Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Welch Foundation (I-1657) und der NIH (RO1EY18884) unterstützt. PRH ist ein Eugene McDermott Scholar in Biomedical Research.

1. Einführung In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie Drosophila Gehirn und Netzhaut für Live-Imaging-und Immunhistochemie mit einem Fokus auf Sehzellen vorzubereiten. Zunächst werden wir zeigen, wie man für die Gehirnentwicklung Dissektionen vorzubereiten. Als nächstes werden wir zeigen zwei grundlegende Dissektionen häufig für die Immunhistochemie verwendet, die die Grundlage für die Live-Vorbereitungen zu bilden. Diese beiden Präparate sind im erwachsenen Gehirn und Auge Dissektionen. Als nächstes werden wir die Sektionen für die Live-Darstellung von den Erwachsenen und sich entwickelnde Gehirn mit Schwerpunkt auf ihre Verwendung für die Live-Darstellung von Photorezeptoren verwendet. Schließlich werden wir beschreiben, wie wir Bild lebendem Gewebe und zeigen einige Beispiele von Live-Bildgebung mit resonant konfokalen Mikroskopie. 2. Dissection Vorbereitung <ol><li> Für eine gute Dissektionen, müssen Sie scharfe Zange. Mit einer Verschärfung blockieren oder sehr feinen Schleifpapier (&gt; 1500), sanft passieren die Zange hin und her auf jeder Seite, bis die Enden mit einer feinen Spitze zu erfüllen. Wir verwenden eine Standard-Schleifstein. Wir werden nicht für die Schleiftechnik hier, aber beachten Sie, dass scharfe Zange wichtig für Live-Dissektionen sind. Wir schärfen Pinzette vor jeder Sektion. </li><li> Für erwachsene Gehirn Dissektionen, statt die Fliegen auf einen CO 2-Pad, um sie zu betäuben und sortieren die gewünschten Genotyp. Für Puppenstadium Dissektionen, einfach in die Flasche gelangen und entfernen Sie vorsichtig eine Puppe mit einer Pinzette, wobei darauf zu vermeiden, bricht der Puppenhülle. </li><li> Befeuchten Sie ein Kimwipe mit Wasser. Sie werden diese während der Präparation zu verwenden, um Schmutz von Ihrem Pinzette entfernen. Position einem Seziertisch Gericht auf der Bühne ein Stereoskop und füllen es mit HL3 Lösung 1. Alle Sektionen werden in HL3 durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das Gewebe am Leben und gesund während der Dissektion Verfahren bleibt. Auch verwenden wir eine Dissektion Gericht, dass ein Bodenbelag der Sylgard zu Zange während der Präparation zu schützen. </li><li> Jetzt bereiten Fixierlösung, wenn Sie Immunhistochemie durchführen möchten. Legen Sie 180μL der HL3 in eine 500μL Mikrozentrifugenröhrchen. Add 20 &amp;mgr; l von 37% Formaldehyd zu einem 3,7% igen Formaldehyd-Lösung zu erhalten. </li><li> Schließlich ist die richtige Handhaltung für gute Dissektionen wichtig. Mit einer guten Handhaltung, wird Ihr Pinzette werden stetig und in der Lage kontrollierte, subtile Bewegungen. Zuerst legen Sie die Zange an der Seite des Daumens. Dann bringen Sie den Zeigefinger senkrecht nach unten, so dass die Spitze des Fingers auf der Oberseite liegt. Nun ruhen die Seite der Pinzette auf der Seite des Mittelfingers und Umzug in die Dissektion Gericht. Machen Sie physischen Kontakt mit dem Gericht mit Daumen und Mittelfinger. Bei einer Rast mit Daumen und Mittelfinger auf den Teller, Pflanze Handgelenk auf dem Mikroskoptisch. Auf diese Weise haben Sie drei Punkte fest auf Oberflächen während der Präparation und es ist jetzt möglich, sehr subtile Manipulationen der Zange zu machen. Diese Technik kann sich ein wenig umständlich auf den ersten, aber mit etwas Übung werden Sie bald ein Meister des Gehirns Dissektionen werden. </li></ol> 3. Adulten Gehirn <ol><li> Auf der CO 2-Pad, fliegen orientieren eines Erwachsenen Bauchseite mit dem Kopf weg von deiner Hand. Besorgen Sie sich die Thorax unterhalb des Kopfes. Wenn man es richtig macht, wird der Beine und Rüssel zu verlängern. Beim Betrachten unter einem Stereoskop, greifen die erweiterten Rüssel mit einer Pinzette auf den Kopf zu entfernen. Entsorgen Sie den Körper und tauchen den Kopf. Neuausrichtung auf den untergetauchten Kopf. Die gesamte Präparation wird unter Lösung durchgeführt werden. Es