feld. Abbildung aus Hawlena et al wiedergegeben. 6 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50061/50061fig3large.jpg" target="_blank">Cick Sie hier, um größere Zahl anzuzeigen</a> .

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Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Wir präsentieren Methoden zu bewerten, wie Prädationsrisiko können die chemische Qualität des herbivore Beute durch Induktion Veränderungen in der Ernährung zu Forderungen der erhöhten Beanspruchung gerecht zu verändern, und wie die Zersetzung von Tierkörpern aus dieser gestressten Pflanzenfresser verlangsamt nachfolgenden Pflanzenstreu Zersetzung durch Bodenmikroorganismen.

Linking Prädationsrisiko, Herbivore Physiologische Stress und mikrobielle Zersetzung des Pflanzenstreu

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

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Research

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Biology

12.9K Aufrufe.  Yale University. Wir präsentieren Methoden zu bewerten, wie Prädationsrisiko können die chemische Qualität des herbivore Beute durch Induktion Veränderungen in der Ernährung zu Forderungen der erhöhten Beanspruchung gerecht zu verändern, und wie die Zersetzung von Tierkörpern aus dieser gestressten Pflanzenfresser verlangsamt nachfolgenden Pflanzenstreu Zersetzung durch Bodenmikroorganismen.

Serie: Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Testen der physiologische Barrieren für die virale Transmission in Blattläuse mit Mikroinjektion

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Forschung

Biologie

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

Überwachung Pflanzenhormone bei Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Messe Profiling (OLIMP) der extrazellulären Polysacchariden

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Agar-Block Mikrokosmen für Controlled Pflanzengewebekultur Zersetzung durch aerobe Pilze

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2. These HIPVs are mainly regulated by the defensive plant hormone jasmonic acid (JA) and its volatile derivative methyl jasmonate (MeJA)3,4,5. Over the past 3 decades researchers have documented that HIPVs can repel or attract herbivores, attract the natural enemies of herbivores, and in some cases they can induce or prime plant defenses prior to herbivore attack. In a recent paper6, I reported that feeding by gypsy moth caterpillars, exogenous MeJA application, and mechanical damage induce the emissions of volatiles from blueberry plants, albeit differently. In addition, blueberry branches respond to HIPVs emitted from neighboring branches of the same plant by increasing the levels of JA and resistance to herbivores (i.e., direct plant defenses), and by priming volatile emissions (i.e., indirect plant defenses). Similar findings have been reported recently for sagebrush7, poplar8, and lima beans9..
Here, I describe a push-pull method for collecting blueberry volatiles induced by herbivore (gypsy moth) feeding, exogenous MeJA application, and mechanical damage. The volatile collection unit consists of a 4 L volatile collection chamber, a 2-piece guillotine, an air delivery system that purifies incoming air, and a vacuum system connected to a trap filled with Super-Q adsorbent to collect volatiles5,6,10. Volatiles collected in Super-Q traps are eluted with dichloromethane and then separated and quantified using Gas Chromatography (GC). This volatile collection method was used n my study6 to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants. These methods are described here. Briefly, undamaged blueberry branches are exposed to HIPVs from neighboring branches within the same plant. Using the same techniques described above, volatiles emitted from branches after exposure to HIPVs are collected and analyzed.

A push-pull method for collecting plant volatiles is described. The method allows for a comparison of volatiles induced by herbivore feeding, exogenous methyl jasmonate, and mechanical damage. This technique is also used to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants.

Herbivore-induzierte Blueberry Volatile und Intra-Anlage Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

Physiologische Aufnahmen und RNA-Sequenzierung der gustatorischen Anhangsgebilde der Gelbfieber-Moskito-<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls requires cellular reprogramming and changes in the metabolism of the infected plant. This is necessary to establish a pathogen-oriented physiological sink toward which the host nutrients are redirected. For a complete understanding of this particular plant-pathogen interaction and the mechanisms by which host growth and development are subverted and repatterned, it is essential to track and observe the internal changes accompanying gall formation with cellular resolution. Methods combining fluorescent stains and fluorescent proteins are often employed to study anatomical and physiological responses in plants. Unfortunately, the large size of galls and their low transparency act as major hurdles in performing whole-mount observations under the microscope. Moreover, low transparency limits the employment of fluorescence microscopy to study clubroot disease progression and gall formation. This article presents an optimized method for fixing and clearing galls to facilitate epifluorescence and confocal microscopy for inspecting P. brassicae-infected galls. A tissue-clearing protocol for rapid optical clearing was used followed by vibratome sectioning to detect anatomical changes and localize gene expression with promoter fusions and reporter lines tagged with fluorescent proteins. This method will prove useful for studying cellular and physiological responses in other pathogen-triggered structures in plants, such as nematode-induced syncytia and root knots, as well as leaf galls and deformations caused by insects.

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

The present protocol describes an optimized method for the histological observation of galls induced by Plasmodiophora brassicae. Vibratome sections of hypocotyls are cleared before fluorescence imaging to study the involvement of transcription factors and phytohormones during disease progression. This protocol overcomes resin embedding limitations, enabling in planta visualization of fluorescent proteins.

Kombination von Clearing- und Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von Veränderungen der Genexpression und physiologischen Reaktionen auf Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls ...

Scalable, Flexible, and Cost-Effective Seedling Grafting

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage seedlings of the small model plant, Arabidopsis thaliana, is technically challenging and time consuming due to the size and fragility of its seedlings. A growing collection of published methods describe this technique with varying success rates, difficulty, and associated costs. This paper describes a simple procedure to make an in-house reusable grafting device using silicone elastomer mix, and how to use this device for seedling grafting. At the time of this publication, each reusable grafting device costs only $0.47 in consumable materials to produce. Using this method, beginners can have their first successfully grafted seedlings in less than 3 weeks from start to finish. This highly accessible procedure will allow plant molecular genetics labs to establish seedling grafting as a normal part of their experimental process. Due to the full control users have in the creation and design of these grafting devices, this technique could be easily adjusted for use in larger plants, such as tomato or tobacco, if desired.

This protocol describes a robust seedling grafting method that requires no prior experience or training and can be executed at a very low cost using materials easily accessible in most molecular biology labs.

Skalierbare, flexible und kostengünstige Keimlingsveredelung

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage ...