Darüber hinaus danken wir den Herzchirurgen an der Universität Heidelberg für die Bereitstellung von menschlichen Vorhofgewebe und Claudia Liebetrau, Katrin Kupser und Ramona Nagel für ihre ausgezeichneten technischen Support. Besonderer Dank gilt auch Andy W. Trafford für seine Anregungen und Ratschläge während der Errichtung der Ca 2 + transiente Messungen. Die Autoren wollen ihre tiefste Dankbarkeit an die Mitglieder der Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie (Leitung: Ursula Ravens) Ausdruck der TU Dresden für die Gelegenheit boten sie uns in die grundlegenden Techniken und Fertigkeiten in zelluläre Elektrophysiologie und cardiomyocyte Isolierung zu lernen. Die Autoren Forschung wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Do769/1-1-3), das Bundesministerium für Bildung und Forschung im Rahmen des Kompetenznetzes Vorhofflimmern (01Gi0204) und das Deutsche Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung, der Europäischen Union unterstützt durch die Euischen Netzwerk für Translationale Forschung bei Vorhofflimmern (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, groß angelegte Projekt Integration, Vorschlag Nr. 261057) und der europäisch-nordamerikanischen Vorhofflimmern Research Alliance (ENAFRA) Erteilung Fondation Leducq (07CVD03). Die schematische Übersicht in der Videodatei gezeigt wurde mit Hilfe von Servier ärztlichen Kunst.

Experimentelle Protokolle müssen von der lokalen Ethikkommission genehmigt werden und alle Patienten müssen eine schriftliche Einverständniserklärung geben. Unsere Forschung wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg (# 2011-216N-MA) zugelassen und wurde in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung. 0. Gewinnung von menschlichem Vorhofgewebe Im Routinebetrieb Kanülierung Verfahren bei Patienten mit Operationen am offenen Herzen für Herz-Lungen-Bypass-Operation, wird die Spitze des rechten Herzohr Regel entfernt und zur Isolierung von atrialen Kardiomyozyten verwendet werden. Nach Exzision der Gewebeprobe wird sofort in einem 50 ml Falcon-Röhrchen mit sterilem Ca 2 +-freien übertragen Transportlösung mit 2,3-butanedione Monoxim (Tabelle I; BDM, kontraktilen Inhibitor, verhindert myocyte contracture). Mit Transportzeiten zwischen 30 und 45 min, haben wir nicht erkennen, einen klaren Vorteil von Kühl-oder Sauerstoffversorgung sowohl in Bezug auf Anzahl und Qualität der isolierten atrialen Kardiomyozyten. Im allgemeinen Transport zum Labor sollte so schnell wie möglich. Allerdings, wenn längere Transportzeit nicht vermieden werden kann, Transport bei 4 ° C in sauerstoffhaltigen Lösung könnte von Vorteil sein. 1. Prearrangements <ol><li> Schalten Sie den Thermostatenkreislauf, der die Temperatur der ummantelten Becherglas (Tabelle II) steuert. Achten Sie darauf, die Temperatur innerhalb des Bechers beträgt 37 ° C. Das Becherglas wird mit einem Glasdeckel, um eine konstante Temperatur im Becherglas während der gesamten Trennung aufrechtzuerhalten. </li><li> Wiegen Sie die Collagenase I und Protease XXIV in drei Bechergläser und speichern Sie es bei Raumtemperatur. Die Enzyme werden unmittelbar vor der Anwendung verdünnt werden. </li><li> Shop 20 ml Ca 2 + freier Lösung in einer Petrischale bei 4 ° C. </li><li>Shop 250 ml von Ca 2 + freier Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C </li></ol> 2. Reinigung des Tissue <ol><li> Übertragen Sie die Gewebeprobe