ist sehr wichtig, auf den Kopf mit einer Pinzette zu allen Zeiten zu halten. Andernfalls wird der Kopf schweben und ist schwer zu holen. Wenn der Kopf bewegt sich außerhalb des Fokus während der Dissektion, verschieben Sie diese einfach zurück in die Brennebene ohne Anpassung des Mikroskops. Diese scheinbar einfache Aufgabe kann am Anfang schwierig, aber halten Sie Ihren Kopf in Schwerpunkt wird einfacher geworden im Laufe der Zeit. </li><li> Beginnen Sie mit der Präparation, indem Sie zuerst reißt das Bindegewebe zwischen den Rüssel und das Auge. Reißen durch das Auge, während Sie fest mit mindestens einer Pinzette zu allen Zeiten. Seien Sie sicher, dass die Zehen der Zange nur knapp unter der Netzhaut oder die Nagelhaut, um eine Beschädigung des Gehirns darunter. Abwechselnd links und rechts, nutzen Sie Ihre Zange zu entreißen der Netzhaut, arbeiten gegen die Rückseite des Kopfes. Abreißen der Netzhaut wird die Chancen erhöhen, dass die Lamina an der optic lobe in diesem Dissektion bleibt. Weiter um die Rückseite des Kopfes, Reißen Nagelhaut auf dem Weg. Fegen Sie durch das andere Auge und beginnen Anfahren Nagelhaut. Solange Sie greifen Nagelhaut sind, wissen Sie, Sie sind nicht Zerkleinern des Gehirns! In diesem Sinne, weiterhin Kutikula und Netzhaut weg ziehen, bis das Gehirn wird aufgedeckt. </li><li> Sobald das Gehirn sichtbar ist, können Sie damit beginnen, entfernen Luftröhre des Gehirns (Abb. 1A) befestigt. Weiter auf Luftröhre und Nagelhaut ziehen, bis das Gehirn isoliert. An dieser Stelle sollten Sie auf den Boden der Schüssel für t Neuausrichtunger verbleibenden Schritte. Entfernen Sie die restlichen Luftröhre, weil Ihr Gehirn kann nicht anders während der Nacht Antikörper wäscht schweben. Für die Bildgebung der Photorezeptor-Terminals, ist es wünschenswert, die Lamina zu halten, aber Sie müssen auf die Netzhaut, die den Zellkörper und stark autofluoreszierenden Pigment enthält zu entfernen. Um dies zu tun, genau auf den buschigen und pigmentierte Zellen bleibt zu ziehen, ohne Beschädigung der Lamina. Dies ist eine feinere Geschick und Übung braucht. </li><li> Das erwachsene Gehirn am Leben gehalten für Stunden oder sogar Tage mit Bedingungen, die wir in Abschnitt 6 erörtert wird. Für die Immunhistochemie, ist das erwachsene Gehirn nun behoben werden in Formaldehyd. 2 Verwenden Sie ein P20 pipetteman eingestellt 5μL im erwachsenen Gehirn die Festsetzung Lösung, die Sie bereits erstellt haben, bewegen. Weiter Sezieren erwachsenen Gehirn für 20 Minuten, die Muß 4-10 Gehirn liefern. Lassen Sie den Kopf in Fix für weitere 40 Minuten, aber dieser Zeitraum kann für eine optimale primäre Antikörper-Färbung variieren. Entfernen Sie die Formaldehyd-Lösung und wäscht die Gehirne 3 mal für jeweils 5 Minuten in 400μL einer Lösung mit PBS und 0,4% TritonX-100, im Folgenden als PBS-Triton bezeichnet. Nach dem vollständigen Auswaschen der fix-Lösung, können Sie fügen primärer Antikörper-Lösung. </li></ol> 4. Adult Auge <ol><li> Beginnen Sie mit dieser Präparation wie bei den erwachsenen Gehirn beschrieben. Nach Eintauchen des Kopfes und Neuausrichtung des Mikroskops, durch Abreißen des Bindegewebes zwischen den Rüssel und das Auge zu starten. Oberhalb des Rüssels, trennen Sie die Nagelhaut aus dem Auge. Nun, trennen Sie die Nagelhaut von der Unterseite des Auges, arbeiten gegen die Rückseite des Kopfes. Mit einer Pinzette greifen die Mitte der Rückseite des Kopfes. Bei den anderen, greifen das Auge und ziehen. Lassen Sie den Blick auf den Boden der Schale absetzen (Abb. 1B). Die Lamina wird wahrscheinlich immer noch für das Auge angebracht werden und kann für die Live-Darstellung der Klemmen vollständig intakt Sehzellen zu diesem Zeitpunkt verwendet werden. Um weiterhin mit Live-Darstellung von Photorezeptor Zellkörper, Abschnitt 4.5 zu gehen. Die nächsten drei Abschnitte erläutern festen Auge Immunhistochemie. </li><li> Für die Immunhistochemie, bewegen Sie den Blick auf Fixierlösung mit einem P20 pipetteman eingestellt 5μL. Weiter Sezieren erwachsenen Augen für insgesamt 10 Minuten. Lassen