Dieses Projekt wurde durch die NIH (R21EB013717) und IUPUI OVCR (RSFG) finanziert. Der Autor dankt Frau Han Shih für ihre technische Unterstützung.

A. Makromer und Peptidsynthese <ol><li> Synthetisieren 4-Arm PEG-Norbornen (PEG4NB) und Photoinitiator Lithium arylphosphanate (LAP) mit etablierten Protokollen. 18,19 </li><li> Synthetisieren Bis-cysteinhaltigen Chymotrypsin-sensitive Peptid CGGY ↓ C (Pfeil zeigt Chymotrypsin-Spaltstelle) unter Verwendung von Standard Festphasenpeptidsynthese in einer Mikrowelle Peptidsynthesizer (CEM Discover SPS). <ol class="lalpha"><li> Den Gehalt an Harz (Rink-Amid-MBHA-Harz) notwendig nach Substitutionsmuster Verhältnis des Harzes und der Synthese-Skala. Aufquellen des Harzes in Dimethylformamid (DMF) in einem Reaktionsgefäß (RV) für 15 min. </li><li> Entfernen Fmoc-Schutzgruppe von dem Harz unter Verwendung einer Entschützung Lösung mit 20% Piperidin und 0,1 M HOBt in DMF. Verwenden Sie die Parameter in der nachstehenden Tabelle für die Mikrowellen-unterstützte Fmoc-Entschützung (für alle Fmoc-Aminosäuren) aufgeführt: <table border="1"><tbody><tr><td> Synthesemaßstab </strong&gt; </td><td> 0,1 mmol </td><td> 0,2 mmol </td></tr><tr><td> Power </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> Temperatur </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Zeit </td><td> 3 min </td><td> 3 min </td></tr></tbody></table></li><li> Nach Entschützung, spült das Harz mit DMF und führen Ninhydrin-Test, um das Entfernen von Fmoc (Belichtung von N-terminalen Amin) bestätigen. Resin sollte sich nach 2 min blau bei 95 ° C. </li><li> Nach erfolgreicher Entschützung, Koppeln des ersten Fmoc-Aminosäure an den C-Terminus (Synthese läuft vom C-zum N-Terminus) in einem Aktivator Basenlösung (0,28 M Diisopropylethylamin (DIEA) in DMF) mit den Parametern in der nachfolgenden Tabelle aufgelistet . <table border="1"><tbody><tr><td> Synthesemaßstab </td><td> 0,1 mmol </td><td> 0,2 mmol </td&gt; </tr><tr><td> Power </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> Temperatur * </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Time * </td><td> 5 min </td><td> 5 min </td></tr></tbody></table> * Für Zyste und Sein, verwenden 50 ° C und 10 min zur Racemisierung zu reduzieren. </li><li> Anschließend wird das Harz und führen Ninhydrin zum qualitativen Bestätigung der Vollendung der Kupplung (Verschwinden der N-terminalen Amin). Resin sollte nach 5 min klar bei 95 ° C. Wiederholen Kupplungsschritt (A.2.d), wenn Ninhydrin-Test liefert positives Ergebnis (Farbe blau). </li><li> Wiederholen Schutzgruppenabspaltung (Schritt A.2.b) und Kupplung (Schritt A.2.d) für zusätzliche Aminosäuren in der Sequenz endet mit einem letzten Entschützungsschritt. </li><li> Lassen Sie das RV gründlich Harz mit 25 ml Dichlormethan (DCM). Dieser Schritt ist abzuspülen DMF, der eine Basis ist und Peptidspaltung behindern. </li><li> Bereiten Spaltungscocktail durch Mischen 250 mg Phenol in 4,75 ml Trifluoressigsäure (TFA), 0,125 ml Triisopropylsilan (TIS) und 0,125 ml ddH 2 O. </li><li> Hinzufügen Spaltlösung in die RV und spalten für 30 min in der Mikrowelle Peptidsynthesizer (Leistung = 20 W, Temperatur = 38 ° C). </li><li> Sammeln die Peptidlösung in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen unter Verwendung Vakuumkammer. </li><li> Niederschlag gespaltene Peptid in 40 ml Ether, das Röhrchen vortexen und zentrifugieren bei 3.000 rpm für 5 min zu sammeln, die das Peptid. </li><li> Lassen Sie den Überstand und wiederholen Sie Schritt A.2.k zweimal. </li><li> Sammeln und trocknen Peptid im Vakuum. </li><li> Reinige das Peptid mittels HPLC und Charakterisierung mit Massenspektrometrie. </li></ol></li></ol> B. Material Vorbereitung und Sterilisation <ol><li> Bereiten 20 Gew.