Mit TRAP-seq können wir die RNA von bestimmten Zelltypen isolieren, wie z. B. den Hepatozyten, die in der verletzten Leber wieder bevölkert werden, um die in diesen Zellen auftretenden Veränderungen der Genexpression zu analysieren. Es erfordert keine Schritte, um unerwünschte Zellen aus dem Gewebe zu entfernen. Die zelltypspezifische RNA wird durch Affinitätsreinigung aus ganzen Organlysaten isoliert.
Diese Technik hilft uns zu bestimmen, wie bestimmte Zellen auf Verletzungen reagieren, die helfen könnten, neue Strategien oder Medikamente zur Bekämpfung von Lebererkrankungen zu identifizieren. Dies könnte verwendet werden, um zu identifizieren, wie Leberzellen auf verschiedene Arten von Leberverletzungen reagieren. Derzeit gibt es nur wenige Möglichkeiten für schwere akute Leberverletzungen und diese Methode wird uns helfen, uns in neue Behandlungen zu hinweisen.
Diese Methode stammt aus dem Gehirn. In der Leber, wir stellten uns vor, es könnte verwendet werden, um dynamische Veränderungen in einer Vielzahl von Zelltypen zu untersuchen, die Hepatozyten, Gallengangszellen, Kupffer-Zellen, und Endothelzellen, um nur einige zu nennen. Demonstriert wird das Verfahren von Amber Wang, einer Studentin und meiner Mentee.
Um zu beginnen, setzen Sie magnetische Perlen durch sanftePipettierung wieder auf. Sammeln Sie die Perlen auf einem magnetischen Ständer für mehr als eine Minute und entfernen Sie den Überstand. Entfernen Sie dann das Mikrozentrifugenrohr aus dem magnetischen Ständer und fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu, gefolgt von Pipetten nach oben und unten, um die Perlen zu waschen.
Legen Sie das Rohr für mehr als eine Minute wieder auf den magnetischen Ständer, um die Perlen zu sammeln und die PBS zu entfernen. Um Protein-L-beschichtete Perlen vorzubereiten, fügen Sie 16 Mikroliter biotinyliertes Protein L zu den resuspendierten und gewaschenen Magnetperlen hinzu und fügen Sie 1X PBS hinzu, um das endgültige Volumen zu einem Milliliter zu machen, wenn Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr oder 1,5 Milliliter verwenden, wenn Sie ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr verwenden. Die Magnetperlen mit biotinyliertem Protein L 35 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rohrrotator inkubieren.
Legen Sie dann die Röhre für mehr als eine Minute auf den magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand, um das Protein L-beschichtete Perlen zu sammeln. Entfernen Sie das Mikrozentrifugenrohr aus dem magnetischen Ständer und fügen Sie einen Milliliter PBS mit 3%BSA Puffer hinzu, gefolgt von einer sanften Pipettierung mindestens fünfmal, um das Protein L-beschichtete Perlen zu waschen. Stellen Sie das Rohr wieder für mehr als eine Minute auf den magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand, um die beschichteten Perlen zu sammeln.
Wiederholen Sie das BSA-Waschen noch viermal. Als nächstes fügen Sie 50 Mikrogramm Antikörper für GFP-Antikörper 19C8 und GFP-Antikörper 19F7 jeweils in das Protein L-beschichtete Perlen ein und inkubieren Sie für eine Stunde bei vier Grad Celsius auf einem Rohrrotator. Um die Affinitätsmatrix zu sammeln, legen Sie das Rohr für mehr als eine Minute auf den magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand.
Nehmen Sie das Rohr vom magnetischen Ständer weg und fügen Sie einen Milliliter Salzpuffer hinzu. Sanft nach oben und unten pfeifen, um die Affinitätsmatrix zu waschen und den salzarmen Puffer noch zweimal zu wiederholen. Setzen Sie die Perlen in 200 Mikroliter Salzpuffer aus, um 200 Mikroliter Affinitätsmatrix zu bilden.
Richten Sie zunächst den Gewebeschleifer so ein, dass die PTFE-Glasröhren während der Homogenisierung auf Eis gelegt werden können. Füllen Sie vier Milliliter Kaltlysepuffer in die PTFE-Glasröhren. Legen Sie die Leber auf eine Petrischale.
Verwenden Sie ein Messer, um 200 bis 500 Milligramm Leberstücke zu isolieren und in die PTFE-Glasröhren zu bewegen. Legen Sie das restliche Lebergewebe in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr und blitzen Sie in flüssigem Stickstoff ein. Homogenisieren Sie die Proben in einem motorgetriebenen Homogenisator, beginnend bei 300 U/min für mindestens fünf Schläge, um Hepatozyten von der Leberstruktur zu trennen.
Senken Sie das Glasrohr jedes Mal. Verhindern Sie die Belüftung, die eine Proteindenaturierung verursachen könnte, indem Sie den Stößel unter der Lösung halten. Dann erhöhen Sie die Geschwindigkeit auf 900 U/min, um das Lebergewebe für mindestens 12 volle Schlaganfälle vollständig zu homogenisieren.
Übertragen Sie das Lysat in beschriftete und vorgekühlte Schläuche mit jeweils nicht mehr als einem Milliliter Lysat. Um mit der Kernlyse zu beginnen, zentrifugieren Sie die Leber bei 2.000 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, und übertragen Sie dann den Überstand auf ein neues vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr auf Eis. Fügen Sie 1/9 des Überstandvolumens von 10%NP-40 in das Mikrozentrifugenrohr auf Eis ein und mischen Sie die Lösung, indem Sie das Rohr sanft invertieren.