Sie die Augen in fix für weitere 30 Minuten. Entfernen Sie das Update-Lösung und Verhalten wäscht als im erwachsenen Gehirn Dissektion beschrieben. </li><li> Wenn Sie schließlich wollen Image der ommatidial Struktur des Auges der Lamina muss jetzt entfernt werden. Liefert die feste Augen zu Ihrem Sezieren Schüssel und entfernen Sie alle Luftröhre oder Fettzellen, die möglicherweise noch angebracht. Als nächstes, während die Außenseite des Auges mit einer Pinzette entfernen der Lamina mit den anderen. Es sollte kommen, in einem Stück, Freilegung der cellbodies darunter (Abb. 1B). Achten Sie darauf, die Lamina nur zuschlagen! Andernfalls riskieren Sie, Ablösen der Photorezeptoren der Netzhaut. </li><li> Mit einem P20 pipetteman bewegen sich die Augen zu 400uL PBS-Triton in einem 500 ul Röhre. Schütteln Sie sie bei 4 Grad über Nacht auf die autofluoreszierenden rote Pigment von den Photorezeptoren zu entfernen. Am folgenden Tag können Sie verwerfen die Waschlösung und fügen primärer Antikörper-Lösung. </li><li> Für die Live-Darstellung von erwachsenen Augen verwenden wir nur pharate erwachsenen Fliegen, also spät Puppen kurz vor Schlüpfen. In diesem Stadium der Photorezeptor Zellkörper getrennt von Terminals in der Lamina während der Präparation. </li><li> Pharate erwachsenen Puppen haben klar definierte Flügel, Augen und Nagelhaut sichtbar durch die Puppenhülle. Wählen Sie eine Puppe, und entfernen Sie den vorderen Teil der Puppenhülle der Kopfbereich aussetzen. Entfernen Sie vorsichtig die dünne innere Membran, die zusätzlich umschließt den Entwicklungsländern zu fliegen. Besorgen Sie sich die Unterseite des Kopfes mit einer Pinzette und ziehen. Entsorgen Sie den Rest der Puppe und dabei den Kopf unter Wasser. </li><li> Gehen Sie wie im Auge dissection für die Immunhistochemie nachgewiesen. Am pharate erwachsenen Stadium, jedoch wird der Photorezeptor Zellkörper leichter lösen aus der Lamina, so dass Sie Bild der Zellkörper in die Netzhaut eingebettet. Auch bleibt die Lamina an der optic lobe, so dass Sie Bild der distalen Lamina. Wenn Sie zum Bild der proximalen Lamina, wo die Photorezeptor-Terminal Patronen sehen kann wollen, führen Sie dann das Auge Dissektion auf einen Erwachsenen fliegen, wo die Lamina stärker auf das Auge verbunden ist. </li></ol> 5. Entwickeln Auge Disc-Hirn-Komplexe <ol><li> Die Entwicklung von Auge Scheibe bei 20% Puppenstadium Entwicklung (P +20%) hat sich zu einem Favoriten für Live-Aufnahmen in unserem Labor, weil diese eine Schicht von relativ großen entwickelnden Zellen leichter zu beobachten ist mit der konfokalen Mikroskopie. 3 </li><li> So wählen Sie einen 20% Puppe, für die Malpighischen Gefäße, einen grünen Punkt der erscheint unter dem Puppenstadium Fall aussehen, und vermeiden Sie Puppen, die eine &quot;dunkle Stelle&quot; 4 haben. Nach Auswahl einer P +20% Puppe, tauchen Sie es in HL3 in Ihrem Sezieren Teller und entfernen Sie vorsichtig eine vordere Teil des Puppenstadium Sack, wobei darauf geachtetnicht zu durchdringen die dünne innere Membran. Fassen Sie die innere Membran mit einer Pinzette und auseinanderziehen. </li><li> Vorsichtig durch die freigesetzten Inhaltsstoffe Suche auf das sich entwickelnde Gehirn und Auge-Discs, die ganz prominenten (Abb. 1C) zu finden. Das Auge Disc-Hirn-Komplex ist einfach in diesem Stadium der Metamorphose getrennt. Isolieren des Gehirns auf den Boden des Sezieren Gericht. Sorgfältig trennen die zentrale Gehirn von der Optik Lappen. Die Optik lobe / Auge Festplatte wird in Live-Bildgebung verwendet werden. </li></ol> 6. Live-Imaging: An dem Mikroskop <ol><li> Wenn Sie auf die Grafik für eine kurze Zeit in nur ein oder zwei Lösungen wünschen, können Sie Ihr Bild Gewebes auf einem Objektträger aus Glas. In diesem Fall bereiten die Folie, indem Sie zunächst die Beschichtung der Oberfläche mit Sylgard mit den Anweisungen des Herstellers. Legen Sie 20 &amp;mgr; l HL3 in der Mitte des Schlittens. Transportieren Sie Ihren seziert Gewebe in 20 weiteren ul HL3 auf die Folie. Das Gewebe darf NIEMALS an der Luft ausgesetzt werden. Darüber