Wir möchten Amie Regan für die sorgfältige Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde von NGFN Plus-Grant # 01GS0801, MRC Stipendium Zuschuss G1002523 und NHSBT Zuschuss WP11-05 LD und DFG FR2938/1-1 zu CCF unterstützt

1. Metabolische Markierung mit 4-Thiouridin Machen Sie einen detaillierten Plan des Versuchsaufbaus / schedule, z. B. wenn die 4SU auf Zellkultur hinzufügen und wenn die Proben zu ernten. Plan für mindestens 5 min zwischen jeder Bedingung. Nur behandeln Zellen einer Bedingung zu einer Zeit. Griff max. 3 - 5 Gerichte zu einem bestimmten Zeitpunkt. Griff Zellen möglichst schnell auf Veränderungen der Temperatur und CO 2-Gehalt zu minimieren. Vermeiden, dass die Zellen dem Licht nach 4SU zugesetzt, da dies zu einer Vernetzung der 4SU-markierten RNA an zelluläre Proteine ​​führen kann. Beginn der Kennzeichnung <ol><li> Thaw 4-Thiouridin (4SU) kurz vor der Verwendung und Pipette erforderliche Menge an 4SU für jede Bedingung in ein steriles Falcon-Röhrchen. </li><li> Nehmen Sie die erforderliche Menge an Zellkulturmedium (5 ml pro 10 cm Schale) von den Gerichten und in den 4SU-haltigen Falcon-Röhrchen und gründlich mischen. Entfernen und entsorgen Sie die restlichen Mittel aus den Gerichten. </li> &lt;li&gt; Übernehmen 4SU-haltigem Medium zurück zu den Gerichten. </li></ol> Ende der Etikettierung <ol start="4"><li> Entfernen Zellkulturmedium aus Zellen. 5 ml Trizol zu jeder Platte. Für komplexe Experimente mit mehreren Zeitpunkten oder Bedingungen, wird dieser Schritt am besten durch zwei Personen, ein Entfernen des Mediums, die andere Zugabe Trizol und Ernte des Lysats getan. </li><li> Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur für die komplette Zell-Lyse. </li><li> Verwenden Sie eine 10 ml Pipette, um die Platte sorgfältig spülen mit dem zusätzlichen Trizol. Dies hilft vollständige Zelllyse und Probe Erholung. Gehen Sie vorsichtig mit Trizol ist extrem gefährlich, wenn immer in Kontakt mit der Haut oder den Augen! Haben Gegenmittel für Phenol Verbrennungen an der Hand (z. B. Polyethylenglykol 300 oder 400 in der industriellen Brennspiritus (70:30)). Übertragen Proben Polypropylenröhrchen. Bitte beachten Sie, dass Standard-Falcon-Röhrchen nicht widerstehen diese hohen g-Kräfte). Die Proben können bei -20 ° C für mindestens einen Monat bis Gesamt-RNA aus der is hergestellt. </li></ol> 2. RNA Vorbereitung mit modifizierten Trizol Protocol <ol><li> 1 ml Chloroform (0,2 ml pro ml Trizol) und kräftig schütteln für 15 sec. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 - 3 min. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 × g für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Übertragen wässrige obere Phase (mit dem RNA) in ein neues 15 ml Polypropylen-Röhrchen. </li><li> In der Reaktion ½ Volumen der beiden RNA Niederschlag Puffer und Isopropanol (zB auf 3 ml Überstand 1,5 ml RNA Niederschlag Puffer und 1,5 ml Isopropanol). </li><li> Gut mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. </li><li> Spin down kurz (5.000 × g für 30 sec) und restliches Isopropanol mit 200 ul Pipette. </li><li> In ein gleiches Volumen 75% Ethanol und schütteln, bis das Rohr Pellet löst. Vermeiden Sie brechen sie in viele kleine Stücke, da dies, kann die Entfernung von Rückständenl Ethanol schwierig. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. </li><li> Spin down RNA kurz und entfernen restliche Ethanol mit einer 200 ul Pipette. Wiederholen Sie Schritt und entfernen restliche Ethanol mit einem 20 ul Pipette. Nach diesen beiden Schritten sollten keine weiteren Trocknung der Pellets vorgenommen werden. </li><li> In 100 ul H 2 O pro 100 ug erwartet RNA-Ausbeute und gut mischen durch Auf-und Abpipettieren 5-6 mal, um das Lösen der RNA zu unterstützen. </li><li> Auflösen und denaturieren RNA durch Erhitzen auf 65 ° C für 10 min (Shaker) und sofort auf Eis stellen. </li><li> Messen RNA-Konzentration bei 260 nm mit einem Spektralphotometer NanoDrop, nach den Anweisungen des Herstellers. Diese RNA kann bei -80 ° C für mindestens einen Monat gelagert werden. </li></ol> 3. Thiol-spezifische Biotinylierung von Neu transkribierten RNA <ol><li> Beginnen Sie mit 60 - 80 ug Gesamt zellulären RNA. </li><li> Bilden Kennzeichnung Reaktion. Pipette in der folgendenBestellung (pro ug RNA): <ol class="lalpha"><li> 1 ul 10x Biotinylierung Buffer </li><li> 7 ul RNA (mit 1 ug RNA in Nuklease-freiem H 2 O verdünnt) </li><li> 2 ul Biotin-HPDP (1 mg / ml DMF) </li></ol></li></ol> Fügen Sie immer die Biotin-HPDP letzte und sofort mischen durch Pipettieren. Falls die Biotin ausfällt, kann DMF-Gehalt bis zu einer Endkonzentration