Und der Regierung von Victoria (VESKI Innovation Fellowship MEC; Finanzierung dieser Arbeit wird von der National Health and Medical Research Council of Australia (Independent Research Institute Infrastructure Support Scheme [IRIISS] Zuschuss an WEHI NHMRC Projektförderung 1011352 zur MEC und MJC) vorgesehen ist; Victorian State Government Operational Support der Infrastruktur, um WEHI). MEC ist ein Queen Elizabeth II Fellow des Australian Research Council. EFXB dankt für die Unterstützung aus der Norma Hilda Schuster Scholarship Program an der University of Melbourne.

Ein. Klonierung und Construct Design- Klonen die Sequenzen von Interesse in der PMM-Peptid-Vektor (die auf Wunsch zur Verfügung gestellt werden) mit HindIII und BamHI Restriktionsstellen (siehe Abbildung 1). Die doppelsträngige DNA-Insert sollte aufzunehmen, in der folgenden Reihenfolge: eine HindIII-Stelle; eine einzige Codon für Methionin CNBr-Spaltung, die E. coli-Codon-optimierte kodierende Sequenz, einen Stoppcodon, eine BamHI-Stelle. Alle anderen Methionine im Peptid sollten beseitigt werden und die Dipeptidsequenz Asp-Pro sollte vermieden werden, da es auch in sauren Bedingungen gespalten werden. Ein einzigartiges Cysteinrest sollten in jedem Peptid-Sequenz entsprechend der gewünschten Positionierung des Disulfid Vernetzungsdichte im fertigen Komplex eingeführt werden, und alle anderen Cysteinen sollte zu Serin mutiert werden. Das Plasmid trägt eine Kanamycin-Resistenzkassette zur Auswahl. 2. Die Expression von trpLE-peptide Fusion <ol><li> Make-up und Sterilfilter M9/Kan minimal Wachstumsmedium (0,1 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / l NaCl, 1 g / l NH 4 Cl, 4 g / l Glucose, 50 mg / l Kanamycinsulfat). Supplement mit Centrum Komplett von A bis Zink, B-Vitamine und Spurenelemente liefern: 1 Tablette in 40 ml H 2 O mit dem Mischen für 30 min, Zentrifuge, um unlösliches Material und Sterilfilter die orangefarbene Überstand zu entfernen. Lagerung der Stammlösung bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 2 Wochen und verwenden 4 ml / L in M9. Hinweis: 15 N-angereicherten NH 4 Cl, 13 C-angereicherte Glukose oder anderen stabilen Isotopen-markierten Vorstufen können in M9-Medium in dieser Phase aufgenommen werden, falls gewünscht. </li><li> Beimpfen von 100 ml Vorkultur aus frisch transformierten BL21 (DE3)-Stamm E. coli in M9/Kan Medium. Wachsen über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 200 rpm. </li><li> Am nächsten Morgen, überprüfen Sie die OD 600 der Starter-Kultur - dies sollte im Bereich von 2 oder größer sein. Verdünnen Sie die 100 ml Starterkultur in 1 L Gesamtvolumen von Centrum-ergänzt M9 Medium. Aufgespalten in zwei 2 L Schikanekolben (500 ml Kultur in jedem Kolben) und wachsen bei 37 ° C unter Schütteln bei 140 rpm, bis die OD 600 erreicht 0.6. </li><li> Stellen Sie den Schüttler Temperatur auf 18 ° C und weiter Schütteln für 1 Stunde, so dass Kulturen vollständig abkühlen, bevor Induktion. </li><li> Nehmen Vorinduktion Probe für die SDS-PAGE-Analyse (Äquivalent von 50 ul aus einer Kultur bei OD 600 = 1), dann Hinzufügen von IPTG bis zu 0,1 mM Endkonzentration um die Expression des trpLE-Peptid-Fusion zu induzieren. Weiter wachsen bei 18 ° C/140 rpm über Nacht (16-20 h) unter IPTG-Induktion. </li></ol> 3. Inclusion Body Vorbereitung und Nickel Matrix Binding <ol><li> Die endgültige OD 600 der Übernachtungen Ausdruck Kulturen in Minimalmedium ist variabel und should zwischen 2,5 und 5,0 liegen. Eine Probe für die SDS-PAGE-Analyse (Äquivalent von 50 ul aus einer Kultur bei OD 600 = 1) und zu sammeln Zellen durch Zentrifugation für 20 min bei 5.000 x g beträgt. </li><li> Zellpellet aus 1 l-Kultur in 50 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Zellsuspensionen können eingefroren für spätere Verarbeitung werden. </li><li> Lysieren Zellen durch Beschallung auf Eis bei maximaler Ausgangsleistung für 1 min und Rest auf Eis für 5 min. Wir verwenden eine Misonix Sonicator 3000 (max Leistung 600 Watt) mit einem ½-Zoll-High-intensity austauschbaren Spitze. Wiederholen Beschallung / Kühlung für drei Zyklen. </li><li> Sammeln unlöslicher Einschlusskörper (IB) Material durch Zentrifugation für 15 min bei 20.000 × g und der Überstand verworfen. Ein loses, dünne Schicht aus helleren Zelltrümmern kann sichtbar auf der Oberseite des dichten IB-Pellet, dies kann weggewaschen werden unter Verwendung von Wasser oder Pufferlösung unter leichtem Schütteln. Schritte 3.3 und 3.4 wiederholt werden, um die Reinheit des IB Fraktion zu verbessern, sobald desired. Proben von Pellet und Überstand Material sollte