Die Autoren danken J. Priscu, A. Chiuchiolo und den McMurdo LTER Limnologie Team um Unterstützung bei der Sammlung und Aufbewahrung der Proben in der Antarktis. Wir danken Ratheon Polar Services und PHI-Hubschrauber für logistische Unterstützung. Licht Aufnahmen wurden in Miami Center for Advanced Microscopy Imaging Center und generiert. Diese Arbeit wurde vom Office of Polar NSF Grants Programme 0631659 und 1056396 unterstützt.

1. Probennahme <ol><li> Wählen Sie und bereiten die Probenahme vor Ort einen Tag vor der Abtastung der Wassersäule. Dadurch können die geschichteten Lagen der Wassersäule nach Störung durch Bohr-und Eis-Loch-Schmelzen zu reformieren. Identifizieren Lage der Bohrstelle durch GPS. </li><li> Um die Wassersäule gelangen, indem ein Loch gebohrt durch das Eis mit einem Jiffy Eisschnecke an einem 4-Zoll-Jiffy Flug Erweiterung und Schneiden Bit beginnen. Um ein Einfrieren des Bohrers in das Loch zu vermeiden, versuchen Sie, das Bohren in dem flüssiges Wasser zu vermeiden, durch Anhalten Bohrungen ca. 4-6 cm über der Oberseite der Wassersäule. </li><li> Das Bohrloch muss von einem Durchmesser von 15 bis 60 cm verbreitert vor der Probenahme werden. Dies wird durch Verwendung eines Lochs Schmelzvorrichtung (Hotsy Modell), die beheizte Polyethylenglykol zirkuliert durch ein Kupferrohr erreicht. Loch Schmelzen dauert in der Regel bis zu 18 Stunden. </li><li> Vor dem Abtasten der Wassersäule, sicherzustellen, dass alle erforderlichen Geräte und Probe StOrage Gefäße werden bei der Probenahme vor Ort montiert. Sampling Materialien umfassen: Niskin Flasche (5-10 L Fassungsvermögen), Winde mit Tiefe-Kabel kalibriert, Messenger, ausreichend Probenflaschen für jede Probenahme Tiefe und Kühlern für Probentransport. </li><li> Beginnen Probenahme früh am Tag (~ 05.00 Uhr), als Seewasser-Filterung am Tag der Probenahme abgeschlossen sein soll. Sammeln Wasserproben (1-5 L) von einem gewünschten Tiefe (für diese Studie: 6-m, 15-m und 18 m Probetiefe, von der piezometrischen Wasserstand im Eisloch gemessen) unter Verwendung eines Niskin Abtaster an einem kalibrierten Handwinde. Um Störungen der Wassersäule zu verhindern sammeln geringen Tiefen vor tiefer liegende zurück. </li><li> Shop See Proben in Kühlern und Transport aus der Probe vor Ort auf den Bereich Labor mit einem Schlitten befestigt, um ein ATV (All Terrain Vehicle). Die Proben sollten verarbeitet oder stabilisiert werden (zB: Blitzeis in flüssigem Stickstoff) auf dem Feld unmittelbar nach der Probenahme im Labor. </li></ol> 2. Entwicklunt von Anreicherungskulturen <ol><li> Zur Kultivierung von Anreicherungskulturen, Konzentrat 0,5 bis 1 l Wasser des Sees auf 47 mm 0,45 um Porengröße Polyethersulfon-Filter mit schonende Filtration (&lt;0,3 atm). Wenn die Vielfalt der natürlichen Gemeinschaft gewünscht wird, filtern eine zweite Probe auf 47 mm 0,45 um Porengröße Polyethersulfon-Filter und Protokolle folgen nach Bielewicz et al. 4 für Eukaryoten phylogenetische Diversität. </li><li> Übertragen Sie Filter, um 50 ml sterile Falcon-Röhrchen mit ~ 20 ml gefiltertes Seewasser aus der gleichen Tiefe wie der Sampling-Filter gesammelt. Vorsichtig waschen Zellen aus dem Filter mit einer sterilen Pipette. </li><li> Übertragen Zellsuspension auf eine 25 cm 2 sterile Zellkulturflasche. Fügen Sie gefilterte Wasser des Sees von jeder Probe Tiefe gesammelt, um die Kultur Volumen auf 45 ml zu erhöhen. Richten Sie mehrere Wiederholungen für jede Beprobungstiefe wenn Anreicherungen auf verschiedenen Kulturmedien erwünscht sind. </li><li> Zuschlag Kulturflaschen mit 50X sterile Lösungen für eine Endkonzentration von 1X der folgenden Kulturmedien: Fett der Basal