von 40% gesteigert werden. <ol start="3"><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 1,5 h bei Drehung. </li><li> Fügen Sie dem gleichen Volumen Chloroform. Gründlich mischen. Inkubieren 2 - 3 Minuten, bis die Phasen zu trennen beginnen und Blasen beginnen zu verschwinden. </li><li> Zentrifuge bei 20.000 × g für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig übertragen die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 einmal. Sie können diesen Schritt in 2 ml Phase Lock Gel Schwere Rohre führen zum Verlust der RNA zu reduzieren. </li><li> RNA Niederschlag: Add 1/10 das Volumen von 5 M NaCl und ein gleiches Volumen vonIsopropanol auf die Wasserphase. </li><li> Zentrifuge bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. </li><li> In ein gleiches Volumen 75% Ethanol, Zentrifuge bei 20.000 × g für 10 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen. </li><li> Spin kurz und entfernen Restethanol mit 200 ul Pipette. </li><li> Spin kurz und entfernen restliche Ethanol mit 20 ul Pipette. </li><li> Nicht in die RNA zu trocknen. Re-suspend es in 50 - 100 ul H 2 O (~ 1 ul pro 1 ug Eingang RNA). Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren 5 - 6 mal. </li><li> Prüfen RNA-Qualität durch elektrophoretische Analyse auf RNA-Abbau auszuschließen. </li></ol> 4. Dot-Blot-Analyse von 4SU-Einbau (Optional) 4SU ​​Einarbeitung kann leicht durch Dot-Blot-Analyse von biotinylierten RNA bestimmt werden. Dies ist ein optionaler Schritt, Fehlersuche und Abschätzung der 4SU Einbauraten relativ zu einem biotinylierten DNA-Oligo-Steuerung ermöglicht. Für diesen Test wir rIhr Kommentar zu Verwendung iodoacetyl-Biotin statt Biotin-HPDP für Biotinylierung 4SU-markierte RNA in Schritt 3.2. Dies führt zu einer irreversiblen Biotinylierung 4SU-RNA. Daher Spalte-Methoden (z. B. RNeasy) kann zur Rückgewinnung von viel kleineren Mengen von biotinylierten RNA (z. B. 5 ug) verwendet werden. Während RNA biotinyliert mit Biotin-HPDP eignet sich auch für diesen Assay ist das resultierende Signal schwächer und das Signal-Rausch-Verhältnis schlechter (Abb. 3). <ol><li> Verfolgen Sie das Protokoll für 4SU-Kennzeichnung und Isolierung von Gesamt-RNA zellulären wie in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben. </li><li> Biotinylieren 4SU-markierte RNA, wie in Kapitel 3 beschrieben ersetzt Biotin-HPDP mit iodoacetyl-Biotin und führen zwei Chloroformextraktionen vollständig zu entfernen übermäßige iodoacetyl-Biotin-Reste. </li><li> Recover biotinylierten RNA durch Isopropanol / Ethanol-Fällung wie beschrieben oder unter Verwendung einer Säule-basierten Ansatz (z. B. RNeasy) bei kleinen Mengen von RNA (&lt;10 pg) Verwendet. </li><li> Inkubieren Sie die Zeta Membran in Nuklease-freiem Wasser mit rockigen für 10 min. </li><li> Nehmen Sie die Membran aus der Nuklease-freies Wasser und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Membran zwischen zwei saubere Papierhandtücher und fest andrücken. Air-Trocknen der Membran für 5 min in schöner Punkten führen. </li><li> Für jede Probe, bereiten 20 ul 200 ng / ul RNA mit eiskaltem Dotblot Bindungspuffer (10 mM NaOH, 1 mM EDTA). Bewerben 5 ul dieser Verdünnung (dh 1 ug RNA) sowie drei weiteren 10-fache Verdünnungen (dh 100, 10 und 1 ng RNA, respectively) zum Zeta Membran durch Pipettieren. Pipettieren durch einen leeren Rack Pipettenspitzen verwendet werden, um gleichmäßig verteilt Abstand zu liefern. Alternativ können Sie einen Dot-Blot gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Anwenden 5 ul der Biotin-markierten DNA-Oligo in Konzentrationen von 20 ng / ul bis 20 pg / ul (dh 100 bis 0,1 ng Oligo) als positive control der Membran durch Pipettieren. Verwenden Sie einen biotinylierten, 4SU-naive Probe als negative Kontrolle. </li><li> Luft trocknen die Membran für 5 min. </li><li> Inkubieren der Membran für 30 min in 40 ml Blockierungspuffer unter Schütteln. </li><li> Inkubieren der Membran mit 10 ml 1:1000 Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase für 15 min (5 ml PBS + 5 ml 20% SDS + 10 ul Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase) </li><li> Waschen Membran zweimal in 40 ml PBS + 10% SDS (20 ml PBS + 20 ml 20% SDS) für 5 min. </li><li> Waschen Membran zweimal in 40 ml PBS + 1% SDS (38 ml PBS + 2 ml 20% SDS) für 5 min. </li><li> Waschen Membran zweimal in 40 ml PBS + 0,1% SDS (40 ml PBS + 200 ul 20% SDS) für 5 min. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Membran zwischen zwei saubere Papierhandtücher und Druck auf sie fest. </li><li> Visualisieren Membran-gebundenen HRP mit ECL den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Legen Sie die Membran in Folie / Beutel, Luftblasen entfernen und Inkubation für 2 min im Dunkeln. </li><li> Expose MembranFilm für 1 - 5 min. </li></ol> 5. Trennung von markierten und unmarkierten RNA unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen <ol><li> Wärme Waschpuffer (3 ml pro Probe) bis 65 ° C in einem Wasserbad inkubiert. </li><li> Bereiten Sie frischen 100 mM Dithiothreitol (DTT) in Nuklease-freiem H 2 O. Tun Sie dies durch Dekantieren 15 - 30 mg DTT Pulver in ein sauberes 50 ml Falcon-Röhrchen auf der ultra-feinen Waage gelegt. Wiegen und fügen erforderliche Menge an Nuklease-freiem H 2 O. </li><li> Wärme biotinylierte RNA-Proben auf 65 ° C für 10 min zur Denaturierung und sofort auf Eis stellen. </li><li> Platz μMacs Spalten in die magnetische Halterung. Wir empfehlen, nicht mehr als 12 Proben in einer Zeit (6 - 8 Proben sind optimal) zu verarbeiten. </li><li> Pre-Abgleichtransistor Miltenyi Säulen mit 1 ml Waschpuffer Raumtemperatur. Dies dauert etwa 15 min. </li><li> Inzwischen werden 100 ul Streptavidinbeads zu 50 - 100 ul biotinylierten RNA. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min mit der Drehung. </li> &lt;<html> li&gt; Wenn eine der Spalten nicht eingeleitet hat Ablassen von nun dies kann durch leichten Druck auf die Spitze der Säule mit einem behandschuhten Finger erleichtert werden. Sobald die Strömung hat begonnen die Säulen leicht abfließen kann. </li><li> Übernehmen Sie die RNA / Perlen an den Säulen. Verwerfen Sie den Durchfluss durch es sei denn, Sie wollen die unmarkierten RNA-Fraktion (siehe Abschnitt 7) zu erholen. </li><li> Waschen dreimal mit 0,9 ml 65 ° C Waschpuffer (1 ml Pipettenspitzen schrumpfen beim Pipettieren Puffer bei 65 ° C). </li><li> Dreimal mit 0,9 ml Waschpuffer Raumtemperatur. </li><li> Pipette 700 ul Puffer RLT (RNeasy MinElute Cleanup Kit, Qiagen) in neue 2-ml-Röhrchen und legen Sie sie unter den Spalten. </li><li> Eluieren neu transkribierten RNA in die RLT-Puffer durch Zugabe von 100 ul 100 mM DTT zu den Spalten. </li><li> Führen Sie eine zweite Elution Runde 3 min später in das gleiche Rohr durch das Hinzufügen eines weiteren 100 ul 100 mM DTT. </li></ol> 6. Wiederherstellung der neu transkribierten RNA NHALT &quot;&gt; mit dem RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen) nach Protokoll des Herstellers weiter. Elute in 25 ul Nuklease-freiem H 2 O. Measure RNA-Konzentrationen mit einem Spektralphotometer Nanodrop. Um den Bedarf auftauen und wieder einfrieren RNA vor dem Absenden zu vermeiden es zu einem High-Throughput-Assay, empfehlen wir die Vorbereitung unmittelbar nach dem neu transkribierten RNA cDNA gereinigt wird. Verwenden Sie 2,5 ul der neu transkribierten RNA in 20 ul cDNA-Synthese-Mix für cDNA-Synthese nach den Anweisungen des Herstellers. Führen qRT-PCR-Kontrollen unter Verwendung von 1 : 10 Verdünnungen der cDNA mix Shop RNA bei -80 ° C.. 7. Rückgewinnung von unbeschriftet, Unbound RNA (Optional) Bei der ungebundenen RNA wiederhergestellt werden muss, sammeln und kombinieren die Flow-Through (nach Zugabe der RNA-Streptavidinbeads Lösung für die Spalten) und die erste Wäsche für anschließende Fällung. In der Regel genügt es zur Ausfällung nur 50% des ungebundenen RNA als this enthält&gt; 80% des Ausgangsmaterials. <ol><li> Fügen Sie dem gleichen Volumen Isopropanol (kein Salz muss hinzugefügt wie der Waschpuffer enthält bereits 1 M NaCl werden). </li><li> Zentrifuge bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. </li><li> In ein gleiches Volumen 75% Ethanol, Zentrifuge bei 20.000 × g für 10 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen. </li><li> Spin kurz und entfernen Restethanol mit 200 ul Pipette. </li><li> Spin kurz und entfernen restliche Ethanol mit 20 ul Pipette. </li><li> Nicht in die RNA zu trocknen. Resuspendieren in 100 ul H 2 O. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren 5 - 6 mal. Inkubation bei 65 ° C für 10 min unter Schütteln und übertragen direkt zu Eis. </li><li> Prüfen RNA-Qualität durch elektrophoretische Analyse auf RNA-Abbau auszuschließen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Metabolische Markierung von neu transkribierten RNA wesentlich verbessert die Leistung von High-Throughput-Technologien wie Microarrays und RNA-seq durch die Bereitstellung geeigneter Vorlagen, um die biologische Frage von Interesse anzusprechen. Das vorliegende Protokoll umfangreich Optimierung. Es erlaubt&gt; 1000-fache Anreicherung von neu transkribierten RNA und bietet hoch reproduzierbare Ergebnisse. Der experimentelle Aufbau eines 4SU-Tagging Experiment ist von entscheidender Bedeutung...

