Wir danken Bryan Venema und Eric Martinson für den Bau des Elektroformation Gerät. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of General Medical Sciences der National Institutes of Health (R01GM100718 zu SEG) und der National Eye Institute der National Institutes of Health (R01EY017564 zu SEG) finanziert.

1. Ablagerung von Lipiden aus organischen Lösungsmitteln: Klassische Protocol <ol><li> Entfernen von Lipiden aus der Lagerung bei -20 ° C oder -80 ° C, auf RT erwärmt. Achtung: Lipide sind extrem hygroskopisch, und viele sind empfindlich gegenüber Sauerstoff. Titelbild Lipide in trockenem Argon oder Stickstoff und in allen Schritten Minimierung der Exposition gegenüber Luft. </li><li> Wenn erforderlich, zur Aussetzung der Lipide in Chloroform oder Cyclohexan bei 1-10 mg / ml; beachten Sie, dass vom Hersteller angegebenen Konzentrationen in der Regel sind nur nominal ACHTUNG: Tragen Sie geeignete Handschuhe und andere persönliche Schutzausrüstung bei der Verwendung von organischen Lösungsmitteln.. Entfernen Sie die PPE schnell, wenn Lösungsmittel auf sie verschüttet wird, da die meisten Materialien noch durchlässig für diesen Lösungsmitteln und sie nur vorübergehenden Schutz. </li><li> Reinigen Sie beide Seiten von zwei 25 x 37,5 mm ITO beschichteten Glasplatten mit Ethanol </li><li> Mischen Sie die Lipide, um die gewünschten molaren Verhältnisse zu erreichen. Für jede 1 cm 2 der Fläche der ITO gleitet, um mit der Lippe beschichtet werdenid, mix ~ 15-20 ug Lipiden. Zum Beispiel, wenn beide 25 x 37,5 mm-Dias waren sein komplett beschichtet, würden wir verwenden in der Regel 30 ul 10 mg / ml Lipid-Mischung. Hinweis: mit 0,1 mol% Texas Red-Fluoreszenz-Bildgebung für DPPE, und siehe unten warnt vor Fluoreszenzfarbstoffe. </li><li> Überprüfen Sie, dass die ITO-beschichtete Seite der Glasscheiben nach oben durch die Messung der Oberfläche Widerstand mit einem Ohmmeter oder Multimeter. </li><li> Saugen Sie die Lipide in einem Lösungsmittel-resistent Spritze. Vorsicht: Keine Leime oder Kunststoff versehen, andere als PTFE, wenden sich bitte an das organische Lösungsmittel. </li><li> Mit der Spritze Nadel nicht ganz berühren die ITO-Oberfläche, langsam gelten die Lipid-Bewegen der Nadel hin und her über die Folie. Bedecken Sie die Oberfläche so gleichmäßig, auf der Suche nach einem &quot;Regenbogen Glanz&quot; auf der Glasoberfläche. </li><li> Legen Sie die Folien schnell unter &lt;1 Torr (1 mmHg) Vakuum für 0,5-1 Stunden zu entfernen jede Spur Lösungsmittel. Lassen Vakuum mit Edelgas. </li><li> Tragen Sie eine Silikon-Dichtung, mit einemdünne Schicht aus Silikon Vakuumfett auf beiden Seiten. Lassen Sie mindestens 5 mm von ungedeckten Rutsche an einem Ende des Schlittens ausgesetzt. </li><li> Fahren Sie direkt mit Abschnitt 4. </li></ol> 2. Kleine Liposomen-Herstellung für Controlled Dehydration <ol><li> Bereiten Sie die Lipid-Mischung wie in den Schritten 1.1 bis 1.4. </li><li> Trocknen Sie die Lipide mit einem Strom von Argon oder Stickstoff in einem 10-15 mm Durchmesser Kultur Rohr. Für