für die SDS-PAGE-Analyse getroffen werden, um trpLE-TM Fusion Lokalisation an inclusion bodies bestätigen. </li><li> Aufzulösen IB Pellets in Guanidin-Lösung (6 M Guanidin HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME) unter Verwendung von 25 bis 50 ml pro Liter Kultur verarbeitet. Dieser Schritt wird mehrere Stunden unter Rühren und gelegentliche milde Ultraschallbehandlung erfordern. </li><li> Deaktivieren Sie das IB Lysat durch Zentrifugation für 1 Stunde bei 75,000-100,000 xg und 20 ° C. Den Überstand umfüllen und durch ein 0,2 &amp;mgr; m-Membran. </li><li> Kombinieren der freiwerdenden IB Lysat, in einem 50 ml konischen Röhrchen oder einen größeren Behälter, die sicher geschlossen werden kann, mit Nickel Affinitätsharz, das mit Wasser und äquilibriert um Guanidin-Lösung gewaschen wurde. Verwenden Sie 3-4 ml angesiedelt Harzes pro Liter der Kultur für Fusionen, die zu einem ähnlichen Grad auszudrücken, wie trpLE-DAP12TM hier (Abbildung 3, Spur 2) gezeigt, verarbeitet. Batch bind durch Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur t<html> emperatur unter leichtem Rühren. </li></ol> 4. On-Column-oxidative Vernetzung <ol><li> Legen Sie das IB-Lysat / Nickel Harzsuspension in ein leeres Schwerkraft Säule mit porösem Bett Unterstützung, indem kontinuierlich, bis das gesamte Volumen fließt. Sammeln und beiseite der Durchfluss, die gegebenenfalls noch ungebundenen Fusionsprotein. </li><li> Waschen Nickel Harz durch Schwerkraftfluß mit 5 Bettvolumina Harnstofflösung (8 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl), enthaltend 5 mM β-ME. </li><li> Waschen Sie die Nickel-Harz nochmals mit 5 Bettvolumina Harnstofflösung ohne β-ME. </li><li> Wäscht den Nickel-Harz ein drittes Mal mit 5 Bettvolumen von Harnstoff-Lösung, die mit 20 pM CuSO 4 und 2 mM oxidiertes Glutathion ergänzt wurde. Nach diesem Waschen, schließen Sie die Spalte Steckdose und inkubieren 30 min bei Raumtemperatur auf maximal Disulfidbindungsbildung ermöglichen. </li></ol> 5. TFA Elution und Quantifizierung Inhalt &quot;&gt; ACHTUNG: Trifluoressigsäure (TFA) verursacht schwere Verbrennungen bei Berührung mit der Haut und Dämpfe sind stark reizend Concentrated TFA sollte nur in einem zugelassenen chemischen Abzugshaube mit Augenschutz und Nicht-Latex-Handschuhe verwendet werden Überprüfen Sie die chemische Kompatibilität aller.. verwendeten Materialien Polypropylen ist kompatibel mit allen Schritten dieses Protokolls. <ol><li> Auswaschen oxidierende Harnstofflösung mit 10 Bettvolumina Wasser und trocknen Sie die Säulenbett durch Anlegen eines Vakuums Zeile der Spalte Steckdose. </li><li> Schließen Sie die Säulenauslass und fügen 1,5 Bettvolumina ordentlich (99-100%) TFA. Rühren Sie die Nickel-Harz mit einem kleinen Spatel noch Einwirkung von Säure zu gewährleisten und Inkubation für 5 min. Öffnen des Säulenauslaß und sammelt das saure Eluat Unterdrucksetzen vorsichtig mit einer Spritze oder Druckluftleitung ggf. zum Ausschieben gesamte Flüssigkeit. </li><li> Wiederholen Sie den Säureelution Schritt mit weiteren 1,5 Bettvolumina ordentlich TFA. Arbeiten Sie schnell bei diesem Schritt um eine vollständige Auflösung des Beade vermeidend Agarosematrix. Proteinausbeute kann an dieser Stelle gemäß dem Lambert-Beer-Gleichung und dem theoretischen molaren Extinktionskoeffizienten des trpLE-Peptid-Sequenz bestimmt werden. Verdünnen einer Probe des TFA-Eluat (1.20 bis 01.50) in Trifluorethanol (TFE) und Messung der Absorption bei 280 nm, mit TFA / TFE bei gleicher Verdünnung als Blindprobe. </li></ol> 6. CNBr Verdauung ACHTUNG: Bromcyan (CNBr) ist extrem giftig und sollte nur in einem zugelassenen chemischen Abzugshaube behandelt werden. PSA einschließlich Schutzbrille, Kittel und Nicht-Latex-Handschuhe sind zwingend erforderlich. CNBr reaktiv ist gegenüber Feuchtigkeit und auf Raumtemperatur vor dem Öffnen. Kontaktieren Sie Ihren institutionellen Safety Office Anweisungen zur Neutralisierung / Entsorgung von CNBr-kontaminierten Lösungen und Materialien. <ol><li> Verdünnen des sauren Eluats auf 80% TFA endgültige Konzentration durch tropfenweise Zugabe von Wasser unter Mischen sanft. Wenn ein Niederschlag bildet, eindd zurück ein kleines Volumen (0,5 bis 1 ml) von reinem TFA bis die Lösung klar, dann wieder richtig zu 80% mit Wasser. Nehmen Sie eine 5 ul pre-Digest Probe für SDS-PAGE-Analyse, das Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lyophilisieren die Probe sofort. </li><li> Fügen CNBr Kristalle etwa 0,2 g / ml, wobei darauf zu achten die giftige Chemikalie sicher wiegen in geschlossenen, vorgewogenen Rohren oder mit einer