Medium, BG11 und F / 2. Wenn Anbau von mixotrophen Organismen benötigt wird, Set-up zwei F/2-supplemented Schiffe und fügen 2-3 Körner von sterilen Reis zu einem der Kolben. </li><li> Inkubieren Kulturflaschen bei niedriger Temperatur (4 ° C) und geringer Einstrahlung (20 pmol Photonen m -2 s -1) in einer Temperatur-kontrolliertes Wachstum Inkubator für mindestens 4 Wochen in der Antarktis vor dem Versand an Ihre US-Labor. Wenn Isolate gewünscht werden, Platte 250 ul Anreicherungskultur auf Agarplatten mit geeigneten Nährmedien nach 2 Wochen Inkubationszeit. </li><li> Für den Versand in die USA, Transfer Anreicherungskulturen zu sterilen 50-ml Falcon-Gefäße. Anfrage Sendung Erfordernis der &quot;nicht einfrieren&quot; und &quot;Keep Cool&quot; auf Anfrage lieferbar. Während die Versand-Prozess aus der Antarktis ist relativ schnell (2 Wochen im gewerblichen Luftverkehr) und äußerst zuverlässige, gibt es die Möglichkeit des Verlustes von anspruchsvollen OrgelIsmen während des Transports Prozess. So können Ermittler wollen eine Teilprobe zu bewahren vor der Auslieferung, so dass der Verlust bestimmter Arten während des Versand-Prozess beurteilt werden kann. </li><li> Nach der Ankunft in den USA, gedeckelt Transfer 5 ml Bereicherung der Kultur in 45 ml geeigneten Nährmedien in einem 125-ml sterilen Erlenmeyerkolben mit einem sterilen Schwamm. Anreicherungskulturen sollte als stehende Kulturen in einem Temperatur-kontrollierten Umweltbedingungen Wachstumskammer (Diurnal Growth Chamber, VWR) bei 4 ° C/20 umol Photonen m -2 s -1 aufrechterhalten werden. Kulturen sollten an die frische Medien alle 30 Tage übertragen werden. </li></ol> 3. Zelllysat Extraktion aus Gefilterte Anreicherungen <ol><li> Filter 5 ml Anreicherungskultur auf eine 25 mm Whatman GF / F Filter mit leichtem Vakuum (&lt;10 psi). Der Filter kann für mehrere Wochen bei -80 ° C gelagert werden vor Testbeginn RubisCO Aktivität. </li><li> Schneiden Sie den Filter in 4-5 Abschnitte mit einer sterilen Schere und StahlÜbertragen der Stücke mit einer sterilen Zange in ein 2 ml Schraubverschluss gefüllte ein Fünftel der Weg voll mit 0,1 mm Durchmesser Zirkonia / Silicakügelchen. </li><li> Hinzufügen von 1,25 ml Filter Extraktionspuffer (50 mM Bicin, 10 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml BSA und 0,1% Triton X-100; mit frischem: 10 mM NaHCO3, 10 mM DTT, 3,3 mM Aminocapronsäure Säure, 0,7 mM Benzamidin, pH 7,8) 13 und stören Zellen unter Verwendung eines Minibead Schlagleisten dreimal für 30 Sekunden auf Geschwindigkeitseinstellung 48. Zur Erwärmung der Probe, alternative beadbeating mit 1 min Inkubation Eis zu verhindern. </li><li> Zentrifugen-Filtereinheiten Aufschlämmung für 2 min bei 3000 × g bei 4 ° C, um eine lose Pellet von GF / F Filter Fasern und Zellwandtrümmer bilden. </li><li> Entfernen Sie ein 200 ul Aliquot und tauchen ein in 800 ul eiskaltem 90% Aceton. Messen Sie extrahierbaren Chlorophyll (Chl) ein in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 664 nm Werte von 647 nm und 14. Übertragen Sie den Überstand in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren remaining Überstand bei 4 ° C für 2 min bei 15.000 × g und den Überstand (Vermeidung von unlöslichen Pellet Zellmembranen und den restlichen GF / F Filterfasern) in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Diese löslichen Zelllysat kann nun in der RUBISCO-Carboxylase-Aktivität des Tests verwendet werden. </li><li> Lysate können bei -80 ° C nach Zugabe von 12,5% Glycerin und Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Ein Verlust der Aktivität kann nach mehreren Gefrier / Tau-Zyklen abhängig von der Empfindlichkeit der Enzyme