kleine Mengen Lipide, ≤ 0,5 mg, kann die resultierende Folie unmittelbar, nachdem man sie unter Vakuum für 0,5-1 Stunden, um das restliche Lösungsmittel zu entfernen hydratisiert ist, weiter mit Schritt 2.5. Größere Mengen an Lipid neigen dazu, organische Lösungsmittel in einer dicken Gel abzufangen, auch unter Vakuum und sind besser durch Gefriertrocknung hergestellt; siehe Schritte 2.3-4. </li><li> Hängen Sie das getrocknete Lipid-Film in Cyclohexan, Deckel mit Argon und Dichtung mit einem Anschlag, den Schlauch in einem kalten Block und frieren bei -80 ° C für 1 Stunde Minimum. </li><li> Setzen Sie den kalten Block-und Lipid-Probe in einem Vakuumsystemder Lage zu erreichen 100mTorr. Gib Vakuum, es wird &quot;Stall&quot; bei etwa 1 Torr sublimiert als Lösungsmittel aus. Sobald Lösungsmittel wird vollständig entfernt (ca. 1 Stunde) Vakuum wird unter dieses Niveau fallen. Lösen Vakuum mit Inertgas und das Rohr abzudichten oder Hydrat sofort. </li><li> Während die Lipide unter Vakuum sind, mit Degas Flüssigkeitszufuhr Puffer Vakuum und Begasung 15-17. </li><li> Hydrate die Lipide mit entgastem Puffer bei Endkonzentration 1-10 mg / ml. Erlauben die Lipide zu Hydrat langsam. Nach 30 min-1 Std., Vortex aufzubrechen verbleibenden Klumpen. Warten Sie eine zusätzliche 0,5-1 h bis zur vollständigen Hydratation ermöglichen. Verwenden eines osmoticant, wie Sorbit oder Saccharose bis zu 200 mM, die vollständige Austrocknung in Schritten zu verhindern. </li><li> Bereiten 100-200 nm Durchmesser Liposomen durch Extrusion. Siehe Herstellerangaben Extrusion Protokoll für Details. Beachten Sie, dass der Puffer muss weniger als ~ 25 mM Ionenstärke oder spezielle Elektroformation Spannung Protokolle in Abschnitt 4 benötigt werden. </li></ol> 3.Ablagerung von Lipiden durch geregelte Dehydratisierung von Kleine Liposomen <ol><li> Achtung: Unser Protokoll erfordert Lipide in Dampf-Gleichgewicht mit gesättigten Salzlösungen für viele Stunden abgegeben werden. Wir empfehlen dringend, die Durchführung des Protokolls in einer Inertgas-Atmosphäre, mit einem Handschuhfach oder ähnliche Gehäuse. </li><li> Achtung: Bei der Herstellung von Proben, die Proteine, die vollständige Austrocknung zu vermeiden. Hydrate die Atmosphäre in einem geschlossenen Raum mit einem Becher mit warmem Wasser oder ein Ultraschallgerät basierte Luftbefeuchter. Verwenden Sie ein Hygrometer, um sicherzustellen, dass es mindestens 30% relativer Luftfeuchtigkeit. Verwenden Sorbit oder Saccharose in dem kleinen Liposomen-Puffer als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um insgesamt Austrocknung zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie eine gesättigte Salzlösung geeigneter relativer Luftfeuchtigkeit. Soll-Luftfeuchtigkeit abhängig von der Osmolarität der Vesikelherstellung. Für Zubereitungen, die mit physiologischen Osmolarität, verwenden 30-45% RH, während niedrige Osmolarität Vesikelpräparationen kann ausreichend entwässertGleichgewicht mit 75-90% RH (siehe auch Tabelle 1). </li><li> Legen Sie die gesättigte Salzlösung und