hinaus muss jede Belastung oder Stress aus Pipetten-Handling oder der Lösung Oberflächenspannung vermieden werden. </li><li> Für Live-Bildgebung, muss das Gewebe fest mit minimalem Handling und Kontakt gesichert werden. Wir sicher zu positionieren das Gehirn mit dem Wasser-Polymerisation chirurgische Kleber GluShield durch eine Mikroelektrode aufgetragen, eine Technik, die routinemäßig für embryonale Präparate für die Elektrophysiologie 5 verwendet. Besorgen Sie sich eine Glaselektrode, wie sie für elektrophysiologischen Ableitungen gezogen. Brechen Sie die Spitze und füllen Sie das Ende mit GluShield mit Unterdruck durch den Mund erzeugt. Brechen Sie nur genug von der Elektrode, Leim eindringen können. Verwenden Sie nun positive Druck, eine kleine Menge Leim auf die Sylgard gelten unter einem Rückgang von HL3. Jetzt schnell die Gewebe auf den Leim, die Aufrechterhaltung der gewünschten Orientierung für die Live-Bildgebung. Ein Wasser-Immersions-Objektiv kann nun für die Bildgebung verwendet werden. Wenn Sie eine durchlässige Membran Farbstoff hinzufügen möchten, können Sie es in das Bad während Bildgebung hinzuzufügen. </li><li> Wir verwenden ein Resonant konfokalen Mikroskop, die eine schnelle Bildgebung ermöglicht mit reduzierter Ausbleichen. 6 Für die Bildgebung über lange Zeiträume oder zum Austausch von Lösungen ganz oder mehrfach verwenden wir eine Perfusionskammer (Harvard IC30 konfokale Bildgebung Kammer), die zu einer Schlauchpumpe verbindet die langsam perfundiert Kultur-Lösung über die Live-Gewebe (Abb. 2A). Die Bewegung der Flüssigkeit konstant Austausch und minimal GluShield Kontakt reduzieren die Abflachung des Gewebes, das über längere Zeiträume Zeit 7 beobachtet wurde. Beachten Sie, dass für die Abbildung von Entwicklungsprozessen Zeiträume, das Auge Disc-Hirn-Komplex intakt bleiben und sollten minimal Kontakt mit dem Kleber haben muss. </li><li> Verwenden Sie ein Deckglas mit einem Tropfen Sylgard, dass rasiert um es dünn und flach beschichtet ist. Dispense 20 &amp;mgr; l HL3 auf die Mitte des Deckglases und kleben Sie die lebendes Gewebe, die Sylgard. Generieren Sie eine Dichtung, die damit entstehende Blasen durch die Kammer, ohne dass die lebendes Gewebe in die Luft (Abb. 2B) pass wird. Die Dichtung sollte dick genug sein, um zu vermeiden Zerkleinerung des Gewebes, aber dünn genug, um das Gewebe in der Nähe des konfokalen Mikroskop-Objektiv zu bringen, wir nutzen 250μm in unserer Einrichtung. Montieren Sie die Perfusionskammer, wobei darauf geachtet, um das Gewebe vollständig zu jeder Zeit unter Wasser zu halten. Begin Perfusion zunächst mit einer Rate nahe 100 &amp;mgr; pro Minute mit einer Schlauchpumpe. Diese Geschwindigkeit ist relativ schnell in Abhängigkeit von der Dichtungsdicke, dass die Kammer Höhe definiert. Für die Bildgebung in der Größenordnung von Stunden, müssen Sie 20-hydroxyecdysone und Antibiotika, aber nicht antimykotische hinzufügen, und führen Sie Perfusion bei viel niedrigeren Geschwindigkeiten um 10 &amp;mgr; l pro Minute. Schließlich haben wir Blase Sauerstoff in das Kulturmedium, dass die Perfusionskammer liefert. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Am Ende unserer Video-Protokoll zeigen wir ein Beispiel für Live-Bildgebung bei der Entwicklung von Sehzellen mit der Vorbereitung in Abschnitt 5 vorgestellt. Diese Vorbereitung nutzt Drosophila Transgenese, Zell-spezifisch ausdrücken fluoreszierenden Reporter. Die Membran-tagged myrRFP und der endosomalen Marker 2xFYVE-GFP 9: In dem gezeigten Beispiel sind zwei fluoreszierenden Reporter unter Kontrolle der Photorezeptor-spezifischen GMR-Gal4-Treiber 8 geäußert. Zwei-Kanal-3D-Datensätzen mit einem Begrenzungsrahmen 70x70x17.5μm und eine Voxelgröße von 137x137x700nm (512x512x26) wurden jeweils 1 min erreicht. Der Film zeigt einen ausgewählten Ebene im Laufe der Zeit in diesem 4D Datenmenge, die Dynamik der intrazellulären endosomalen Menschenhandel und Vesikelfusion Ereignisse enthüllt. Repräsentative Bilder für feste Gewebe Vorbereitungen des Auges und der Lamina sind in Abb.. 3.