Gene Expression Profiling ist ein wichtiges Instrument verwendet, um zelluläre Prozesse und die damit verbundenen komplexen Interaktion Netzwerk studieren. Studien zur mRNA waren typischerweise die Methode der Wahl, um grundlegende Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erhalten. Die Entwicklung der gesamten Transkriptom-Microarrays 1 und, in jüngerer Zeit, der nächsten Generation Sequenzierung von RNA (RNA-seq) 2-4 angeheizt diesen Ansatz. Während diese Technologien revolutioniert unser Verständnis der Komplexität der zellulären Genexpression, stehen sie wesentliche Einschränkungen aufgrund ihrer intrinsischen Eigenschaften der Vorlage Probe, dh gesamten zellulären RNA. Erstens, kurzfristige Veränderungen in Gesamt-RNA Ebenen nicht übereinstimmen Änderungen in Transkriptionsraten, sind aber von Natur aus abhängig von der RNA-Halbwertszeit der jeweiligen Transkripte. Während eine fünffache Induktion eines kurzlebigen Transkript, zB Codierung für einen Transkriptionsfaktor, wird leicht nachweisbar sein in Gesamt-RNAinnerhalb einer Stunde die gleiche Induktion einer langlebigen Transkript, z. B. Codierung für ein metabolisches Enzym, bleiben nahezu unsichtbar. Darüber hinaus, auch eine komplette Abschaltung (&gt; 1.000-fach Down-Regulation) in der Transkription von durchschnittlich Gen mit einer RNA-Halbwertszeit von fünf Stunden nehmen Sie einfach fünf Stunden seines gesamten RNA-Spiegel von nur zweifache verringern . Daher begünstigt Analyse von Gesamt-RNA die Erkennung von Up-Regulation von kurzlebigen Transkripte, von denen viele für Transkriptionsfaktoren und Gene mit regulatorischen Funktionen 5 codieren. Darüber hinaus wird die tatsächliche kinetische Kaskade Regelung verdunkelt und primären Signalwege nicht von sekundären unterschieden werden. Beide wiederum zu erheblichen Verzerrungen in stromabwärts bioinformaticsanalysen führen. Zweitens können Veränderungen in Gesamt-RNA Levels nicht auf Änderungen in der RNA-Synthese oder Zerfall zugeschrieben werden. Messungen der Letztere erfordern Zelle invasive Ansätze, z. B. Blockierung transcriptizur Verwendung von Actinomycin D 6, und erweiterte Überwachung der laufenden RNA Verfall im Laufe der Zeit. Bei einer mittleren mRNA Halbwertszeit in Säugerzellen von 5 - 10 h 5,7, wird mRNA-Spiegel der meisten Gene nur um weniger als das Doppelte nach mehreren Stunden der transkriptionellen Verhaftung verringert. Diese eher kleine Unterschiede führen in grob ungenaue Messungen von mRNA Halbwertszeiten für die meisten zellulären Genen aufgrund der exponentiellen Natur der zugrunde liegenden mathematischen Gleichungen. Schließlich, während RNA-seq der gesamten zellulären RNA ergab, dass etwa die Hälfte unserer Gene unterliegen alternatives Spleißen Veranstaltungen 8, den zugrunde liegenden Kinetik sowie die dynamischen Mechanismen Führung Gewebe-und Kontext-spezifische Regulation der RNA-Prozessierung noch schwer abzuschätzen sind. Darüber hinaus verarbeitet der Beitrag der RNA zu differentiellen Genexpression, insbesondere für nicht-kodierenden RNAs, bleibt zu bestimmen. Insgesamt stellen diese Einschränkungen Haupthindernisse fürbioinformatische kinetische Modellierung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Vor kurzem haben wir eine Methode entwickelt, genannt hochauflösende Genexpressionsanalysen, um diese Probleme zu überwinden 5,7,9. Es basiert auf metabolische Markierung der neu transkribierten RNA unter Verwendung von 4-Thiouridin (4SU-Tagging), ein natürlich vorkommendes Uridinderivat basiert und bietet direkten Zugang zu neu transkribierten Transkripte mit minimaler Störung des Zellwachstums und der Genexpression (siehe Abbildung 1) 5, 10-12. Exposure von eukaryotischen Zellen zu 4SU Ergebnisse in seine schnelle Aufnahme, Phosphorylierung 4SU-Triphosphat und Einbau in neu transkribierten RNA. Nach Isolierung der gesamten zellulären RNA ist die 4SU-markierten RNA-Fraktion Thiol-spezifisch biotinylierte Erzeugen einer Disulfidbrücke zwischen Biotin und den neu transkribierten RNA. &#39;Total zellulären RNA&#39; kann dann quantitativ in markierte (&#39;neu transkribiert&#39;) und unmarkierten (&#39;pre-existin getrennt werdeng &#39;) RNA mit hoher Reinheit unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen. Schließlich wird markierten RNA aus den Perlen durch Hinzufügen eines Reduktionsmittels (z. B. Dithiothreitol) Spalten der Disulfidbrücke und Lösen der neu transkribierten RNA aus den Perlen zurückgewonnen. Neu transkribiert RNA zeigt die transkriptionelle Aktivität von jedem Gen während des Zeitrahmens 4SU Exposition. 4SU-Tagging in der Zeitskala von Minuten stellt somit eine Momentaufnahme der eukaryotischen Genexpression und eine ideale Vorlage für down-stream bioinformatischen Analysen (z. B. Promotor-Analyse). In Fällen, in denen stationären Bedingungen angenommen werden kann, die Verhältnisse neu transkribiert / total neu transkribiert / unmarkiertem und unmarkierten / Gesamt-RNA liefern nicht-invasiven Zugang zu präzisen RNA Halbwertszeiten 7,13. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die neu transkribierten RNA nach nur 5 min von 4SU-Tagging (5 min 4SU-RNA) gereinigt beachten ist jünger als 15 und 60 min 4SU-RNA.Bei der Durchführung sowohl ultra-kurz und zunehmend länger 4SU-Tagging in einem experimentellen Setting mit RNA-seq kombiniert, werden die Kinetik der RNA-Prozessierung bei Nukleotid Auflösung 9 offenbart. Schließlich erlauben Zeitverlauf Analysen neu transkribiert und Gesamt-RNA mit Computermodellen kombiniert eine integrative Analyse der RNA-Synthese und Zerfall 14. Zusammenfassend kann dieser Ansatz zur direkten Analyse der Dynamik der RNA-Synthese, Verarbeitung und Zersetzung in eukaryotischen Zellen. Es gilt in allen wichtigen Modellorganismen einschließlich Säugetiere, Insekten (Drosophila), Amphibien (Xenopus) und Hefe 5,15,16. Es ist direkt kompatibel mit Microarray-Analyse 5,17, RNA-seq 9,13,14, und gilt in vivo 12,15. Hier haben wir ausführlich die Methodik zu beschriften, zu isolieren und zu reinigen, neu transkribierten RNA in kultivierten Säugetierzellen. Darüber hinaus Potentiometeral Probleme und Fallstricke werden diskutiert.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-thiouridine</td>