Drehen Sie die Mikrozentrifugenrohre mit einer Minizentrifuge schnell herunter und fügen Sie 1/9 des Probenvolumens von 10%DOC hinzu. Mischen Sie die Mikrozentrifugenrohre sanft umundkehren Sie die Mikrozentrifugenrohre und tauchen Sie fünf Minuten lang auf Eis aus. Zentrifugieren Sie das Kernlysat bei 20.000 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten und übertragen Sie den Überstand auf neue vorgekühlte Mikrozentrifugenröhren auf Eis.
Nehmen Sie für jede Röhre 1% des Gesamtvolumens des Überstandes als Prä-Immunitizipationskontrolle heraus. Platzieren Sie die Vorimmunitisitier-Steuerung enden sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Rohrrotator. Achten Sie besonders darauf, die Affinitätsmatrix durch Pipettieren vorsichtig wieder aufzuhängen und dann 200 Mikroliter zu jeder Probe hinzuzufügen.
Inkubieren Sie die Lysate bei vier Grad Celsius über Nacht mit sanftem Mischen auf einem Rohrrotator. Um die RNA zu isolieren, drehen Sie die Röhren, die die Lysate in der Minizentrifuge enthalten, schnell herunter und sammeln Sie die Perlen, indem Sie sie mindestens eine Minute lang auf das magnetische Rack legen. Sammeln Sie den Überstand in zusätzlichen Mikrozentrifugenröhrchen.
Fügen Sie jedem Rohr einen Milliliter frischen Hochsalzpuffer hinzu, gefolgt von einer sanften Pipettierung mindestens fünfmal, ohne Blasen einzuschleusen. Sammeln Sie die Perlen auf dem magnetischen Ständer auf Eis für mehr als eine Minute und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Waschschritte noch viermal.
Dann entfernen Sie die Mikrozentrifugenrohre aus dem magnetischen Ständer und legen Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten auf, um sich aufzuwärmen. Setzen Sie die Perlen in 100 Mikroliter Lysepuffer mit 0,7 Mikroliter Beta-Mercaptoethanol aus, um gebundene RNA aus der Affinitätsmatrix freizusetzen. Wirbeln Sie die Rohre für mindestens fünf Sekunden bei der höchsten Geschwindigkeit und drehen Sie schnell nach unten.
Dann inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Legen Sie die Röhren mindestens eine Minute lang auf den magnetischen Ständer, sammeln Sie dann den Überstand und gehen Sie sofort zur RNA-Reinigung gemäß dem RNA-Reinigungsprotokoll im Kit über. Um eine maximale Qualität der isolierten RNA zu erreichen, führen Sie alle optionalen Schritte durch, einschließlich der DNase-Verdauung und aller RNA-Elutionsschritte, einschließlich der empfohlenen Vorwärmung des Elutionspuffers auf 60 Grad Celsius.
In dieser Studie wurden GFP-L10A-Fusion und Fah-Transgene im Rahmen eines transposonhaltigen Plasmidfallenvektors durch hydrodynamische Injektion an Lebern abgegeben. Die Entfernung von Nitisinon induzierte eine giftige Leberverletzung. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte die Koexpression des Fusionsproteins FAH und GFP-L10A und der wiederbevölkerten Hepatozyten nach zwei Wochen Leberrepopulation.
Die Ruheprobe produzierte den höchsten Ertrag an Fusionsprotein, da alle Hepatozyten GFP-L10A nach AAV8-TBG-Cre-Injektion ausdrücken. Umgekehrt war kaum rna in Wildtyp-Kontrollen nachweisbar, die nicht über das GFP-L10A-Transgen verfügten, was darauf hindeutet, dass das TRAP-Verfahren sehr spezifisch ist und einen niedrigen Hintergrund hat. Als TRAP auf Lebergewebe verwendet wurde, das mit GFP-L10A transduced Hepatozyten wieder belebt wurde, wurde reichlich hochwertige RNA erhalten.
Im Gegensatz dazu wurde über Bioanalyzer keine RNA-Spur für die Negative-Kontroll-Probe nachgewiesen. Die Gsta1-Expression wurde durch mehr als das Zehnfache bei der Wiederbesiedlung von Hepatozyten im Vergleich zu stillen Hepatozyten induziert, während mit TRAP-isolierter RNA von der Wild-Type-Maus aufgrund des Mangels an Eingangs-RNA keine Schwellenwerte für den Zyklus festgestellt wurden. Bei der Homogenisierung des Gewebes, stellen Sie sicher, dass die Stößel langsam zu bewegen, um Belüftung zu verhindern.
Nach der Isolierung der RNA können Hochdurchsatz-Sequenzierungen oder qPCR durchgeführt werden, um die Genexpression zu analysieren. Mit TRAP-seq haben wir nun eine Methode, um RNA gezielt von repopulating hepatocyten zu isolieren und die Veränderung der Genexpression während der Leberrepopulation zu analysieren. Dies ermöglicht es uns, Gene zu identifizieren, die während dieses Prozesses verändert werden, und mögliche therapeutische Ziele für die Behandlung von Leberverletzungen.
Cycloheximid und DTT, die in mehreren Puffern vorhanden sind, sind beide toxisch. Abfälle sollten gemäß den institutionellen Leitlinien gesammelt und entsorgt werden.