überschüssige Salz in einem dicht verschließbaren Behälter mit einer inneren Regal. Gewerbe Lebensmittel Behälter für Joghurt und Müsli Arbeit sehr gut. Ersetzen Sie das Regal nach dem Befüllen, und stellen Sie sicher Fluid 5-10 mm unter dem Regal. </li><li> Saubere ITO beschichtete Objektträger, wie in Abschnitt 1. Verwenden Sie das Multimeter, um zu bestimmen, welche Seite leitend ist, und beschriften Sie die nicht-leitenden Seite mit dem Sample-Namen. </li><li> Fetten Sie beide Seiten des Silikons (USP Klasse VI) Dichtung (en) mit einem oder mehreren Löchern. </li><li> Legen Sie die Folien leitfähigen Seite nach oben auf der Bank, und wenden Sie die Silikon-Dichtung (en) zu jeder Folie, auf die Lipid angewendet werden, um sicherzustellen, gibt es mindestens 5 mm der Schieber an einem Ende mit dem Gerät verbinden Elektroformation. Glätten Sie die Dichtung, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. </li><li> Verdünnen Sie die Vesikelherstellung in eine salzarme isosmotischen Puffer auf ~ 1-2 mg / ml. Wir finden, dass eine höhere konzentrtionen zu schlechten Ergebnissen. </li><li> Bewerben Lipid mit dem Schlitten in 1-10 ul Tropfen. Kleinere Tropfen erzeugen im Allgemeinen bessere Ergebnisse. </li><li> Legen Sie die Folie auf der Innenseite Regal über der gesättigten Salzlösung und verschließen Sie den Behälter fest. Lassen Sie bei RT für 3 h auf O / N. Der Behälter kann bei 4 ° C gebracht werden, aber beachten Sie, dass für einige Salze, die RH hängt stark von der Temperatur und dem kalten wird Gleichgewichtszeit erhöhen. </li><li> Der resultierende Film kann eine leichte Regenbogen Glanz, aber in jedem Fall sollte erscheinen fast ausgetrocknet. Sehr osmotischen Eduktlösungen kann unmöglich vollständig trocknen zu einer Lipid-Film, das keinen nachteiligen Einfluss auf die Ergebnisse. </li></ol> 4. Elektroformation von Riesenliposomen <ol><li> Lipidfilme, insbesondere solche aus dehydratisierten Liposomen gebildet werden, lösen sich leicht. Vorsichtig Hydrat jeder Vertiefung, indem eine 27 G Nadel Spritze am Rand der Dichtung und langsam Aufbringen Puffer. Puffer könnensind Wasser, ≤ 200 mM Saccharose, ≤ 1 M Sorbit und ≤ 5 mM HEPES. Mehr als 10 mM Salzlösung kann verlangen alternate Elektroformation Spannung Protokolle. Überfüllsicherung jede Dichtung gut ~ 10%. </li><li> Hinweis: Sobald die Lipide sind hydratisiert, gehen schnell durch die verbleibenden Schritte, da Lipidfilmen sofort ablösen beginnen. Ertrag und Größe werden maximiert, wenn Elektroformation beginnt umgehend. </li><li> In einer fließenden Bewegung, anwenden eine zweite ITO Rutsche, leitende Gesicht, an die Spitze der Dichtung. Achten Sie darauf, mindestens 5 mm Überhang außerhalb der Dichtung an und gegenüber dem ersten Überhang haben. Drücken Sie vorsichtig, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. </li><li> Reinigen Sie die zwei Überhänge mit Ethanol und sicherstellen, dass die Dichtung zugewandten Seiten mit Ihrem leitenden Multimeter sind. </li><li> Die Kammer kann weiter mit Parafilm oder Licht