in dem Lysat auftreten. Daher sollten Aktivität von frischen gegenüber gefrorenen Lysat vor großem Maßstab Zelllysat Extraktionen getestet werden. </li></ol> 4. RubisCO Carboxylase-Aktivität Filter Assay <ol><li> Übertragen Sie 125 ul von löslichen Lysat in ein 15 ml Schraubdeckel Mikrozentrifugenröhrchen (Kappe nicht erforderlich), die auf Eis gekühlt wurde. Für negative Kontrollproben, fügen Sie 125 ul lösliche Lysat auf 15 mL Schraubdeckel Mikrozentrifugenröhrchen, aber nicht hinzufügen Substrat (in Schritt 4.7). Laufenduplizieren Reaktionen für alle Proben und negativen Kontrollen. </li><li> Bereiten Sie 10 ml Assay-Puffer frisch (50 mM Bicine-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO3, 25 mM MgCl 2) und Chill auf Eis. Aliquotieren genug von der Assay-Puffer für alle Proben und negativen Kontrollen (100 ul pro Probe / Kontrolle plus 100 ul extra) auf eine 5 ml Tube. Führen Sie alle weiteren Schritte unter einer Abzugshaube. </li><li> In 40 ul NaH 14 CO 3 (500 Ci / ml) pro ml Assay-Puffer auf die aliquotierten Puffer und halten Sie den Puffer auf Eis. </li><li> Entfernen Sie 10 ul der Assay-Puffer mit 14 C und verdünnen Sie es in 1 ml Assay-Puffer. Nach dem Umdrehen zu mischen, fügen Sie 100 uL des 1:100 verdünnten Mischung auf 3 ml Bio-Safe II Szintillationszählung Cocktail in einer Szintillationsfläschchen. Umkehren, um zu mischen. Scintillation zählt (Beckman LS6500) sollten mehr als 18.000 cpm, bevor Sie mit dem Test sein. </li><li> Wenn genügend NaH 14 CO 3 wurde der Assay-Puffer aufgenommen worden,bewegen die Reaktionsrohre zu einem trockenen Bad voreingestellt auf 25 ° C und Inkubation für 3-5 min. </li><li> Geben Sie 100 ul Assay-Puffer zu den Lysaten und Inkubation für 5 Minuten bei 25 ° C. </li><li> In 20 uL 15 mM Ribulosebisphosphat, um Proben und um die Reaktion für 5-10 Minuten bei 25 ° C. </li><li> Geben Sie 100 ul Propionsäure (100%) (Fisher), um die Reaktion zu stoppen. Säule für 1 Stunde bei 2.000 xg um die nicht inkorporierte 14 C. erschöpfen </li><li> Und das gesamte Volumen der Proben in Szintillationsgefäße mit 3 ml Bio-Safe II Szintillationszählung Cocktail. Bestimmen Sie cpm Säure stabile Endprodukte durch Szintillationszählung (B. Witte, R. Tabita persönliche Mitteilung). </li><li> Berechnen Sie RubisCO Erwerbsquoten auf einem Chl a Grundlage 14. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Wir verwendeten Bereicherung der Anzucht bis zur Kälte-und mixotrophen angepasst phototrophen Protisten mit Wohnsitz in der Antarktis L isolierenake Bonney. Um eine größere Vielfalt von Organismen zu erfassen, testeten wir drei Wachstum Medien-Typen: Kühnen Basal Medium (BBM) 15, F/2-Si Marine Medium 16, 17 und 18 BG11 Medium. Sichtprüfung der Anreicherungskulturen mittels Lichtmikroskopie ergab, dass die Kulturen von phototrophen Protisten (gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Chlorophyll Pigment in den meisten Zellen) wurden dominiert und beherbergt eine Vielzahl von Zellmorphologien abhängig von der Sampling-Tiefe, aus der das Inokulum wurde genommen und die Art der Medien in der Kultur verwendet werden (Abb. 1). Wir maßen Höchstsätze der Carboxylase-Aktivität durch das Enzym RubisCO als Proxy für Kohlenstoff-Fixierung Potenzial katalysiert. Chl a Häufigkeit wurde auch als eine Schätzung der phototrophen Protisten Biomasse (2) überwacht. Trotz Anbau aller Kulturen unter den gleichen Temperatur / Licht-Regime (zB 4 ° C/20 mol m -2 s -1), Kohlenstoff-Fixierung Potenzialund phototrophen Biomasse variiert dramatisch zwischen den Kulturen Bereicherung. Maximale RubisCO Aktivität wurde in Anreicherungskulturen wächst in beiden BBM (Anreicherungen 4 und 