% PEG4NB Lösung in PBS, Wirbel die Mischung, bis das Makromer vollständig auflöst und sterilisieren das Makromer-Lösung mit einer Spritze Filter. Bewahren Sie den sterilisierten Lösung bei -20 ° C (Aliquotsfür Langzeitlagerung). </li><li> Vorzubereiten und zu sterilisieren 2 Gew.% Photoinitiator (LAP)-Lösung in PBS. Bewahren Sie den sterilisierten Lösung bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. </li><li> Man löst das Peptid (CGGYC) in PBS, das Gemisch Wirbel und Spritze filtrieren zur Sterilisation. Aliquot der Peptid-Lösung und bei -20 ° C bis zur Verwendung (zu verhindern Frost-Tau-Zyklen). </li><li> Bestimmen Thiol (-SH)-Konzentration in der vorbereiteten Peptid-Lösung mit Ellman-Reagenz (folgen Sie dem Protokoll des Herstellers). Dieser Schritt gibt genaue Peptidkonzentration (dh [SH] / 2), die zum Berechnen der Menge an Peptid Thiol-En-Foto-Klick Reaktionen verwendet werden benötigt. </li><li> Bereiten Gelierformen, indem Sie den oberen Teil weg von sterilen 1 ml Einwegspritzen mit einer Rasierklinge (offene Spitze für Gel-Entfernung). Sterilisieren Sie die Spritze Formen durch Autoklaven. </li><li> Basierend auf der gewünschten Gel-Formulierung (Thiol En-Verhältnis = 1) und die Konzentrationen der Lager MateMaterialien, berechnen die erforderliche Menge Polymer, Peptid Vernetzer, Photoinitiator und Pufferlösungen erforderlich. </li></ol> C. Cell Preparation <ol><li> Äquilibrieren Zellkulturmedium (high Glucose DMEM, das 10% fötales Rinderserum; Antibiotika-Antimykotisches mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 250 ng / ml Fungizon und 50 pM β-Mercaptoethanol), ausgeglichene Hank-Salzlösung ( HBSS, Ca 2 +, Mg 2 + frei) und Trypsin-EDTA auf 37 ° C. </li><li> Entfernen Kolben mit MIN6 β-Zellen aus CO 2-Inkubator und die Kolben in der Laminarströmungshaube. </li><li> Absaugen Zellkulturmedien aus den Flaschen und spülen Sie die Zelle mit HBSS. </li><li> Trypsinieren die Zellen mit 3 ml von 2X (0,1%) Trypsin-EDTA und Inkubation der Flaschen für 4 min bei 37 ° C und 5% CO 2. <ul><li> Hinweis: Verwenden Sie 2X Trypsin-Lösung ermöglicht vollständige Dissoziation MIN6 β-Zellen in einzelne Zellen in Suspension. </li></ul> &lt;/ Li&gt; <li> Nach der Inkubation, tippen Sie die Flaschen auf der Oberfläche der Haube vorsichtig vollständig lösen die Zellen. Bestätigen Sie die Ablösung und Dissoziation der Zellen unter dem Mikroskop. </li><li> Hinzufügen gleichen Volumen Zellkulturmedium, um das Trypsin zu neutralisieren. Mischen Sie die Lösung auch durch vorsichtiges Pipettieren, dann die Masse in eine kanonische Rohr und Zentrifuge für 5 min bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Überstand und sanft wieder die Zellen in 4 - 5 ml von Kulturmedien. </li><li> Bestimmen Zelldichte mit 50% Trypanblau Puffer in einer Zählkammer. </li></ol> D. Hydrogel Fabrication and Cell Encapsulation <ol><li> Sobald die Zellen bereit, Mischung (bezogen auf 1:1-ene Thiol-Verhältnis) die erforderlichen Volumina der PEG4NB, CGGYC, LAP, Zelllösung, und HBSS in ein Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Mische die Lösung vorsichtig mit einer Pipette, um eine homogene Mischung zu erhalten und werden 25 ul der resultierenden Lösung mit einer Spritze Form. Setzen der Spritze mit UV-Licht (365nm, 5 mW / cm 2) während 2 min. </li><li> Nach Photopolymerisation, Tauchbecken Gele in einer sterilen 24-Well-Platte mit Zellkulturmedium und bebrüten die Hydrogele in 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Waschen Sie die Zellen beladenen Hydrogele in Zellkulturmedium für 30 min zu spülen locker anhaftenden Zellen und unvernetzten Makromere. Übertragen Sie die Gele in frisches Medium. </li><li> Aktualisieren Zellkulturmedien alle 2 bis 3 Tage. </li></ol> E. Zelllebensfähigkeit Assay Encapsulated Zellmorphologie beobachtet mit Lichtmikroskop (da die synthetisierten Hydrogele transparent sind). Die Lebensfähigkeit der Zellen können visualisiert werden und qualitativ mit Live / Dead-Färbung und quantitativ mit AlamarBlue Reagenz gemessen. E.1. Live / Dead-Färbung <ol><li> Auftauen Live / Dead Färbereagenzien bei Raumtemperatur. </li><li> In kanonischer Rohrs hinzuzufügen PBS gemäß der Anzahl von Abtastungen (n) zu färbenden: <strong&gt; Gesamtvolumen der PBS = n × 500 ul </li><li> Pipette 0,25 ul Calcein AM und 2 ul EthD-1 pro 1 ml PBS auf die kanonische Röhrchen mit PBS. Vortex die Lösung, um die Komponenten zu mischen. </li><li> Inkubieren Zell-beladenen Hydrogele in Live / Dead Färbelösung (0,5 ml / Probe) für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. </li><li> Mit einer Pasteurpipette, entfernen Sie die Farbstofflösung und spülen die Probe zweimal mit PBS. </li><li> Zeigen Probe auf einem Deckglas oder Objektträger aus Glas. Beobachten und Bildzellen mit einem konfokalen Mikroskop. </li></ol> E.2. AlamarBlue Assay <ol><li> Planen 10 v / v% AlamarBlue Lösung in Zellkulturmedium. </li><li> Entfernen Hydrogele aus Inkubator und saugen die Medien aus jeder Vertiefung, ohne jeden Kontakt mit dem Hydrogel. </li><li> Inkubieren Zell-beladenen Hydrogele und einen leeren Brunnen (negative Kontrolle) in 500 ul 10% AlamarBlue Lösung für 16 Stunden. </li><li> Nach der Inkubation, Pipette 200 ulder AlamarBlue Lösung in einer 96-Well-Platte und messen Fluoreszenz unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader (Anregung: 560 nm, Emission: 590 nm). <ul><li> Höhere zelluläre Stoffwechselaktivität reduziert den Farbstoff höhere Fluoreszenz-Anzeige zu erhalten. </li><li> Achten Sie darauf, mindestens zwei Vertiefungen von 10% AlamarBlue Lösung als Rohlinge enthalten. Bei der Analyse der Daten, subtrahieren Sie den gemittelten leere Fluoreszenz-Wert aus dem Fluoreszenz-Lesung der Proben. </li></ul></li></ol> F. Chymotrypsin vermittelten Gel Erosion und Spheroid Wiederherstellung <ol><li> Bereiten Sie 1 mg / ml Trypsin-freien α-Chymotrypsin-Lösung in HBBS und Sterilfilter der Lösung. </li><li> Inkubieren Hydrogele in Chymotrypsin-Lösung (500 ul für jedes Gel) bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln bis zur vollständigen Erosion Gel erreicht wird. <ul><li> Für einen 25 ul Gel, ist die Zeit bis zur vollständigen Erosion etwa 5 min. </li></ul></li><li> Legen Sie die Platte auf Eis für ein paar Minuten, um die Aktivität zu reduzierenChymotrypsin. </li><li> Übertragen der Zelle Lösung in 1 ml-Tube und Zentrifuge bei 300 rpm, 4 ° C für 2 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette Weide und sanft resuspendieren Sphäroide in HBSS. </li><li> Übertragen der wiederhergestellten Sphäroid-Lösung zu einem 24-Well-Platte und legen Sie die Platte auf Eis, damit die Kügelchen zu beruhigen. </li><li> Für Partikelgrößenanalyse erwerben Phase kontrastreiche Bilder der abgesetzten Sphäroide mit einem