Zugfeder Clips gesichert werden, falls gewünscht. </li><li> Schließen Sie das Elektroformation Kammer mit einer Spannungsquelle durch die Sicherung Aluminium oder Kupfer Bars, &quot;EMI gasket Schaum &quot;oder leitenden Klebeband an den leitenden Oberflächen der beiden Rutschen. Wir verwenden EMI-Dichtung Schaum. Pläne für eine Spannvorrichtung und Klemme sind in Abbildung 5 dargestellt. </li><li> Stellen Sie sicher, dass es keinen elektrischen Kurzschluss zwischen den Kontakten, und dass die Kontakte verbinden richtig auf die ITO Oberflächen, mit dem Multimeter. </li><li> Erhitzen der Kammer 10 ° C oberhalb der höchsten Schmelztemperatur des einen der Lipide, z. B. für DPPC, Wärme auf 52 ° C mindestens 10 ° C über der Kette Schmelztemperatur von 42 ° C. </li><li> Für salzarme Puffer, gelten eine 10 Hz Sinus, ~ 0,7 V rms für jeden Millimeter Abstand zwischen den beiden ITO beschichteten Oberflächen, für 60-90 min. Für Hochsalzpuffern sollten andere Spannung Protokolle verwendet (siehe Referenzen) werden. </li></ol> 5. Imaging und Fehlerbehebung <ol><li> Bild der Liposomen mit einem inversen Mikroskop mit einem Filter Cube für Rhodamin oder Texas Red Farbstoffe ausgestattet. Das Liposom muss kugelförmig,überwiegend unilamellar von Auge und frei von Defekten wie &quot;strings&quot; hängen von der Liposomen. </li><li> Wenn die Liposomen zu klein sind, verbrauchen weniger Lipid. </li><li> Wenn es viele Mängel oder einige Liposomen sind, kann dies darauf zurückzuführen sein, Gelphase Lipiden. Betrachten wir die Erhöhung der Temperatur Elektroformation. </li><li> Wenn wenige oder keine riesigen Liposomen überhaupt aus dehydriert kleine Liposomen, reduzieren den osmotischen Stärke der Liposomen-Puffer, oder erhöhen Sie die Stärke des osmotischen Elektroformation Puffer. Ein Einbruch von Puffer in die konzentrierte interstitielle Pufferlösung kann Ablösung des abgeschiedenen Lipid-Film. </li><li> Wenn Vesikel Ertrag, Qualität oder Größe ist schlecht, und Sie enthalten Salze oder pH-Puffer in den Elektroformation oder Liposomen Puffer, sollten alternative Elektroformation Spannung Protokolle. Zum Beispiel, Pott, et al. 11, empfehlen eine dreistufige Protokoll mit einem 500 Hz Sinus, die Erhöhung der Spannung von 50-1,300 Vpp / m in 30 min, halten für 90 min, dien Verringerung der Frequenz 50 Hz über 30-60 min. Platin oder Titan-Elektroden kann in diesem Fall nicht benötigt werden, aber dies wird nicht wesentlich verändert das Protokoll. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Elektroformation riesiger Liposomen wurde in eine flexible Technik kompatibel mit verschiedenen Lipiden, Zubereitungen und Puffer entwickelt. Eine sorgfältige Steuerung der Lipidablagerung-Verfahren ist sehr entscheidend für den Erfolg. Wir haben einfache Werkzeuge vorgestellt, um eine kontrollierte Abscheidung von Lipiden aus kleinen Liposomenzubereitungen ein einfacher Prozess zu machen. Die relative Feuchtigkeit ist für die einwandfreie Entwässerung der ersten Liposomen, und der optimale Wert wird mit der anfäng...