<ol>
	<li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions.">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li><li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system.">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li><li>Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+lobe+development.">Optic lobe development.</a> Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+-+A+Laboratory+Handbook.">Drosophila - A Laboratory Handbook.</a> , (2005).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching.">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69, 689-692 (2006).</li><li>Ayaz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87 (4), 651-660 (1996).</li><li>Wucherpfennig, T., Wilsch-Brauninger, M., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Drosophila+Rab5+during+endosomal+trafficking+at+the+synapse+and+evoked+neurotransmitter+release.">Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release.</a> J Cell Biol. 161, 609-624 (2003).</li><li>Merzlyak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=monomeric+red+fluorescent+protein+with+an+extended+fluorescence+lifetime.">monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime.</a> Nat Methods. 4 (7), 555-557 (2007).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36 (3), 463-474 (2002).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Cooper, M. T., Bray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frizzled+regulation+of+Notch+signalling+polarizes+cell+fate+in+the+Drosophila+eye.">Frizzled regulation of Notch signalling polarizes cell fate in the Drosophila eye.</a> Nature. 397 (6719), 526-530 (1999).</li><li>Cook, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+subtype+specification:+from+flies+to+humans.">Photoreceptor subtype specification: from flies to humans.</a> Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).</li><li>Gurskaya, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaoptin,+a+cell+surface+glycoprotein+required+for+Drosophila+photoreceptor+cell+morphogenesis,+contains+a+repeat+motif+found+in+yeast+and+human.">Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human.</a> Cell. 52 (2), 291-301 (1988).</li><li>Richardt, A., Rybak, J., Stortkuhl, K. F., Meinertzhagen, I. A., Hovemann, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebony+protein+in+the+Drosophila+nervous+system:+optic+neuropile+expression+in+glial+cells.">Ebony protein in the Drosophila nervous system: optic neuropile expression in glial cells.</a> J Comp Neurol. 452 (1), 93-102 (2002).</li><li>Beronja, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+function+of+Drosophila+Sec6+in+apical+exocytosis+of+epithelial+photoreceptor+cells.">Essential function of Drosophila Sec6 in apical exocytosis of epithelial photoreceptor cells.</a> J Cell Biol. 169 (4), 635-646 (2005).</li><li>Mehta, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Drosophila+sec15+reveal+a+function+in+neuronal+targeting+for+a+subset+of+exocyst+components.">Mutations in Drosophila sec15 reveal a function in neuronal targeting for a subset of exocyst components.</a> Neuron. 46 (2), 219-232 (2005).</li></ol>