Lichtmikroskop. Measure erholt Sphäroid Durchmessern Verwendung von Software wie Nikon Element Software oder ImageJ. </li></ol> G. Functional Test der Geheilte Spheroids G.1. Glucose stimulierte Insulinsekretion aus den gewonnenen Zellen Sphäroide <ol><li> In einer 24-Well-Platte, Inkubation der Gele in 500 ul 2 mM niedrige Glukose Kerbs-Ringer-Puffer (KRB) für 1 Stunde. </li><li> Erode das Gel und erholen Zelle Sphäroide mit Schritte F.1 bis F.6. </li><li> Überstand vorsichtig, ohne irgendwelcheKontakt mit der Zelle Sphäroiden und resuspendieren Sphäroide in 500 ul 2 mM niedrige Glukose KRB. </li><li> Übertragen Sie 100 ul der Zelle Sphäroide Lösung für ein 0,6-ml-Tube und legen Sie sie auf Eis für die intrazelluläre ATP Quantifizierung. </li><li> Teilen Sie die verbleibenden Zell-Sphäroid-Lösung in der Mitte (in zwei Mikrozentrifugenröhrchen) und zentrifugiert 2 min bei 300 rpm und 4 ° C. </li><li> Überstand entfernen (fast bis zum Boden) und resuspendieren in der ersten Hälfte der Zelle Sphäroide in 1 ml 25 mM hohe Glukose KRB und die zweite Hälfte in 1 ml 2 mM niedrige Glukose KRB. </li><li> Gently pipettieren und die Lösung enthält erholt Zelle Sphäroide zu einem 24-Well-Platte. Inkubieren der Platte für 1 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nach der Inkubation wird die Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 2 min bei 1000 rpm und 4 ° C. </li><li> Übertragen 500 ul des Überstandes aus dem zentrifugierten Röhrchen zu einem anderen Mikrozentrifugenröhrchen und bei 4 ° C für InsulinELISA. </li><li> Führen Insulin ELISA folgende Protokoll des Herstellers. </li></ol> G.2. CellTiter Glo Assay <ol><li> ATP-Standards: Bereiten Sie eine 10 uM ATP-Lösung und führen serielle Verdünnungen auf eine Reihe von 8 Standard-Lösungen zu erhalten. </li><li> Um einem weißen 96-Well-Platte, fügen Sie 50 ul Zell-Sphäroid-Lösung (aus Schritt G.1.6) und Standards. </li><li> In jede Vertiefung enthaltende Proben und Standards, fügen Sie 50 ul CellTiter Glo Reagenz und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Nach der Inkubation Maßnahme Lumineszenz Anzahl der Proben und Standards unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader und kalibrieren Probe ATP-Konzentrationen unter Verwendung einer linearen Regressionskurve durch die ATP-Standards erzeugt. </li><li> Bestimmen Sie den gesamten ATP-Konzentration in der Probe und vermehren sich durch die Probe Verdünnungsfaktor, um die intrazelluläre ATP-Konzentration in einer Zelle beladenen Hydrogel erhalten. </li></ol> G.3. Bestimmen Insulinsekretion <ol><li> Berechnen Sie die amount von Insulin aus den wiedergewonnenen Sphäroide, indem das Verhältnis der Menge an Insulin in hoher Glucosemedium zur Menge an Insulin in niedrigen Glucose sezerniert sekretiert. </li><li> Normalisieren der quantifizierten Insulin-Gehalt der Zelle Sphäroide mit entsprechenden Menge an intrazellulärem ATP der gewonnenen Zellen Sphäroide. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das beschriebene Protokoll enthält Angaben auf einfache Verkapselung von Zellen in Thiol-En-Hydrogele durch Schritt-Wachstum Photopolymerisation gebildet. Während ein stöchiometrisches Verhältnis von 1:1 Norbornen zu Thiolfunktionen in diesem Protokoll verwendet wurde, kann das Verhältnis eingestellt in Abhängigkeit von den Experimenten werden. Neben einer korrekten Formulierung, ist es wichtig, um die Homogenität in der Prepolymerlösung aufrechtzuerhalten. Insbesondere verwenden vorsichtiges Pipettieren zu gew?...