Riesen-Liposomen (oft als Riese einschichtigen Vesikeln oder GUVs) wurden in erster Linie verwendet, um die Physik und der physikalischen Chemie von Lipid-Doppelschichten, einschließlich Studien der Doppelschicht Verformung, seitliche Phase Koexistenz (&quot;Rafts&quot;), Membran-Fusion, etc 1-4 studieren. Sie haben einen grob Zell-Struktur: Kugelschale Membran umgibt einen wässrigen Innenraum, die leicht gemacht werden, anders als die umgebenden wässrigen Puffer werden. Sie sind per definitionem ≈ 1-100 &amp;mgr; m im Durchmesser, so dass sie abgebildet mit einer Vielzahl von Lichtmikroskopie Ansätze werden. Sie können gestrafft durch osmotischen Gradienten oder mechanisch angelegte Spannung ist, so daß, während in der Regel weich, deren Eigenschaften für die einfache Handhabung kann manipuliert werden. Insbesondere die Steuerung der &quot;Steifigkeit&quot; der Liposomen macht es einfach, &quot;Liposomen-attached&quot; oder ausgeschnitten Patches für die Elektrophysiologie zu bilden. In der Vergangenheit wurde Ionenkanal Rekonstitution weitgehend planaren Lipid b durchgeführtilayers. Jetzt macht die Fähigkeit, Patches von riesigen Liposomen zu bilden und nutzen die erheblichen Köcher von Werkzeugen für herkömmliche Elektrophysiologie entwickelt (Fluoreszenzmikroskopie Mikropipette Aspiration, schnelle Perfusion und Temperaturregelung, etc.) Riesenliposomen immer attraktiver für die Rekonstitution Studien 5,6. Riesen-Liposomen wurden von vielen Strategien vorgenommen. In der Tat bilden Riesenliposomen spontan durch eine Schwellung Prozess, wenn eine getrocknete Lipid-Film 4,7,8 rehydriert wird. Der Wunsch, schneller vorzubereiten größeren führte gleichmäßigere Liposomen Forscher zu anderen Ansätzen, Leiter unter ihnen Elektroformation 1,9. Elektroformation stützt sich auch bei der Hydratisierung eines getrockneten Lipidfilm, sondern beschleunigt das Verfahren durch die Anwendung eines oszillierenden elektrischen Feldes an die Lipid-Film. Das Feld wird durch zwei Elektroden, entweder Platindrähte oder Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichteten Glasträger aufgebracht, getrennt durch Wasser oderPuffer und auf die die Lipide werden abgeschieden. Durch die Beschleunigung der Schwellung von Liposomen erreicht man eine höhere Ausbeute an größeren Liposomen. So hat Elektroformation werden die Standardmethode zur Erzeugung Riesenliposomen 4. Der Mechanismus der Elektroformation ist nicht vollständig geklärt, und die meisten Protokolle werden empirisch (zB 10,11) entwickelt. Dennoch können wir lernen, ein wenig über das, was unter Berücksichtigung der Theorie und einige empirische Ergebnisse zu erwarten. Es wird allgemein angenommen, dass Elektroformation indem elektro-osmotischen Fluss des Puffers zwischen einzelnen Lipid-Doppelschichten in der abgeschiedenen Lipidfilm 10,11 gestapelt auftritt. Elektrostatische Kupplung Wärmewechselbeständigkeit der Lipid-Doppelschichten ist wahrscheinlich auch beteiligt 12. Diese Hypothesen qualitativ vorherzusagen Obergrenzen für das elektrische Feld der Häufigkeit und Stärke, die 10,12 verwendet werden kann. Insbesondere ist es, dass eine hohe Leitfähigkeit Lösungen vorhergesagt ( <em&gt; dh physiologischen Salzlösungen) reduzieren die elektrohydrodynamische Kräfte, initiieren das Liposom Elektroformation 12. Mai. Elektroosmotischer Strömungsgeschwindigkeiten in der Regel mit steigender Salzkonzentration zu verringern und werden häufig zu einem bestimmten elektrischen Feldes Schwingungsfrequenz (zB wenn auch in einer anderen Geometrie, Green et al. 13) ihren Höhepunkt. Somit sind höhere Feldstärken und höhere Frequenzen für hohe Leitfähigkeit Lösungen vernünftig, innerhalb der Grenzen 10. Allerdings sind Membranproteine ​​wahrscheinlich mit dem üblichen Verfahren zum Abscheiden Lipide auf Elektroden für die Electroswelling Verfahren, nämlich in organischen Lösungsmitteln, die anschließend an einen dünnen Lipidfilm zu hinterlassen eingedampft unvereinbar. Es gibt zwei grundsätzliche Wege um diese Schwierigkeit: an Proteine ​​nach giant Liposombildung enthalten oder anzupassen, wie die Lipide