 <td>Carbosynth</td>
 <td>T4509</td>
 <td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 &deg;C in aliquots of 50-500 &mu;l, discard unused reagent, do not refreeze.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trizol</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td>
 <td>WARNING - CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>372978</td>
 <td>WARNING - HAZARDOUS TO HEALTH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isopropanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>650447</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate, nuclease-free</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8532</td>
 <td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5M nuclease-free NaCl</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>71386</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free H2O</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>W4502</td>
 <td>Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA precipitation buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>459844</td>
 <td>Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>51237</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15575-020</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Biotinylation Buffer (BB)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylformamide (DMF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link biotin-HPDP</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21341</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0032 005.152</td>
 <td>Optional for the chloroform extraction step.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeta membrane</td>
 <td>BIORAD</td>
 <td>162-0153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Dot blot binding buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-oligo</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>5'-biotin, 25 nucleotides, any sequence</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulphate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BPE9738</td>
 <td>For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 &deg;C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21333</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffer saline</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10010-015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dot blot blocking buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-horseradish peroxidase </td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>SA5004</td>
 <td>Store at -20 &deg;C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 &mu;l Streptavidin-HRP before use. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ECL reagent</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>RNP2109</td>
 <td>Use following the manufacturer's instructions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super RX, X-RA Film, 18x24 cm</td>
 <td>Fujifilm</td>
 <td>47410 19236</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&mu;Macs Streptavidin Kit</td>
 <td>Miltenyi</td>
 <td>130-074-101</td>
 <td>Store the beads at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P1379</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Washing buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>43817</td>
 <td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Store columns at 4 &deg;C, remaining components of the kit at room temperature.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.692.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.694.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV/VIS spectrophotometer</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>NanoDrop 1000</td>
 <td>Or equivalent. Use low volume (1-2 &mu;l) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene 15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>VWR International</td>
 <td>525-0153</td>
 <td>In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 &times; g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-25</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JLA-16250</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adaptors for 15 ml tubes</td>
 <td>Laborger&auml;te Beranek</td>
 <td>356964</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5430 R</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Thermomixer compact</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic stand</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-042-109</td>
 <td>One stand holds 8 &mu;Macs columns.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath</td>
 <td>Grant</td>
 <td>SUB Aqua 5</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultra-fine scale</td>
 <td>A&amp;D</td>
 <td>GR-202</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel iBase Power System</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G6400UK</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G4020-01</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

