Es gibt viele Protokolle zur Isolierung einzelner Myofiber von den Skelettmuskeln erwachsener Mäuse. Unser Protokoll ist für sehr junge Mäuse und für kleine Mäuse mit einem sehr zerbrechlichen Myofiber konzipiert. Dieses standardisierte Verfahren kann zur Untersuchung von myofiberunterstützten Muskelstammzellen während der postnatalen Entwicklung oder in Mausmodellen von Krankheiten, die Myofiber besonders anfällig für mechanische Belastungen machen, eingesetzt werden.
Das Verfahren wird von Gloria Pegoli, einer Doktorandin, und Federica Lucini, einer Postdoktorandin, beide aus einem Labor, demonstriert. Für Muskelzerlegung und Ernte, verwenden Sie einen Stift, um eine Hintergliedvon von einer eingeschläferten, sehr jungen oder sehr kleinen Maus auf ein Trennbrett zu fixieren, und verwenden Sie scharfe Pinzette, um die untere Sehne der tibialis vordere bis knöchelhohe Zusthöhe zu heben. Schneiden Sie die Sehne und verwenden Sie eine feine Schere, um den ganzen Weg um den Muskel bis zur Sehne auf der Ebene der Patella zu schneiden.
Legen Sie den Muskel in ein Rohr der Verdauungslösung und heben Sie die untere Sehne des Extensor digitorum longus, ziehen sanft nach oben auf der Sehne, um den Extensor digitorum longus von anderen Muskeln zu trennen. Schneiden und ernten Sie den Muskel. Drehen Sie das Bein, um die Rückenmuskulatur zu sehen und die Achillessehne zu heben.
Ein Gastrocnemius-Muskel trennt sich automatisch von den anderen Muskeln. Schneiden Sie die obere Sehne an der Rückseite der Patella und legen Sie den Muskel in die Verdauungslösung. Heben Sie die äußere Sehne des Beins und rollen Sie die Pinzette unter der Sehne, um die Sehne sanft vom Muskel zu trennen.
Dann schneiden, um den Muskel zu ernten und sammeln Die gleichen Muskeln aus dem anderen Bein in der gleichen Weise. Wenn alle Muskeln gesammelt sind, legen Sie das Sammelrohr für 45 bis 50 Minuten in ein 37 Grad Celsius Wasserbad und invertiert das Rohr 10 Mal alle 10 Minuten kräftig. Wenn sich die Muskeln zu lockern beginnen und die Myofiber sichtbar werden, schütteln Sie die Proben ein letztes Mal, bevor Sie die Verdauungssuspension vorsichtig in eine vorgewärmte oder serumbeschichtete 100-Millimeter-Petrischale mit 10 Milliliter Waschlösung übertragen.
Um einzelne Myofiber zu isolieren, legen Sie die Schale unter ein Sezieren mikroskop und verwenden Sie ein Pferdeserum beschichtet 200-Mikroliter Pipettenspitze, um die einzelnen Muskelfasern auseinander zu nehmen. Übertragen Sie die lebensfähigen Myofiber in eine pferdeserumbeschichtete 35-Millimeter-Petrischale mit fünf Millilitern vorgewärmter Waschlösung. Wenn alle lebensfähigen Myofiber gesammelt wurden, gleichnken Sie die Myofiberproben im Zellkultur-Inkubator für fünf Minuten aus.
Wenn mehr Myofiber benötigt werden, verwenden Sie eine Großbohrglaspipette, um die verbleibende Muskelgewebeprobe zu trituieren, bis zusätzliche Fasern mechanisch freigesetzt werden. Wenn genügend Myofiber gesammelt wurden, legen Sie das Gericht für eine Stunde für eine zusätzliche Gleichgewichtszeit in den Zellkultur-Inkubator. Am Ende der Inkubation einzelne Myofiber auf eine neue, vorgewärmte Pferdeserumschale mit dem entsprechenden Kulturmedium übertragen und den Teller an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben.