6) oder BG11 (Anreicherungen 13 und 14) Wachstum Medien beobachtet, während Kulturen auf F / 2 Wachstumsmedium (Anreicherungen 19, 21, 23) bereichert zeigte eine 4 - bis 34-fach geringere maximale Carboxylase-Aktivitäten. Diese Unterschiede waren nicht auf unteren Ebenen Biomasse in den F / 2 Kulturen, wie Carboxylase-Aktivität auf einem Chl Grundlage exprimiert wurde. Außerdem habe RubisCO Aktivität nicht mit einer Konzentration chl (. Abb. 2, Einschub r = -0,023, p&gt; 0,1) korrelieren. Die BBM Kulturen mit Seewasser von 6 m und 15 m (Anreicherungen 4 und 5) eingeimpft hatte den höchsten Ebenen Chl a, während alle anderen Kulturen ausgestellt relativ niedrigen Chl a, unabhängig davon, RubisCO Enzymaktivität (Abb. 2). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig1.jpg" /> Abbildung 1.Repräsentative mikrobiellen Eukaryoten Anreicherungskulturen die für das Wachstum von verschiedenen Organismen ausgewählt haben. Identität der Kultur wird in der unteren linken Seite der Platten gegeben. Alle Bilder zeigen lichtmikroskopische Aufnahmen erzeugt mittels Ölimmersion bei 1000-facher Vergrößerung. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig2.jpg" /> Abbildung 2. Potenzielle Kohlenstofffixierung Kapazität und extrahierbaren Chlorophyll A-Gehalt in Antarktis mikrobielle Eukaryoten Anreicherungskulturen von Lake Bonney isoliert und aufgewachsen auf verschiedenen Kulturmedien. Siehe Tabelle 1 für Kultur Details. Einschub: Pearson-Korrelation zwischen Chlorophyll und eine Fülle Kohlenstoff-Fixierung in den antarktischen Potenzial mikrobieller Eukaryoten Anreicherungskulturen.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Neuere molekularbiologische Untersuchungen haben eine hohe Vielfalt der einzelligen Eukaryoten in einer Vielzahl von Umgebungen, 3, 19, 20 berichtet, jedoch aufgrund des Fehlens von Isolaten im gesamten Spektrum von Lebensräumen Protisten die funktionelle Rolle dieser einzelnen Arten in Nahrungsnetze sind weitgehend unbekannt. In dieser Studie haben wir Methoden beschrieben, um für die mikrobielle Eukaryoten Arten ausstellenden metabolische Vielseitigkeit von einem relativ unterabgetasteten Umgebung, eine p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> BBM </td><td> Sigma </td><td> B5282 </td><td></td></tr><tr><td> BG11 </td><td> Sigma </td><td> C3061 </td><td></td></tr><tr><td> F / 2 </td><td> Sigma </td><td> G9903 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F Filter, 25 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-874-64 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F Filter, 47 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-874-71 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethersulfon-Filter, 0,45 um Porengröße, 47 mm </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 61854 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Zellkulturflasche, 25 cm 2 </td><td> Corning </td><td> 430639 </td><td></td></tr><tr><td> Diurnal Wachstumskammer </td><td> VWR </td><td> 35960-076 </td><td></td></tr><tr><td> Zirconia / Silica-Perlen, 0,1 mm diamter </td><td> BioSpec Produkte </td><td> 11079101z </td><td></td></tr><tr><td> Mini-Bead Beater </td><td> BioSpec Produkte </td><td> 3110BX </td><td></td></tr><tr><td> Schraubdeckelflasche Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ul) </td><td> USA Scientific </td><td> 1415-8700 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 14 CO 3 </td><td> ViTrax </td><td> VC 194 </td><td> Halten Sie in Aliquots von 400 ul bei -20 ° C </td></tr><tr><td> RuBP </td><td> Sigma </td><td> R0878-100mg </td><td> Man löst in 10 mM Tris-Propionsäure (pH 6,5) </td></tr></tbody></table>