Fluorescent Probes for Imaging Gebrauchte Hier beschreiben wir die Stärken und Schwächen der Drosophila visuelle System Vorbereitung für eine Auswahl von fluoreszierenden Sonden aus drei Klassen: (1) Probes, die ein lebendiges Gewebe Vorbereitung exogen aufgenommen werden, (2) fluoreszierende Proteine, die genetisch für Live-und kodiert sind feste Bildgebung, (3) Fluoreszenzfarbstoffen, die fixierten Gewebe für Immunhistochemie hinzugefügt werden. 1. Exogene Sonden: LysoTracker Grüne DND-26 oder Red DND-99 (Invitrogen, Inc.) Diese sind im Handel erhältlich fluoreszierenden membranpermeabel Verbindungen, die in stark angesäuert Fächer in der Zelle, allen voran Lysosomen ansammeln, späten Endosomen und Autophagosomen. LysoTracker bei nanomolaren Konzentrationen (wir verwenden in der Regel 50 nM) dringt in die L3 und P +20% Auge Disc voll in weniger als einer Minute. Da LysoTracker kontinuierlich sammelt und übt eine basische Wirkung, wir Bild in weniger als 5 Minuten. Im Gegensatz zu den Augen-Discs nicht LysoTracker nicht durchdringen das Gehirn ohne Unterbrechung des Gewebes. Allerdings ermöglicht eine sorgfältige Reißen der äußeren Membran das Eindringen von ein paar Zelldurchmesser in der Optik Lappen. Lysosensor DND-189 (Invitrogen, Inc.) Im Gegensatz zu LysoTracker, Lysosensor nicht in angesäuert Fächer anzuhäufen, sondern weist eine erhöhte Fluoreszenz bei sauren pH-Wert. Lysosensor hat Eindringen Eigenschaften, die sehr ähnlich LysoTracker sind. Wir verwenden Lysosensor bei einer Konzentration von 1 &amp;mgr;. 2. Genetisch kodierte Sonden: Für viele Live-Imaging-Experimente, drücken wir Gene, die mit verschiedenen fluoreszierenden Molekülen wie GFP, TagRFP 10 oder den pH-sensitive pHluorin 11 unter Steuerung des binären Gal4/UAS Ausdruck System 12 markiert. Gal4-Linien, die bei der Entwicklung von Photorezeptoren ausdrückliche gehören GMR-Gal4 (alle Photorezeptoren) 8 und mDelta0.5-Gal4 (Entwicklung von R4 und R7) 13. Mehrere Subtyp-spezifischen Gal4-Fahrer Linien bestehen, dass die Verwendung unterschiedlicher Rhodopsin Promotoren 14. Besonders nützlich Fluoreszenzsonden in Live-Aufnahmen sind Photokonvertierbare Proteine. Wir haben erfolgreich Dendra2, ein monomeres Grün-Rot-photoconvertable Protein 15 verwendet. Beachten Sie, dass Dendra2 ausgelegt ist, werden Photokonvertierbare mit einem 488nm Argon Laser-Linie. Wir sind jedoch nicht zur Umkehr zu erreichen mit sichtbarem blauen Licht mit unserem Set-up in entweder konventionell oder resonant konfokalen Scanning-Modus. Im Gegensatz dazu ist die Umwandlung mit 405nm UV-Laser effizienter. 3. Immunhistochemie: Für die feste erwachsenen Auge haben wir oft die Wahl zwischen Rhodamin-Phalloidin (Invitrogen, Inc.) oder anti-Chaoptin (a Photorezeptor-spezifischen Antikörpers 16) zu rhabdomeric Struktur (Abb. 1A) zu visualisieren. Eine gute Möglichkeit, Lamina Patrone Struktur zu analysieren ist, anti-chaoptin 16, der Glia-Marker anti-Ebenholz 17 und anti-sec6 18 (Abb. 1B) zu kombinieren. Wie in Abb.. 3, zeichnet sich diese Kombination aus Antikörpern, die großen präsynaptischen (chaoptin) und postsynaptische (sec6) Prozesse sowie epithelialen Gliazellen (schwarz) in der Lamina 19. Montage der Perfusionskammer Für Live-Bildgebung, beschäftigen wir eine Perfusionskammer, dass langsame Austausch von Lösungen ermöglicht, ohne die Gewebe Vorbereitung. Eine Demonstration von Perfusionskammer Montage ist in dem Video enthalten und schematisch in Abbildung 2 dargestellt. Versammlung der Perfusionskammer ist in Abb. dargestellt. 2A. Beginnen Sie mit dem Verlegen der Dichtung über die Probe zuerst, und dann mit der Montage weiterhin wie dargestellt. Der Zweck der Dichtung ist es, einen Raum zwischen den Boden der Kammer und der Deckel, ein Raum, in dem das Gewebe versiegelt und wird durch die Lösung fließen zu schaffen. Der Raum im Inneren der Dichtung muss der Einlass (Lösung tritt hier), das Gewebe prep, und der Ausgang durch die die Lösung verlässt die Kammer. Zwei Merkmale der Dichtung sind entscheidend: Erstens, die Dichtung muss dick genug sein für das Gehirn noch dünn genug, um Bildgebung mit einem hochauflösenden Objektiv zulassen. Die ideale Dichtungsdicke hängt am Set-up-Parameter. Zweitens bietet eine Kerbe in die Dichtung ein Fach, dass eine Blase passieren ohne Berührung der Probe (Abb. 2B) ermöglicht. Imaging am Mikroskop Wir verwenden ein 63x (Blende 1,3) Glycerin Immersionslinse für die Perfusionskammer oder 63x Wasser Immersionslinse direkt in das Kulturmedium auf einer Folie. Glycerine Objektive bieten mehr Arbeitsabstand als Öl-Objektiven. Wir verwenden eine Resonanz konfokalen Mikroskop, das mit einer wesentlich höheren Preisen als bei einem herkömmlichen Scanner (8000 Hz im Vergleich zu 1400 Hz, jeweils) scannt. Resonant Scanning ermöglicht die 3-dimensionale Aufnahmen im Laufe der Zeit bei schnellener Bildraten. Darüber hinaus schnellere Scan-Geschwindigkeit deutlich reduzieren Laser Phototoxizität 6, die ein wichtiges Anliegen für wiederholte Scans von lebendem Gewebe ist. Ein Gleichgewicht der Laserintensität und PMT-Spannung (Gewinn) muss erreicht werden, um Signal zu maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der Lärm-und Bleichen werden. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass die Höhe der Laser Auswirkungen auf eine Region von Auflösung und Zoom bestimmt wird. Zum Beispiel ist eine Region der Wahl mit der gleichen Auflösung auf 256x256, 2-facher als bei 512x512, Zoom 1x gescannt, doch die maximal mögliche Live-Imaging-Geschwindigkeit ist 4-mal schneller bei 256x256, 2-facher. Für die Aufzeichnung der Aktivität von schnell bewegten intrazellulären Kompartimenten, haben wir erfolgreich mit folgenden Einstellungen aufgenommen: 5 Bildern pro z-Stapel mit einer Rate von einem z-Stapel pro 10 Sekunden mit einer Scan-Geschwindigkeit von 8000 Hz und 2x Line Mittelung. Für lange Imaging-Sessions auf der Skala von Stunden haben wir oft reduzieren die Bildrate auf einen pro mehrere Minuten und wählen Sie größere Flächen wie die Vorbereitung ist eher zu verlagern. Drosophila Visual System Anatomy Abbildung 3 zeigt die Anatomie des Drosophila erwachsenen Auge (Abb. 3A), das erwachsene Gehirn (Abb. 3B) und die 20% -25% Puppenstadium Auge CD / Gehirn-Komplex (Abb. 3C). 3A veranschaulicht die erwachsenen Auge sowohl mit als auch ohne die Lamina und Fettzellen befestigt. Während der erwachsenen Auge Dissektion, die Lamina, die in der Mitte des Auges in eine Schüssel von der Photorezeptor Zellkörper (links) gebildet eingebettet ist, muss ohne Unterbrechung die Zellkörper unten (rechts) entfernt werden. Für das erwachsene Gehirn Dissektion, sollte man in der Lage sein, die Photorezeptor Zellkörper, die Lamina, die Optik Lappen, die zentrale Gehirn, und der Luftröhre (Abb. 3B) zu unterscheiden. Die Photorezeptoren und Luftröhre müssen für diese Präparation entfernt werden, während die Lamina an der optic lobe. Zur Unterstützung bei der Identifizierung der 20-25% Puppenstadium Auge CD / Gehirn komplex ist, ist ein Live-Bild in Abbildung 3C dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. (A) erwachsenen Gehirn. (B) erwachsenen Auge. (C) 20% -25% Puppenstadium eye-disc/brain komplex. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. (A) Perfusionskammer Montage-und (B) Dichtung Positionierung relativ zu der Probe. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. (A) Adult Rhabdomerlänge Färbung mit anti-chaoptin. (B) Adult Lamina Färbung mit anti-chaoptin (grün, Photorezeptoren), anti-Ebenholz (rot, Glia) und sec6 (blau, Interneuronen).