Hydrogele sind hydrophile vernetzte Polymere mit außergewöhnlichem Potenzial als Gerüstmaterial für die Reparatur und Regeneration von Geweben. 1-3 Der hohe Wassergehalt der Hydrogele ermöglicht eine einfache Diffusion von Sauerstoff und Austausch von Nährstoffen und zellulären Stoffwechsel-Produkte, die alle entscheidend für die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen sind. Zusätzlich Hydrogele ausgezeichnete Träger für die kontrollierte Freisetzung und Zellabgabesystem aufgrund ihrer hohen Abstimmbarkeit sind. 2 Synthetisches Hydrogele, wie sie aus Poly (Ethylenglykol) (PEG) hergestellt werden zunehmend in Tissue Engineering-Anwendungen verwendet, hauptsächlich wegen ihrer cytocompatibility, gewebespezifische Elastizität und hohe Abstimmbarkeit Material-physikalischen und mechanischen Eigenschaften. 4-6 Obwohl eine häufig verwendete Hydrogel Plattform haben Studien gezeigt, dass PEG-diacrylat (PEGDA) Hydrogele durch Ketten-Wachstum gebildet Photopolymerisationen eine Tendenz zu beschädigen eingekapselt Zellen haben During Netzwerk Vernetzung und in situ Zelleinkapselungsvorrichtung. 7 Die Zellschädigung wurde weitgehend Radikalspezies von den Photoinitiator-Moleküle, die durch die Vinylgruppen an PEGDA zu vernetzen Polymerketten in Hydrogele Propagation generiert wird. Leider sind diese Radikalspezies auch verursachen Spannungen und Zellschäden während Zelleinkapselungsvorrichtung, insbesondere für Rest-empfindlichen Zellen wie Pankreas-β-Zellen. 8-10 Um eine höhere Maschengröße für eine bessere Diffusion und Zellüberleben höheren Molekulargewichten erhalten PEGDA werden häufig für Zellverkapselung verwendet. Dies ist jedoch beeinträchtigt Polymerisationskinetik und bewirkt suboptimalen Gel biophysikalischen Eigenschaften. 7,11,12 Zusätzlich zu den oben genannten Nachteilen, ist es sehr schwierig ist, Zellstrukturen von PEGDA Hydrogele erholen aufgrund der Heterogenität und nicht abbaubaren Natur die vernetzten Netzwerken. Während Protease-sensitiven Peptide eingebaut werden könnenin PEG Makromergerüst die ansonsten inert PEGDA Hydrogele empfindlich gegenüber enzymatischer Spaltung zu rendern, die Konjugation verwendet häufig teure Reagenzien und die erhaltenen Netze enthalten noch hohe Heterogenität aufgrund der Art von Kette-Wachstum Polymerisation. 13-15 Kürzlich wurden PEG-Peptid-Hydrogele über Schritt-Wachstum Thiol-En-Photopolymerisation gebildet wurde gezeigt, dass bevorzugte Eigenschaften für Zell-Kapselung über Hydrogele durch Ketten-Wachstum Photopolymerisation gebildet aufweisen. 7 Die Superior Gelierung Kinetik der Thiol-En-Hydrogele zur Klick zurückzuführen &quot;Natur der Reaktion zwischen Thiol-und En-Funktionalitäten. Im Vergleich zu Ketten-Wachstum Polymerisation von PEGDA ist Thiol-En-Reaktion weniger Sauerstoff inhibiert, was zu einer schnelleren Gelierung bewerten. 16,17 Thiol-En-Hydrogele haben auch höhere Polymerisation Effizienz und bessere Gel biophysikalischen Eigenschaften im Vergleich zu Ketten-Wachstum PEGDA Hydrogele, 7 , 18 &lt;/ Sup&gt; was ergibt begrenzten Zellschäden durch Radikale während der Photopolymerisation verursacht. Zuvor Thiol-En-Hydrogele durch 4-Arm-PEG-norbornen (PEG4NB) Makromer und Bis-Cystein enthaltende Peptid Vernetzern wie gebildeten Protease-sensitive Peptide wurden für Zelleinkapselungsvorrichtung verwendet worden. 7,18 Breitband Abstimmbarkeit PEG Hydrogel Netzwerke bietet eine flexible und steuerbare 3D-Mikroumgebung für die Untersuchung Zellüberleben und Aktivität, während die Verwendung von Protease-sensitive Peptidsequenz eine milde Weise zur Rückgewinnung des Zellkonstrukte natürlich innerhalb Hydrogele gebildet. In diesem Protokoll verwenden wir Stufenwachstum photopolymerisierten Thiol-En-Hydrogelen hergestellt unter Verwendung von 4-Arm-PEG-norbornen (PEG4NB) und eine Chymotrypsin-sensitive Peptid Vernetzer (CGGY ↓ C) für die Einkapselung von MIN6 β-Zellen. Dieses Protokoll systematisch erarbeitet Techniken zur Untersuchung das Überleben, die Proliferation und Sphäroidbildung der MIN6β-Zellen in Thiol-En-Hydrogele. Wir bieten weitere Methode zur β-Zell-Sphäroid Erholung und biologische Charakterisierung der gewonnenen Sphäroide.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 4-Arm PEG (20kDa) </td><td> Jenkem Technology USA </td><td> 4ARM 20K-PEG- </td><td></td></tr><tr><td> Fmoc-Aminosäuren </td><td> Anaspec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Live / Dead Zellviabilität Kit </td><td> Invitrogen </td><td> L3224 </td><td> Inklusive Calcein AM und Ethidium Homodimer-1 </td></tr><tr><td> AlamarBlue Reagenz </td><td> AbD Serotec </td><td> BUF012 </td><td></td></tr><tr><td> CellTiter Glo Reagenz </td><td> Promega </td><td> G7570 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td> Ohne Ca +2 und Mg +2 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Lonza </td><td> 10547F </td><td> OhneCa +2 und Mg +2 </td></tr><tr><td> Hohe Glucose DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000-044 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotikum-Antimykotikum </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7522-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15400-054 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-freien α-Chymotrypsin </td><td> Worthington Biochemical Corp </td><td> LS001432 </td><td></td></tr><tr><td> Maus Inusin ELISA Kit </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Einwegspritze </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation and recovery of &beta;-cell spheroids from step-growth peg-peptide hydrogels