establishment of microbial eukaryotic enrichment cultures from a chemically stratified antarctic lake and assessment of carbon fixation potential

Lake Bonney ist eine der zahlreichen permanent eisbedeckten Seen in den McMurdo Dry Valleys gelegen, Antarktis. Die mehrjährige Eisbedeckung unterhält eine chemisch geschichteten Wassersäule und im Gegensatz zu anderen Gewässern im Landesinneren, verhindert weitgehend externen Eingang von Kohlenstoff und Nährstoffen aus Bächen. Biota sind zahlreichen Belastungen der Umwelt, einschließlich der ganzjährig schweren Nährstoffmangel, niedrige Temperaturen, extreme Schatten, hypersalinity, und 24-Stunden Dunkelheit im Winter 1 ausgesetzt. Diese extremen Umgebungsbedingungen begrenzen die Biota in Lake Bonney fast ausschließlich an Mikroorganismen 2. Einzellige Eukaryoten mikrobielle (so genannte &quot;Protozoen&quot;) sind wichtige Akteure im globalen biogeochemischen Kreislauf 3 und spielen eine wichtige ökologische Rolle in der Kreisläufe von Kohlenstoff in den trockenen Tal Seen, belegen sowohl die primären und tertiären Rollen in der aquatischen Nahrungskette. In den trockenen Tal aquatischen Nahrungsnetz, Protisten, die ich dieses Problem behebennorganische Kohlenstoff (Autotrophie) sind die wichtigsten Produzenten von organischem Kohlenstoff für organotrophen Organismen 4, 2. Phagotrophic oder heterotropher Protisten in der Lage Einnahme von Bakterien und Protozoen kleiner wirken als den Top-Prädatoren im Nahrungsnetz 5. Zuletzt ist ein unbekannter Anteil der Bevölkerung in der Lage Protisten kombinierten mixotrophen Stoffwechsel 6, 7. Mixotrophie in Protisten beinhaltet die Fähigkeit, Photosynthese-Fähigkeit mit phagotrophic Einnahme von Mikroorganismen Beute zu kombinieren. Diese Form der Mixotrophie unterscheidet sich von mixotrophen Stoffwechsel in Bakterien-Spezies, die in der Regel beinhaltet die Aufnahme gelöster Kohlenstoff-Moleküle. Derzeit gibt es nur sehr wenige Isolate von Protisten permanent eisbedeckten polaren Seen, sowie Studien über Protisten Diversität und Ökologie in dieser extremen Umgebung waren begrenzt, 8, 4, 9, 10, 5. Ein besseres Verständnis der Protisten metabolischen Vielseitigkeit in der einfachen trockenen Tal See Nahrungsnetz wird an der Entwicklung von Modellen für die r helfenOle von Protisten im globalen Kohlenstoffkreislauf. Wir haben hierbei ein Anreicherungskultur Zugang zu potentiell phototrophen und mixotrophen Protisten aus Lake Bonney zu isolieren. Beprobungstiefen in der Wassersäule wurden basierend auf der Lage der Maxima und Primärproduktion Protisten phylogenetische Diversität 4, 11, sowie die Variabilität in den wichtigsten abiotischen Faktoren, die Protisten trophischen Modi gewählt: seichte Beprobungstiefen sind für die wichtigsten Nährstoffe begrenzt, während die tieferen Beprobungstiefen werden durch Licht Verfügbarkeit begrenzt ist. Darüber hinaus wurden Seewasser Proben mit mehreren Arten von Wachstumsmedium, um das Wachstum einer Vielzahl von Organismen fördern phototrophe ergänzt. RubisCO katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Calvin-Benson Bassham (CBB)-Zyklus, der wichtigste Weg, durch den autotrophen Organismen anorganischen Kohlenstoff zu fixieren und bieten organischem Kohlenstoff für höhere trophische Ebenen in aquatischen und terrestrischen Nahrungsnetze 12. In dieser Studie we aufgetragen ein Radioisotop-Assay für gefilterten Proben 13 modifiziert werden, um maximale Carboxylase-Aktivität als Proxy für Kohlenstoff-Fixierung Potenzial und metabolische Vielseitigkeit in den Lake Bonney Anreicherungskulturen überwachen.