Waage in der chemischen Abzugshaube. Vorsichtig mischen, bis sie vollständig aufgelöst. Spül-und versiegeln das Reaktionsgefäß unter Schutzgas (Stickstoff oder Argon-Strom) und inkubieren 3-4 Stunden bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. </li><li> Nehmen Sie eine 5 ul post-Digest Probe für SDS-PAGE-Analyse und frieren und lyophilisiert sofort. Übertragen des Digest Reaktion auf eine Regeneratcellulose Dialysekassette oder Schlauch (Celluloseacetat wird in konzentrierter Säure auflöst) mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3,5 kDa oder weniger, je nach der Größe des erwarteten Peptid-Komplexes. Dialysieren über Nacht auf 4 l Wasser in derLaborabzug zur Verringerung der TFA-Konzentration und zersetzen nicht umgesetztes CNBr. Lassen Sie Platz in der Dialyse Kassette oder Schläuche für eine signifikante Zunahme des Volumens (so viel wie zwei-bis drei-fach) während Dialyse über Nacht. </li><li> Entfernen der dialysierten Reaktionslösung mit suspendierten Niederschlag aus der Dialyse-Kassette oder Schlauch (meiste Protein auszufällen wird, wenn die Konzentration verringert wird TFA) und übertragen die Suspension auf 50 ml konischen Röhrchen. Einfrieren und lyophilisieren, um Wasser und Spuren von CNBr / TFA zu entfernen. Dieser Schritt ist wahrscheinlich erfordern mehrere Tage. ACHTUNG: Sowohl die dialysierten Digest Reaktion und die Dialyse Wasser sollte weiterhin als giftig und behandelt / entsorgt mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. </li><li> Proben der Kulturen aus Vorinduktion und Ernte Stufen Einschlusskörper Überstand und Pellet, TFA-Eluat und CNBr-verdaute Material kann durch SDS-PAGE analysiert werden. Planen Proben durch Erhitzen auf 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS sample Puffer. TFA Eluat und verdauen Proben sollten sowohl in reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen hergestellt werden, um Produkt-Identifikation und Bewertung von oxidativen Vernetzung zu erleichtern. </li><li> Trennen der Proben auf einem 12% NuPAGE Bis-Tris vorgegossenen Acrylamidgel unter Verwendung MES-SDS Laufpuffer für eine optimale Auflösung der kleinsten Digest Produkte. </li></ol> 7. Reversed-Phase HPLC Aufreinigung von Disulfid-vernetztes Peptid-Komplexen <ol><li> Man löst bis zu 100 mg lyophilisiertes Digest Produkte in 2-3 ml Ameisensäure und ordentlich Last auf einem präparativen Maßstab (21,2 x 150 mm) Agilent Zorbax SB-300 C3 PrepHT Spalte in Lösungsmittel A (typischerweise 10-20% Acetonitril oder 5 -10% Isopropanol in Wasser mit 0,1% TFA). </li><li> Eluieren die Digest-Produkten in einem Gradienten von Lösungsmittel B (Acetonitril oder Isopropanol mit 0,1% TFA) über mindestens 5 Säulenvolumen. Siehe die Diskussion um Vorschläge für die Auswahl der optimalen Gradienten Bedingungen für verschiedene Peptidsequenzen. </li><li> Nehmen50-100 ul-Proben von jedem HPLC-Fraktion für die SDS-PAGE-Analyse und frieren und lyophilisiert sofort. Entfernung von Lösungsmittel HPLC erfolgt rasch und sollte in 1-2 h abgeschlossen. </li><li> Planen lyophilisiert HPLC-Proben für SDS-PAGE durch Erhitzen auf 95 ° C in Invitrogen NuPAGE LDS-Probenpuffer ohne Reduktionsmittel. Cool und aufgeteilt jeder Probe gleichmäßig in 2 Mikrozentrifugenröhrchen, Zugabe von 100 mM DTT, einer von ihnen und Nachwärmsysteme kurz. </li><li> Trennungen reduzierten und nicht reduzierten HPLC-Proben auf einem 12% NuPAGE Bis-Tris vorgegossenen Acrylamidgel mit MES-SDS Laufpuffer wie oben. Klein, hydrophobe Peptide oft nicht nehmen Coomassie gut färben und kann nicht an ihren erwarteten Molekulargewichten laufen. Jedoch sollte Vergleich reduzierten und nicht reduzierten Proben zu erleichtern Identifizierung der vernetzten Peptidprodukte und Beurteilung der Reinheit. </li><li> Analysieren der Kandidaten-Peptid-haltigen Fraktionen durch Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie (siehe Diskussion) zur Identifizierung der interessierenden Spezies und bestätigen die erwartete Masse. </li><li> Kombinieren, einfrieren und lyophilisieren HPLC-Fraktionen, die das reine, vernetzten TM-Peptid-Komplex und einen Trockengewicht des Endprodukts an Ausbeute zu bestimmen. Fraktionen mit hoher Isopropanol Inhalte dürfen nicht eingefroren bleiben. Wenn Peptidfraktionen trocknen auf einem Film anstatt einem flauschigen lyophilisierten Produkts, wieder auflösen den Film vollständig in einem kleinen Volumen von reinem Hexafluorisopropanol (HFIP), einfrieren und lyophilisieren erneut. Der HFIP-behandeltes Produkt sollte eine kleine, weiße Kegel, einfach gekippt wird und abgewogen werden. </li></ol>