Hydrogele sind hydrophile, vernetzte Polymere, die eine dreidimensionale Mikroumgebung mit Gewebe-ähnliche Elastizität und hohe Durchlässigkeit für Kultivieren therapeutisch relevante Zellen oder Gewebe bereitzustellen. Hydrogele aus Poly (Ethylenglykol) (PEG)-Derivate hergestellt werden zunehmend für eine Vielzahl von Gewebe-Engineering-Anwendungen verwendet, zum Teil aufgrund ihrer abstimmbaren und cytocompatible Eigenschaften. Bei diesem Protokoll, verwendeten wir Thiol-En-Schritt-Wachstum Photopolymerisationen bis PEG-Peptid Hydrogele zur Verkapselung pankreatischen MIN6 b-Zellen herzustellen. Die Gele wurden durch 4-Arm PEG-Norbornen (PEG4NB) Makromer und Chymotrypsin-sensitive Peptid Vernetzer (CGGYC) gebildet. Die hydrophilen und nicht-Fouling Art PEG bietet eine cytocompatible Mikroumgebung für das Überleben der Zelle und die Proliferation in 3D, während die Verwendung von Chymotrypsin-sensitive Peptidsequenz (C GGY ↓ C, gibt der Pfeil Enzymspaltstelle, während Endgerät ZysteEine Rückstände wurden Thiol-En-Vernetzung hinzugefügt) ermöglicht die schnelle Wiederherstellung von Zellkonstrukte bilden innerhalb des Hydrogels. Das folgende Protokoll ausarbeitet Techniken für: (1) Verkapselung von MIN6 β-Zellen in Thiol-En-Hydrogele, (2) Qualitative und quantitative Zelllebensfähigkeit Assays zum Zellüberleben und Proliferation zu bestimmen, (3) Wiedergewinnung von Zellen Sphäroide mit Chymotrypsin-vermittelte Gel Erosion; und (4) Strukturelle und funktionelle Analyse der gewonnenen Sphäroide.