metabolic labeling of newly transcribed rna for high resolution gene expression profiling of rna synthesis, processing and decay in cell culture

Die Entwicklung der gesamten Transkriptom-Microarrays und Sequenzierung der nächsten Generation revolutioniert unser Verständnis der Komplexität der zellulären Genexpression. Zusammen mit einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen beteiligt sind genaue Messungen der zugrundeliegenden Kinetik immer wichtiger. Hier stehen diese leistungsstarken Methoden wesentliche Einschränkungen aufgrund intrinsischen Eigenschaften der Vorlage Proben sie studieren, dh gesamten zellulären RNA. In vielen Fällen Veränderungen in zelluläre Gesamt-RNA entstehen entweder zu langsam oder zu schnell, um die molekularen Mechanismen und deren Kinetik mit ausreichender Auflösung darzustellen. Darüber hinaus werden der Beitrag der Änderungen in der RNA-Synthese, Verarbeitung und Zerfall nicht ohne weiteres unterschieden. Wir haben vor kurzem entwickelte hochauflösende Genexpressionsanalysen, diese Einschränkungen zu überwinden. Unser Ansatz basiert auf metabolische Markierung der neu transkribierten RNA mit 4-thiouri Basisdine (daher auch als 4SU-Tagging bezeichnet) durch rigorose Reinigung neu transkribiert RNA mit Thiol-spezifische Biotinylierung und Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen gefolgt. Es ist für einen breiten Bereich von Organismen einschließlich Vertebraten, Drosophila und Hefe. Wir haben erfolgreich angewendet 4SU-Tagging, um Echtzeit-Kinetik der Transkriptionsfaktor Aktivitäten zu untersuchen, liefern präzise Messungen der RNA Halbwertszeiten und erhalten neue Einblicke in die Kinetik der RNA-Prozessierung. Schließlich können Computermodelle eingesetzt, um eine integrierte, umfassende Analyse der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erzeugen.