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Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Mikrobielle Eukaryonten sind sowohl eine Quelle der photosynthetisch gewonnene Kohlenstoff und oben räuberische Arten in permanent eisbedeckten Antarktis Seen. Dieser Bericht beschreibt eine Bereicherung Kultur Ansatz zur metabolisch vielseitiges mikrobielle Eukaryoten aus der Antarktis See, Lake Bonney zu isolieren, und beurteilt anorganischen Kohlenstoff-Fixierung mit einem Radioisotopen-Potential Assay für Ribulose-1 ,5-Carboxylase-Oxygenase bisphophate (Rubisco) Aktivität.

Establishment of Microbial Eukaryotische Anreicherungskulturen aus einer chemisch geschichteten antarktischen See und Bewertung der Kohlenstoff-Fixierung Potential

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Aufrufe.  Miami University. Mikrobielle Eukaryonten sind sowohl eine Quelle der photosynthetisch gewonnene Kohlenstoff und oben räuberische Arten in permanent eisbedeckten Antarktis Seen. Dieser Bericht beschreibt eine Bereicherung Kultur Ansatz zur metabolisch vielseitiges mikrobielle Eukaryoten aus der Antarktis See, Lake Bonney zu isolieren, und beurteilt anorganischen Kohlenstoff-Fixierung mit einem Radioisotopen-Potential Assay für Ribulose-1 ,5-Carboxylase-Oxygenase bisphophate (Rubisco) Akt...