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	<li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+into+the+blind+spot:+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer.">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li><li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state.">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases.">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles.">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li><li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling.">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface:+integrin+alphaIIbbeta3.">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li><li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor.">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex.">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li><li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+expression+and+purification+of+highly+insoluble+transmembrane+domains.">Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains.</a> Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).</li><li>Schnell, J. R., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+M2+proton+channel+of+influenza+A+virus.">Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.</a> Nature. 451, 591-595 (2008).</li><li>Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+isotope+labeling+of+cannabinoid+CB2+receptor+fragment,+CB2(180-233).">purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233).</a> Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).</li><li>Miozzari, G. F., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+the+leader+region+of+the+Escherichia+coli+tryptophan+operon.">Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon.</a> J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).</li><li>North, C. L., Blacklow, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor.">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li><li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor.">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li><li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis.">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid.">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li><li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer's+amyloid+protein.">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li><li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue.">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li><li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins.">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Expression von trpLE-TM Fusionen. Nach unserer Erfahrung sind trpLE-TM Fusionen schlecht in eine reiche Kultur-Medium bei 37 ° C angegeben, und die Kultur hier beschriebenen Bedingungen bewährt für viele verschiedene Sequenzen mit 1-4 Transmembrandomänen mit Ausbeuten bis hin bewährt haben 50 bis 150 mg / l reines, intaktem Fusionsprotein. Fusions-Codierung Drei-oder Vier-TM GPCR Fragmente (TM1-humanen CCR5 TM3 und TM4-TM7 bezeichnet) oder ein Kern katalytisches Fragment von menschlichem Signalpeptidpe...