1. Ausgangsmaterial und erwartete Renditen Nach 1 Std. (hr) von 4SU-Exposition neu transkribierten RNA entspricht etwa 1-4% der gesamten zellulären RNA. Dies wird niedriger sein Wachstum verhaftet Zellen, da sie nicht mehr synthetisieren RNA zur Rechenschaft für das Zellwachstum / Replikation. Als Kennzeichnung für 1 Stunde, empfehlen wir der Testdurchführung mit 60 - 80 ug Gesamt-RNA. Beginnend mit weniger als 30 ug Gesamt-RNA Ergebnisse in kleinen RNA-Pellets, die schwer nach der Biotinyl...

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Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Zelluläre Gesamt-RNA ein Template für die Untersuchung schlechte kurzfristige Änderungen in der RNA-Synthese und Zerfall sowie die Kinetik der RNA-Prozessierung. Hier beschreiben wir metabolische Markierung der neu transkribierten RNA mit 4-Thiouridin gefolgt von Thiol-spezifische Biotinylierung und Aufreinigung von neu transkribierten RNA ermöglicht, diese Einschränkungen zu überwinden.

Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

metabolic-labeling-newly-transcribed-rna-for-high-resolution-gene

Research

JoVE Journal

Biology

27.0K Aufrufe.  Max von Pettenkofer Institute. Zelluläre Gesamt-RNA ein Template für die Untersuchung schlechte kurzfristige Änderungen in der RNA-Synthese und Zerfall sowie die Kinetik der RNA-Prozessierung. Hier beschreiben wir metabolische Markierung der neu transkribierten RNA mit 4-Thiouridin gefolgt von Thiol-spezifische Biotinylierung und Aufreinigung von neu transkribierten RNA ermöglicht, diese Einschränkungen zu überwinden.

Serie: Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

In vitro Transkription und Capping von Gaussia-Luciferase mRNA von HeLa-Zelle Transfektion Gefolgt

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Messung der Stoffwechselrate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit Respirationstest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...