<html> Die Abbildungen 1-4 zeigen repräsentative Ergebnisse für die Verkapselung, Überleben, Proliferation, Sphäroidbildung und Sphäroid Erholung in Thiol-En-Hydrogele. Abbildung 1 zeigt die Reaktion Schema (1) Schritt-Wachstum Thiol-En-Photopolymerisation mit PEG4NB und CGGYC, und ( 2) Chymotrypsin vermittelten Gel Erosion, die eine Oberflächenerosion Mechanismus folgt. Abbildungen 2 und 3 zeigen die Lebensfähigkeit erzielten Ergebnisse mit Live ...

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Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Das folgende Protokoll stellt Techniken zur Verkapselung Pankreas β-Zellen in Schritt-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele durch Thiol-En-Foto-Klick-Reaktionen gebildet. Dieses Material-Plattform bietet nicht nur eine cytocompatible Mikroumgebung für Zellverkapselung, sondern erlaubt auch benutzergesteuerten rasche Erholung von Zellstrukturen innerhalb der Hydrogele gebildet.

Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

generation-recovery-cell-spheroids-from-step-growth-peg-peptide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

14.1K Aufrufe.  Indiana University - Purdue University at Indianapolis. Das folgende Protokoll stellt Techniken zur Verkapselung Pankreas β-Zellen in Schritt-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele durch Thiol-En-Foto-Klick-Reaktionen gebildet. Dieses Material-Plattform bietet nicht nur eine cytocompatible Mikroumgebung für Zellverkapselung, sondern erlaubt auch benutzergesteuerten rasche Erholung von Zellstrukturen innerhalb der Hydrogele gebildet.

Serie: Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Forschung

Biotechnik

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Erschwingliche Sauerstoffmikroskopie-unterstützte Biofabrikation von mehrzelligen Sphäroiden

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have many advantageous properties, including injectability, microscale porosity, and tunability by mixing multiple microgel populations. Methods to fabricate microgels often rely on water-in-oil emulsions (e.g., microfluidics, batch emulsions, electrospraying) or photolithography, which may present high demands in terms of resources and costs, and may not be compatible with many hydrogels. This work details simple yet highly effective methods to fabricate microgels using extrusion fragmentation and to process them into granular hydrogels useful for biomedical applications (e.g., 3D printing inks). First, bulk hydrogels (using photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) as an example) are extruded through a series of needles with sequentially smaller diameters to form fragmented microgels. This microgel fabrication technique is rapid, low-cost, and highly scalable. Methods to jam microgels into granular hydrogels by centrifugation and vacuum-driven filtration are described, with optional post-crosslinking for hydrogel stabilization. Lastly, granular hydrogels fabricated from fragmented microgels are demonstrated as extrusion printing inks. While the examples described herein use photocrosslinkable HA for 3D printing, the methods are easily adaptable for a wide variety of hydrogel types and biomedical applications.

This work describes straightforward, adaptable, and low-cost methods to fabricate microgels with extrusion fragmentation, process the microgels into injectable granular hydrogels, and apply the granular hydrogels as extrusion printing inks for biomedical applications.

Fragmentierung von Bulk-Hydrogelen und Verarbeitung zu granularen Hydrogelen für biomedizinische Anwendungen

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

Generierung, Hochdurchsatz-Screening und Biobanking von human-induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Herzsphäroiden

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...