Dieses Protokoll Angaben eine Prozedur entwickelten wir zu Disulfid-stabilisierten Komplexe von Transmembran (TM)-Peptide für strukturelle Untersuchungen mittels NMR-Lösung zu erzeugen haben. Das Verfahren nutzt die Expression durch die robuste ΔtrpLE1413 Fusionssystem (siehe unten) ergab und ermöglicht TM-Peptid-Komplexe mit definierter Zusammensetzung zu erzeugenden mit hochentwickelten stabilen Isotopen Markierungstechniken für moderne mehrdimensionalen NMR-Experimente werden. Wir haben diese Techniken eingesetzt werden, um mehrere NMR-Strukturen, die wichtige neue Informationen darüber, wie Lymphozyten-Aktivierung Immunrezeptoren werden aus mehreren Membran-Protein-Untereinheiten durch Interaktionen zwischen ihren TM-Domänen zusammengesetzt (kürzlich in 1 bewertet) ergab bestimmen. Diese Techniken sind auf viele andere Membranprotein Systeme sowie einer Vielzahl von nachgeschalteten analytischen Methoden zusätzlich zur Lösung NMR. Während die hier angegebene Beispiel nutzt nativen Cysteinresteum einen Komplex, der die natürliche Disulfid-gebundenen Proteins nachahmt, das Design ist gleichermaßen gut für die Erstellung von engineered Disulfidbindungen, um Komplexe, die normalerweise miteinander durch schwächere, nicht-kovalente Wechselwirkungen, wie Homo-und Hetero-dimeren TM Komplexe stabilisieren geeignet gehaltene epidermal growth factor receptor (EGFR)-Familie Proteinen 2-4 oder heterodimeren αβ Integrin-Komplexen 5,6. Extrem hydrophoben Peptidsequenzen wie die von der Lipid-Doppelschicht abgeleitet umspannenden Teile TM Proteine ​​sind äußerst schwierige Themen für biochemische und biophysikalische Studien. Zusätzlich dazu, dass sehr schwierig zu manipulieren Verwendung von Standard-Protein-und Peptidchemie Techniken, sind sie oft ziemlich toxisch für Zellen und sind daher schwer rekombinant herzustellen. Wir 7,8 und andere 9-11 gehabt haben bedeutende Erfolge Ausdruck solch schwierigen Peptidsequenzen in Bakterien als in-frame carboxyterminalenFusionen mit einer modifizierten Version des ΔtrpLE1413 Sequenz aus dem E. abgeleitete coli trp Operon 12. Die ~ 13 kDa Polypeptid trpLE von dieser Sequenz codierten können in hohen Konzentrationen unter einem T7-Promotor erzeugt werden und vollständig in Einschlusskörpern, wo Probleme bezüglich Toxizität und / oder Instabilität umgangen lokalisiert. Modifikation der Sequenz durch Hinzufügen einer Amino-terminalen Histidin-Tag 9-13 und Eliminierung von internen Methionin und Cystein-Reste aus der Sequenz 14 trpLE erlaubt trpLE-Peptid-Fusionen durch Metallionen-Affinitätschromatographie gereinigt werden und verdaut mit Cyanogenbromid (CNBr ), um den gewünschten Peptidsequenz. Wir haben erfolgreich dieses System verwendet, um mehr als ein Dutzend verschiedene Sequenzen als trpLE Fusionen darstellen Membranprotein-Fragmente, die weniger als vier Transmembrandomänen enthalten und exprimieren (7,8 und unveröffentlichte Ergebnisse; siehe auch Abschnitt Diskussion). Diewichtige Neuerung in diesem Protokoll ist die Identifizierung von Bedingungen, unter denen die unstrukturierte und sehr schlecht löslich trpLE-TM Fusionen effizient im Rahmen eines optimierten Workflow Disulfid-vernetzt werden können. Mehrere Aspekte der Expression mit hoher Ausbeute, die Handhabung und Reinigung von Peptid Produkte wurden ebenfalls gründlich optimiert, und den Empfehlungen hier vorgestellten gleichermaßen relevant für die Produktion von Nicht-Disulfid-vernetztes (monomeren) TM Peptid Produkte.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromcyan </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> STOFF. Gefahrgut. Sehr giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Berührung mit Säure sehr giftige Gase. Sehr giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen in der aquatischen Umwelt. </td></tr><tr><td> Trifluoressigsäure </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE-1000984387, CAS-Nummer 76-05-1 </td><td> STOFF. Gefahrgut., Verursacht schwere Verätzungen. Gesundheitsschädlich beim Einatmen. Schädlich für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen in der aquatischen Umwelt. </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, CAS-Nummer 60-24-2 </td><td> STOFF. Gefahrgut. Giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Reizt die Haut. Gefahr ernster Augenschäden. Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich. Sehr giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen in der aquatischen Umwelt. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Product Number 52512, CAS-Nr. 920-66-1 </td><td> STOFF. Gefahrgut. Gesundheitsschädlich beim Einatmen und Verschlucken. Verursacht Verätzungen. </td></tr><tr><td> Ameisensäure </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Flüssigkeit und Dampf entzündbar. Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. </td></tr><tr><td> Harnstoff </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Product Number, 817, CAS-Nr 57-13-6 </td><td> Beim Erhitzen Dezemberomposes zu Kohlendioxid und Ammoniak; wenn verbrannt, emittiert geringe Mengen von Stickoxiden. Kann Rötungen und Reizungen an Haut und Augen verursachen. </td></tr><tr><td> Guanidinhydrochlorid </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, CAS-Nummer: 50-01-1 </td><td> Gesundheitsschädlich beim Verschlucken Verursacht schwere Augenreizung, Verursacht Hautreizungen, Akute Toxizität Oral, hautreizend, Eye Reizend. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Product Number-T8532 CAS Nr.: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 ist ein nichtionisches Detergens, 100% Wirksubstanz, die oft in biochemischen Anwendungen verwendet wird, um Proteine ​​löslich zu machen. Triton X-100 hat keine antimikrobielle Eigenschaften und prüft eine vergleichsweise milden nicht-denaturierenden Detergenz </td></tr><tr><td> His-Select Nickel-Affinity Gel </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Katalog Num-P6611 </td><td> IS-Select Nickel Affinity Gel ist ein immobilisierter Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) Produkt. Die HIS-Select Nickel Affinity Gel ist ein proprietäres vierzähnigen Chelat auf Perlen Agarose mit Nickel, die speziell für den binden Histidin enthaltenden Proteinen aufgeladen ist. </td></tr><tr><td> (-)-Glutathion, oxidiertem </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Katalog num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 Sonicator </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (eingestellt) </td><td> Max. Ausgangsleistung 600 Watt. 1/2-Zoll auswechselbaren-tip-Sonde nimmt 1/2-Zoll hoher Intensität, High-Volume-Tipps und eine Reihe von hoher Intensität, Low-Volume-Tipps. Closest derzeit verfügbaren Modelle dieser Firma sind Q500 und Q700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: BioLogic DuoFlow Chromatographie-System, Software Version 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Katalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 </td><td> Peptide bindet an HPLC-Säulen in hoher aq umkehrenueous mobile Phase und werden von RP-HPLC-Säulen mit hohen organischen mobilen Phase eluiert. In RP HPLC Peptide werden auf der Grundlage ihrer hydrophoben Charakter getrennt. Peptide können durch Ausführen eines linearen Gradienten von organischem Lösungsmittel abgetrennt werden. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-analytische HPLC-Säule, 21,2 x 150 mm, 5 mm Korngröße </td><td> Agilent </td><td> Artikel-Nr: 895150-909 </td><td> Umkehrphasen-HPLC colum </td></tr><tr><td> 12% NuPAGE Bis-Tris-Gele </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Pre Gele für Protein-Elektrophorese </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer G2 Dialyse Kassetten, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> Artikel Nr.: 87724 </td><td> Beispiel Dialyse </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