Special Equipment: <ol><li> Dissection Scope: Leica Mz12.5 mit Digitalkamera </li><li> Leica TCS SP5 konfokale Tandem-Scanner-Mikroskop für konventionelle und resonant Scannen leben Mikroskopie, darunter Blau (488 nm), Grün (561nm), orange (594nm) und weit-roten (633 nm)-Laser sowie spezielle 63x, 1,4 Glycerin und ein 63x, 1,3 Eintauchen in Wasser Linsen. </li><li> Harvard Instruments konfokalen Imaging Chamber RC-30 und Schlauchpumpe Modell 720 </li><li> Sutter Pipette Puller P-97 </li><li> Software: Amira 5.2, Visage Imaging </li></ol>

preparation of developing and adult drosophila brains and retinae for live imaging

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Gehirn und visuelle System sind weit Modellsysteme genutzt, um neuronale Entwicklung, Funktion und Degeneration zu studieren. Hier zeigen wir drei Präparaten des Gehirns und des visuellen Systems, dass der Bereich aus den Entwicklungsländern Auge Disc-Hirn-Komplexes in den Entwicklungsländern Puppen auf einzelne Auge und Gehirn Dissektion von erwachsenen Fliegen zu decken. Alle Protokolle sind für die Live-Kultur der Vorbereitungen optimiert. Allerdings stellen wir auch die Voraussetzungen für eine feste Gewebe immunhistochemisch gegebenenfalls. Schließlich zeigen wir leben Bildgebung Bedingungen für diese Präparate mit herkömmlichen und resonant 4D konfokale Bildgebung leben in einer Perfusionskammer. Zusammen bieten diese Protokolle als Grundlage für Live-Aufnahmen auf verschiedenen Zeitskalen von funktionellen intrazellulären Assays auf der Skala von Minuten zu Entwicklungsstörungen oder degenerative Prozesse auf der Skala von vielen Stunden.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging at JoVE.com