abgeschieden werden. Unser Ansatz baut auf andere 5,11 die Lipide und Rekonstitution hinterlegentuierten Membranprotein zusammen aus einer Suspension von kleinen oder großen &quot;Proteoliposomen&quot;. Wir beschreiben die langwierige und schwieriger Prozess der Herstellung von Proteoliposomen gereinigtes Protein und Lipiden an anderer Stelle (Collins und Gordon, in review). Hier beschreiben wir das Protokoll in Ermangelung einer Protein, aber es ist das gleiche, wenn Protein eingebaut wird, wir zählen die Ergebnisse zeigen, dass Proteoliposomen mit dem Ionenkanal TRPV1 in GUVs umgewandelt werden kann und für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie. In jedem Elektroformation Ansatz, ist die visuelle Inspektion der Lipid-Probe während der Lipidablagerung Prozess entscheidend für den Erfolg. Unser Ansatz relevant sein können über die spezielle Anwendung zu Ionenkanal Rekonstitution. In der Zeit, da wir zuerst dieses Protokoll entwickelt und jetzt, es hat sich auch gezeigt, wie die Art und Weise, in der Lipide auf Elektroden für Elektroformation abgelagert werden die kompositorische Heterogenität der resultierenden GUVs betrifft. Baykal-Caglar et al. zeigten, dass 14 GUVs aus sorgfältig entwässert gebildeten Liposomen eine 2,5 mal kleiner Variation hatte in der Mischungslücke Sprungtemperatur von GUVs aus Mischungen verschiedener Phospholipide und Cholesterin gebildet. Die Arbeit zeigt, dass Lipide und insbesondere Cholesterin, ausfallen kann aus dem Lipidgemisch wenn aus organischen Lösungsmitteln aufgebracht, was zu großen räumlichen Abweichung in der Zusammensetzung der abgeschiedenen Lipidfilm. Dies ist besonders wichtig für die Untersuchung der Lipid-Membran Phasenverhalten, kann aber auch kritisch für quantitative Experimente Ionenkanalfunktion. Baykal-Caglar et al. &#39;S Protokoll ist ähnlich, aber nicht identisch mit unserer eigenen, und die Leser werden ermutigt, es so gut zu studieren. Dieses Protokoll (siehe Übersicht, Abbildung 1) ist eine von vielen, die genutzt werden könnten. Im Prinzip Elektroformation Erfolg hängt von der Lipid-Mischung, Flüssigkeitszufuhr, Temperatur, andere gelöste Stoffe (vor allem Ionen), und derNatürlich ist die Spannung und Frequenz in Bildung eingesetzt. Wie Elektroformation wird besser verstanden, erwarten wir unser Protokoll mehr zu suchen. Schließlich gibt es oft eine steile Lernkurve in Galvanotechnik Riese Liposomen. Wir schlagen vor, die Beherrschung der herkömmlichen Protokoll (§ § 1 und 4, und, falls erforderlich, Abschnitt 5) vor dem Lernen zu Lipiden aus liposomalen Suspensionen (§ § 2-5) zu hinterlegen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>U1232A or similar</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>117 or 177</td>
			<td>Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td>
			<td>33210A or similar</td>
			<td>Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 &Omega; load</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td>
			<td>CB-90IN-S107 or similar</td>
			<td>Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a></td>
			<td>CNi3233 or similar</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td>
			<td>445815</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber sheet</td>
			<td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td>
			<td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td>
			<td>Use USP Grade VI silicone for its high purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMI gasket</td>
			<td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td>
			<td>4202-PA-51H-01800 or similar</td>
			<td>Distributed by Mouser <a href="http://www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TxR-DHPE</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td>
			<td>T1395MP</td>
			<td>Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td>
			<td>850457P or 850457C</td>
			<td>Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034P/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8667</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology

Die Rekonstitution von Ionenkanälen in chemisch definierten Lipidmembranen für elektrophysiologische Aufzeichnung wurde eine leistungsfähige Technik zu identifizieren und erkunden Sie die Funktion dieser wichtigen Proteinen. Jedoch begrenzen klassischen Zubereitungen, wie planare Doppelschichten, die Manipulationen und Experimente, die auf dem rekonstituierten Kanal und seine Membran Umgebung ausgeführt werden können. Je mehr Zellen Struktur von Riesenliposomen ermöglicht traditionelle Patch-Clamp-Experimente ohne Steuerung des Lipidumgebung. Elektroformation ist ein effizientes Mittel zur Erzeugung Riesenliposomen&gt; 10 um im Durchmesser, die auf der Anwendung von Wechselspannung in eine dünne, geordnete Lipid Film, der auf einer Elektrodenoberfläche beruht. Da jedoch die klassische Protokoll fordert der Lipide aus organischen Lösungsmitteln aufgebracht werden, ist es nicht mit weniger robust Membranproteine ​​wie Ionenkanäle und modifiziert werden muss. Kürzlich protocols wurden entwickelt, um Riesenliposomen von partiell dehydratisierten kleinen Liposomen, die wir Protein-haltigen Liposomen in unserem Labor angepasst haben Elektroform. Wir stellen Ihnen hier den Hintergrund, Ausrüstung, Techniken und Fallstricke Elektroformation riesiger Liposomen aus kleinen Liposomendispersionen. Wir beginnen mit dem klassischen Protokoll, das erste sollte, bevor die größere Herausforderung Protokolle, die gemeistert werden folgen. Wir zeigen den Prozess der kontrollierten teilweisen Wasserentzug aus kleinen Liposomen mit Dampf-Gleichgewicht mit gesättigten Salzlösungen. Schließlich zeigen wir den Prozess der Elektroformation sich. Wir beschreiben einfache, kostengünstige Geräte, die in-house gemacht werden können, um qualitativ hochwertige Liposomen zu produzieren, und beschreiben Sichtprüfung der Vorbereitung auf jeder Stufe, um die besten Ergebnisse zu erzielen.

In unseren Beispielen bereiten wir Liposomen aus einem Gemisch von etwa 55 Mol-% POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphocholin), 15 mol% erscheint (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-Phosphoserin , 30 mol% Cholesterin und 0,1 mol% Texas Red-markierten 1,2-dipalmitoyl-sn-Phosphoethanolamin (TxR-DPPE). Diese Zusammensetzung wie etwa Vertreter der Spinalganglien Lipide 18 gewählt wurde. Wir bemerken, dass 15 mol% geladen Lipid (hier POPS) ist in der Nähe der Grenze dessen, was in ...

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Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Reconstituting funktionellen Membranproteinen in riesige Liposomen definierter Zusammensetzung ist ein leistungsfähiges Konzept, wenn es mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie kombiniert. Dagegen dürfen herkömmliche Riese Liposomen Produktion unvereinbar mit Proteinstabilität. Wir beschreiben Protokolle zur Herstellung Riese Liposomen aus reinem Lipide oder kleine Liposomen, die Ionenkanäle.

Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

giant-liposome-preparation-for-imaging-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K Aufrufe.  University of Washington. Reconstituting funktionellen Membranproteinen in riesige Liposomen definierter Zusammensetzung ist ein leistungsfähiges Konzept, wenn es mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie kombiniert. Dagegen dürfen herkömmliche Riese Liposomen Produktion unvereinbar mit Proteinstabilität. Wir beschreiben Protokolle zur Herstellung Riese Liposomen aus reinem Lipide oder kleine Liposomen, die Ionenkanäle.

Serie: Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Methoden für die Patch-Clamp Kapazität Recordings aus dem Kelch

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Forschung

Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Herstellung künstlicher Doppelschichten für Elektrophysiologie Experimente

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elektrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploring arteriellen glatten Muskelzellen KV7 Kalium Kanal Funktion mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck Myographie

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...