Für eine immunfluoreszierende Analyse der Myofiber, nach Kreuzverknüpfung, entfernen Sie alle, aber genug Überstand, nicht um irgendwelche Fasern zu entfernen und fügen Sie der gleichen Tube einen Milliliter 0,5%Triton X-100 in PBS für eine fünfminütige Inkubation mit sanfter Rührung hinzu. Lassen Sie die Fasern am Ende der Inkubation fünf Minuten lang begleichen, bevor Sie den Überstand durch 1,5 Milliliter PBS ersetzen. Nach fünf Minuten sanfter Rührung, lassen Sie die Fasern für weitere fünf Minuten zu begleichen, bevor Sie den Überstand durch einen Milliliter Blockierlösung ersetzen.
Ersetzen Sie nach einer Stunde sanfter Rührung die Blockierlösung durch eine frische Blockierlösung, die primäre Antikörper von Interesse für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius mit sanfter Rührung enthält. Am nächsten Morgen die Fasern mit drei fünfminütigen Wäschen in einem Milliliter frisch0,25%Tween 20 in PBS mit sanfter Rührung und fünf Minuten Sedimentation bei Raumtemperatur zum Waschen waschen. Nach der letzten Wäsche die Fasern mit den entsprechenden fluorchromen konjugierten Sekundärantikörpern, die in Blockierlösung eine Stunde lang bei Raumtemperatur verdünnt werden, mit sanfter, lichtgeschützter, gefolgt von drei Lasern in PBS plus 0,1%Tween, die vor Licht geschützt sind, wie gezeigt, beschriften.
Nach der letzten Wäsche den Überstand durch einen Milliliter DAPI-Lösung für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur mit sanfter, lichtgeschützter Rührung ersetzen. Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Fasern und verwenden Sie eine blockierende Lösung beschichtete Pipette mit einer geschnittenen Spitze, um die Fasern zu sammeln und sorgfältig die Fasern auf einem Glasschlitten zu verteilen. Platzieren Sie den Schlitten unter einem Sezierendes Mikroskop, und verwenden Sie nur das natürliche Licht, das vom Spiegel reflektiert wird, verwenden Sie eine neue 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um die Fasern sanft zu verteilen und die überschüssige Lösung zu entfernen.
Nach dem Entfernen der überschüssigen Lösung, lassen Sie den Schlitten im Dunkeln für 10 bis 15 Minuten trocknen, bis nur ein sehr kleines Volumen der Lösung übrig bleibt. Fügen Sie dann ein entsprechendes Volumen des Montagemediums auf die Fasern, bevor Sie vorsichtig einen Deckelschlupf über das Gewebe legen. Um eine ausreichende Anzahl von langen, lebensfähigen Fasern, die 96 Stunden im Wachstumsfaktor reichen Medium überleben können, vier verschiedene Muskeln werden in der Regel geerntet und verdaut.
Nur die intaktesten Fasern sollten auf das Kulturmedium übertragen werden. Zerbrochene Fasern und andere Trümmer sollten entsorgt werden. Nach 72 Stunden Kultur erzeugen aktivierte Satellitenzellen Zellaggregate, die an den Myofiber gebunden sind.
Wir beobachten, dass die Zellkultur aus LaminDelta acht 11 doppelt negative Mäuse durch eine kleinere Anzahl von Zellen gebildet werden. Nach 96 Stunden exezieren Satellitenzellen MyoG, werden innerhalb des Zellclusters sichtbar und beginnen die Differenzierung zu neuen Myofibiden. Bemerkenswert ist, dass bei homozygoten mutierten Lamin-Knockout-Mäusen im Vergleich zu ihren wilden Typ-Pendants eine verzögerte Dynamik der Satellitenzelldifferenzierung beobachtet wird.
Achten Sie darauf, die Muskelsektion Sesektion Schritte zu üben, wie eine schnelle und präzise Muskelernte ist entscheidend für den Erfolg des Experiments. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung einzelner Satellitenzellen während der Aktivierung und Differenzierung und erleichtert die Untersuchung wichtiger Prozesse, die dem Muskelwachstum und der Regeneration unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen zugrunde liegen.