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Dieses Protokoll beschreibt drei<em&gt; Drosophila</em&gt; Vorbereitungen: 1) erwachsenen Gehirn Dissektion, 2) erwachsenen Netzhaut Dissektion und 3) die Entwicklung Auge Disc-Hirn-Komplexe Dissektion. Der Schwerpunkt liegt auf spezielle Herstellungstechniken und Bedingungen für die Live-Imaging gelegt, obwohl alle Vorbereitungen für feste Gewebe Immunhistochemie verwendet werden können.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

preparation-developing-adult-drosophila-brains-retinae-for-live

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

35.2K Aufrufe.  University of Texas Southwestern Medical Center. Dieses Protokoll beschreibt drei Drosophila Vorbereitungen: 1) erwachsenen Gehirn Dissektion, 2) erwachsenen Netzhaut Dissektion und 3) die Entwicklung Auge Disc-Hirn-Komplexe Dissektion. Der Schwerpunkt liegt auf spezielle Herstellungstechniken und Bedingungen für die Live-Imaging gelegt, obwohl alle Vorbereitungen für feste Gewebe Immunhistochemie verwendet werden können.

Serie: Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Forschung

Biologie

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

Vorbereitung von Adult Drosophila Augen für Thin Schnitte und mikroskopische Untersuchung

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Der Ausarbeitung der einzelnen Drosophila Ei Chambers für Live-Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...