Physikalische Wechselwirkungen zwischen den Lipid-eingebetteter Alpha-Helix-Domänen von Membranproteinen spielen eine entscheidende Rolle bei der Faltung und Montage von Membranprotein-Komplexen und bei dynamischen Prozessen wie Transmembran (TM)-Signalisierung und Regelung Zelloberflächenprotein Ebenen. Das Verständnis der strukturellen Merkmale der Fahrt die Assoziation von bestimmten Sequenzen erfordert ausgefeilte biophysikalische und biochemische Analysen der TM-Peptid-Komplexe. Allerdings macht die extremen Hydrophobie Transmembrandomänen sie sehr schwierig zu handhaben Verwendung von Standard-Techniken der Peptidchemie, und Herstellung von geeigneten Lehrmaterial erweist sich oft als prohibitiv anspruchsvoll. Identifizieren Bedingungen, unter denen Peptide stabile helicale Konformationen und bilden Komplexe annehmen kann spontan fügt eine weitere Schwierigkeit. Hier stellen wir ein Verfahren zur Herstellung von Homo-oder Hetero-dimeren TM-Peptid-Komplexe aus Materialien, die in E. exprimiert werden coli, wodurch Einbau von stabilen Isotopenmarker für Kernspinresonanz (NMR) oder nicht-natürlichen Aminosäuren für andere Anwendungen relativ kostengünstig. Die wichtige Neuerung an diesem Verfahren ist, dass TM-Komplexe gebildet werden und gereinigt, wie kovalent assoziiert (Disulfid-vernetzt) ​​Anordnungen, die stabile, homogene stöchiometrische und Strukturen bilden können, wenn sie in Wasch-, Lipid oder eine andere Membran-mimetischen Materialien rekonstituiert. Wir präsentieren auch sorgfältig optimierten Verfahren zur Expression und Reinigung, die in gleicher Weise anwendbar, ob die Herstellung von ein TM-Domänen oder vernetzte Komplexe sind und beraten für die Anpassung dieser Methoden, um neue TM-Sequenzen.