Serie: Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Anreicherung von NK-Zellen aus menschlichem Blut mit der RosetteSep Kit von StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Forschung

Biologie

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht von mikrobiellen Matten

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

Genomweite Reinigung von extrachromosomale zirkuläre DNA aus eukaryotischen Zellen

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Ein Protokoll für die Verwendung von Gen Set Anreicherung Analyse zur Ermittlung von geeigneten Tiermodell für die translationale Forschung

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Etablierung und Pflege von Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf can measure PSII absorption cross-section (&#963;PSII), maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), effective photochemical efficiency (Fq&#8242;/Fm&#8242;), and non-photochemical quenching (NPQNSV) for various eukaryotic algae and cyanobacteria, almost all FRRf studies to date have focused on phytoplankton. Here, the protocol describes how to measure PSII photophysiology of an epizoic alga Colacium sp.&#160;Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), in its attached stage (attached to zooplankton), using cuvette-type FRRf. First, we estimated the effects of substrate zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. M&#252;ller 1776, Cladocera, Daphniidae) on baseline fluorescence and &#963;PSII, Fv/Fm, Fq&#8242;/Fm&#8242;, and NPQNSV of planktonic Colacium sp. To validate this methodology, we recorded photophysiology measurements of attached Colacium sp. on S. mucronata and compared these results with its planktonic stage. Representative results showed how the protocol could determine the effects of calcium (Ca) and manganese (Mn) on Colacium sp. photophysiology and identify the various effects of Mn enrichment between attached and planktonic stages. Finally, we discuss the adaptability of this protocol to other periphytic algae.

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II photophysiology and primary productivity. Here we describe a protocol to measure PSII photophysiology of epizoic alga, Colacium sp. on substrate zooplankton using cuvette-type FRRf.

Messung der Photophysiologie des angeschlossenen Stadiums von Colacium sp. mit einem Küvetten-Fluorometer mit schneller Wiederholungsrate

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Collection, Fixation, and Mounting of Caudal Penduncle from Zebrafish after Cryoinjury

To begin, prepare two milliliters of 4%formalin or any other appropriate fixative. Also keep a petri dish, forceps, and surgical scissors ready before starting the procedure. Place the properly euthanized cryoinjured fish in a petri dish containing deionized water.Using scissors, perform a cut through the body, anterior and posterior to the caudal peduncle. Let the tissue bleed out in the deionized water inside the petri dish. Using forceps, collect and transfer the caudal peduncle into the prepared fixative solution in a microcentrifuge tube.Carefully invert the tube several times. Before mounting, wash the fixed tissue in PBS for 10 minutes on a rocker. Then transfer it into a two-milliliter microcentrifuge tube containing a solution of 30%sucrose in deionized water, pre-cooled to four degrees Celsius and gently invert the tube several times.Leave the tube upright at 4 degrees Celsius for at least 24 hours. Fill an embedding mold with a five-millimeter layer of OCT mounting medium. Using forceps, place the caudal peduncle at the bottom of the mold.Adjust its orientation for either transversal or coronal sections. Let the medium freeze in a box of dry ice. As soon as the tissue is stabilized in the desired position, fill up the rest of the mold before the OCT completely freezes over.Store the mold at 80 degrees Celsius for at least one hour before sectioning the tissue using a cryostat. The extent of cryoinjury at different days post-cryoinjury, or DPCI, was analyzed in the caudal peduncle sections using trichrome staining composed of Aniline Blue, Acid Fuschin, and Orange-G. The damaged areas were determined by the absence of orange staining.At 4 and 7 dpci, the transverse section displayed extensively degenerated skeletal muscle in the cryoinjured flank of the body. Immunofluorescence analysis showed that, at 4 DPCI, the injured side of the caudal peduncle contained abundant DAPI-positive cells but little to no F-actin and tropomyosin 1, indicating degenerated muscles. At 7 dpci, tropomyosin 1 and F-actin could be detected in the wound, close to the vertical body midline, indicating the start of new myofiber formation.At 30 dpci, both sides of the body displayed a similar distribution of F-actin staining, indicating efficient skeletal muscle restoration.