Die Höhe der Ausdruck für trpLE Fusionen erreicht ist variabel und hängt stark von der Aminosäure-Sequenz der angehängten Peptid. Abbildung 3 zeigt die SDS-PAGE-Analyse von Vorinduktion (Spur 1) und Time-of-Ernte (Spur 2) Proben aus einer Kultur, die ca. 120 mg reines, intakte trpLE-DAP12TM Fusionsprotein aus 1 Liter Kultur und 4 ml Nickelmatrix ergab. Alle der trpLE-DAP12TM Fusionsprotein wurde zu der Einschlusskörper Pellet (Spur 4), um Überstand (Bahn 3) gegenüberliegenden lokalisiert. <p...

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Biophysikalische und biochemische Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen den membranständigen eingebettet Proteindomänen stehen viele technische Herausforderungen, von denen der erste Abschluß einer entsprechenden Studie Material ist. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Reinigung Disulfid-stabilisierten Transmembran-Peptid-Komplexe, die geeignet für die Strukturanalyse durch Lösungspolymerisation Kernspinresonanz (NMR) und andere analytische Anwendungen sind.

Produktion von Disulfid-stabilisierte Transmembrane Peptid-Komplexe für Structural Studies

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

14.0K Aufrufe.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. Biophysikalische und biochemische Untersuchungen der Wechselwirkungen zwischen den membranständigen eingebettet Proteindomänen stehen viele technische Herausforderungen, von denen der erste Abschluß einer entsprechenden Studie Material ist. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Reinigung Disulfid-stabilisierten Transmembran-Peptid-Komplexe, die geeignet für die Strukturanalyse durch Lösungspolymerisation Kernspinresonanz (NMR) und andere analyti...

Serie: Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

Steady-State-, Pre-Steady-State-und Einzel-Umsatz Kinetic Measurement für DNA Glycosylase Aktivität

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Forschung

Chemie

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the chromatograms to microbial suspensions (e.g. fungi or bacteria in broth or agar), allowing time for the microbes to grow in a humid environment, and visualizing zones with no microbial growth.&#160;The effectiveness of this screening method, known as bioautography, depends on both the quality of the chromatographic separation and the care taken with microbial culture conditions.&#160;This paper describes standard protocols for TLC and contact bioautography&#160;with a novel application to amino acid-fermenting bacteria. The extract is separated on flexible (aluminum-backed) silica TLC plates, and bands are visualized under ultraviolet (UV) light.&#160;Zones are cut out and incubated face down onto agar inoculated with the test microorganism.&#160;Inhibitory bands are visualized by staining the agar plates with tetrazolium red.&#160;The method is applied to the separation of red clover (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolic compounds and their screening for activity against Clostridium sticklandii, a hyper ammonia-producing bacterium (HAB) that is native to the bovine rumen.&#160;The TLC methods apply to many types of plant extracts&#160;and other bacterial species (aerobic or anaerobic), as well as fungi, can be used as test organisms if culture conditions are modified to fit the growth requirements of the species.

Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Methods are described for thin-layer chromatographic (TLC) separation of plant extracts and contact bioautography to identify antibacterial metabolites. The methods are applied to the screening of red clover phenolic compounds inhibiting hyper&#160;ammonia-producing bacteria (HAB) native to the bovine rumen.

Dünnschicht-Chromatographie-(TLC) Trennungen und Bioassays der Pflanzenextrakte antimikrobielle Verbindungen zu identifizieren

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Kapillarelektrophorese zum Monitor Peptid Verpflanzen auf Chitosanfilme in Echtzeit

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, allowing for the synthesis of isotactic poly(&#945;-hydroxy acids) with expected molecular weights (&#62;140 kDa) and narrow molecular weight distributions (Mw/Mn &#60; 1.1). This ring-opening polymerization is mediated by Ni and Zn complexes in the presence of an alcohol initiator and a photoredox Ir catalyst, irradiated by a blue LED (400 - 500 nm). The polymerization is performed at a low temperature (-15 &#176;C) to avoid undesired side reactions. The complete monomer consumption can be achieved within 4 - 8 hours, providing a polymer close to the expected molecular weight with narrow molecular weight distribution. The resulted number-average molecular weight shows a linear correlation with the degree of polymerization up to 1000. The homodecoupling 1H NMR study confirms that the obtained polymer is isotactic without epimerization. This polymerization reported herein offers a strategy for achieving rapid, controlled O-carboxyanhydrides polymerization to prepare stereoregular poly(&#945;-hydroxy acids) and its copolymers bearing various functional side-chain groups.

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

A protocol for the controlled photoredox ring-opening polymerization of O-carboxyanhydrides mediated by Ni/Zn complexes is presented.

Kontrollierte Photoredox ringöffnende Polymerisation von O- Carboxyanhydrides vermittelt durch Ni/Zn-komplexe

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

Vorbereitung der stabile bicyclische Aziridinium Ionen und ihre Ring-Öffnung für die Synthese von Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

Neuartige Techniken zur Beobachtung von Strukturdynamik von Photoresponsive Flüssigkristallen

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analyse von Protein-Architekturen und Protein-Ligand-komplexen durch Integrative strukturelle Massenspektrometrie

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Preparation of SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each possessing two sulfur and one nitrogen donor atom functionalities (SNS) and based on bis-imidazole or bis-triazole compounds) are metallated with CoCl2&#183;6H2O to afford tridentate SNS pincer cobalt(II) complexes. Preparation of the cobalt(II) model complexes for liver alcohol dehydrogenase is facile. Based on a quick color change upon adding the CoCl2&#183;6H2O to acetonitrile solution that contains the ligand precursor, the complex forms rapidly. Formation of the metal complex is complete after allowing the solution to reflux overnight. These cobalt(II) complexes serve as models for the zinc active site in liver alcohol dehydrogenase (LADH). The complexes are characterized using single crystal X-ray diffraction, electrospray mass spectrometry, ultra-violet visible spectroscopy, and elemental analysis. To accurately determine the structure of the complex, its single crystal structure must be determined. Single crystals of the complexes that are suitable for X-ray diffraction are then grown via slow vapor diffusion of diethyl ether into an acetonitrile solution that contains the cobalt(II) complex. For high quality crystals, recrystallization typically takes place over a 1 week period, or longer. The method can be applied to the preparation of other model coordination complexes and can be used in undergraduate teaching laboratories. Finally, it is believed that others may find this recrystallization method to obtain single crystals beneficial to their research.

Preparation of SNS CobaltII Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

The preparation of SNS pincer cobalt(II) model complexes of liver alcohol dehydrogenase is presented here. The complexes can be prepared by reacting the ligand precursor with CoCl2&#183;6H2O and can then be recrystallized by allowing diethyl ether to slowly diffuse into an acetonitrile solution that contains the cobalt complex.

Herstellung von SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.