zusammen mit dem Transport-Lösung in eine Petrischale (~ 10 cm Durchmesser) und entfernen Fettgewebe grob mit einer Schere. </li><li> Wiegen Sie die Gewebeprobe. Zwischen 200 und 600 mg sind für die Zell-Isolierung verwendet. Der verbleibende Gewebe in flüssigem Stickstoff für eine spätere biochemische Analyse eingefroren. </li><li> Übertragen Sie die Gewebeprobe in die Petrischale mit 20 ml Ca 2 + kostenlose Lösung bei 4 ° C (siehe Schritt 1.3) und hacken die Gewebeprobe in kleine Stücke von etwa 1 mm 3 in der Größe. </li><li> Die folgenden Schritte sollten bei 37 ° C und unter ständiger Begasung mit 100% O 2 ausgeführt werden. Eine Pipettenspitze auf die Sauerstoff-Schlauch gelegt werden, um starke Blasenbildung zu vermeiden und kontinuierliche Luftstrom erzeugen. </li><li> Übertragen Sie die Gewebe Stücke zusammen mit dem Ca 2 +-freie Lösung inder ummantelten Becherglas und rühren Sie vorsichtig für etwa 3 min mit einem magnetischen Rührstab. </li><li> Stoppen Rühren und lassen Sie die Stücke Gewebe niederlassen für ein paar Sekunden. Vorsichtig belasten den Überstand durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II). Bringen Sie die verhaltene Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas mit einer Pinzette. </li><li> Refill das Becherglas mit Ca 2 + kostenlose Lösung und wiederholen Sie den Waschschritt 2.4 und 2.5 zwei mal. </li></ol> 3. Erste enzymatische Verdauung <ol><li> Re-suspend die Gewebe Brocken mit 20 ml Enzymlösung E1 (Tabelle I), die Kollagenase und Protease und vorsichtig umrühren für 10 min. </li><li> In 40 ul 10 mM CaCl 2-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 20 &amp;mgr; M Ca 2 + erhalten. </li><li> Nach 35 min Belastung der Überstand vorsichtig durch ein Nylonnetz (200 um, Tabelle II) in einer Weise, dass die meisten der Stücke Gewebe im Becherglas verbleiben. Zurück Restregnete Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas. </li></ol> 4. Second enzymatische Verdauung <ol><li> Resuspendieren der Gewebe Brocken wieder mit 20 ml Enzymlösung E2 mit Kollagenase ich nur (Tabelle I). In 40 ul 10 mM CaCl 2-Lösung sofort, um eine Endkonzentration von 20 &amp;mgr; M Ca 2 + erhalten. </li><li> Während der zweiten Verdauung Verwendung Schere weiter zu hacken Gewebe Blutgerinnsel gelegentlich. </li><li> Nach 5 min eine Probe mit einer Pasteurpipette auf die Dissoziation von Zellen zu überprüfen. Wiederholen Sie diese alle 2-3 min bis stabförmigen, gestreift Kardiomyozyten erscheinen. </li><li> Stoppen Rühren und damit die Gewebe Brocken, um sich niederzulassen für ca. 20-30 sek. </li><li> Der Stamm der Überstand vorsichtig durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II) in einem 50 ml Falcon-Röhrchen (Tube A). Bringen Sie die verhaltene Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas. </li><li> Re-suspend die Gewebe Brocken im Becherglas mit 20 ml storage Lösung (Tabelle I) und 10 weitere distanzieren die Zellen durch vorsichtiges mechanisches Verreiben mit 20 ml serologische Pipette mit Spender. Versuchen Sie, Blasenbildung zu vermeiden, da Blasen nachteilig auf das Überleben der Zelle und Qualität sind. </li><li> Der Stamm der Überstand vorsichtig durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II) in einem 50 ml Falcon-Röhrchen (Tube B). </li></ol> 5. Abschließende Vorbereitung und Einstellung von Final Ca 2 +-Konzentration <ol><li> Zentrifuge sowohl Falcon-Röhrchen A und B (siehe Schritt 4.5 und 4.7) bei 95 g für 10 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand von beiden Rohre sorgfältig durch Aspiration. Achten Sie darauf, das Pellet stören. Überstand verwerfen. </li><li> Re-suspend sowohl Pellets in 1,5 ml-Storage-Lösung (Tabelle I) jede (Raumtemperatur). </li><li> Fügen Sie zwei mal 7,5 ul 10 mM CaCl 2-Lösung in jedes Falcon und vorsichtig umrühren. Inkubieren für 10 min nach jedem Schritt. </li><li>In 15 ul 10 mM CaCl 2-Lösung, um eine endgültige Ca 2 +-Konzentration von 0,2 mM zu erhalten. </li></ol> 6. Laden von Myozyten mit dem fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator Fluo-3 AM (Abbildung 1) <ol><li> Übertragen 1,5 ml Zellsuspension (Röhrchen A und / oder das Rohr B) in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf-Röhrchen). </li><li> Die folgenden Schritte sollten unter Berücksichtigung der Lichtempfindlichkeit des fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator Fluo-3 ausgeführt. </li><li> Lösen Sie 50 ug der Membran durchlässig Acetoxymethylester Derivat Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabelle III) in 44 ul der Pluronic F-127 (Tabelle III) stock Lösung (20% w / v in wasserfreiem DMSO) zu erhalten eine 1 mM Fluo-03.00 Lager-Lösung, die bei -20 ° C für höchstens 1 Woche gelagert werden können. </li><li> In 15 ul der Fluo-03.00 Stammlösung der Mikrozentrifugenröhrchens mit 1,5 ml Zellsuspension (siehe Schritt 6.1) und agitierensorgfältig. </li><li> Inkubation der Zellsuspension für 10 min in einem optisch undurchsichtige Box. </li><li> Kurz bei etwa 6.000 rpm zentrifugiert. </li><li> Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 ml Badlösung (Tabelle IV). </li><li> Verlassen Sie die Zellsuspension für etwa 30 min für Entesterung vor Beginn mit Experimenten. </li></ol> 7. Gleichzeitige Patch-Clamp-und Epifluoreszenz Ca 2 + Messungen Seit dem Patch-Clamp-Messungen sind nicht das große Thema dieser Bewertung verweisen wir den interessierten Leser auf andere Publikationen Bereitstellung eines genauere Beschreibung dieser Technik. 11-14 Aus Gründen der Vollständigkeit stellen wir eine kurze Zusammenfassung eines Protokolls zu messen Aktionspotentiale oder L-Typ-Ca 2 +-Ströme, die beide bei gleichzeitiger Ca 2 +-Transienten-Aufnahmen. Bei Versuchen Myozyten werden bei 37 ° C mit Bad Lö superfundiertauf (Tabelle IV) mit einem schnellen Perfusion System (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Für Voltage-Clamp-Experimente, K +-Ströme durch Zugabe von 4-Aminopyridin (5 mmol / l) und BaCl 2 (0,1 mmol / L) der Badlösung blockiert. Borosilikatglas Mikroelektroden verwendet werden und sollte kippen Widerstände von 2-5 MOhm haben, wenn sie mit Pipette Lösung (Tabelle V) gefüllt. Neben der Fluo-3 AM des Myozyten Laden (siehe Schritt 6) wird Fluo-3 auch in der Pipette Lösung (Tabelle V) enthalten. Fluoreszenz wird bei 488 nm angeregt und emittiert Licht (&lt;520 nm) auf [Ca 2 +] i vorausgesetzt umgewandelt <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> wo k d = Dissoziationskonstante von Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3-Fluoreszenz;. F max = Ca 2 +-gesättigten Fluoreszenz am Ende jedes Experiments 12 erhaltenen beiden elektrischen Signalen und epifluoreszenten Ca 2 +-Signale werden gleichzeitig erfasst. Aktionspotentiale werden in 0,5 Hz in Current-Clamp-Modus mit 1 ms Stromimpulse 1.2x Schwelle Stärke stimuliert. L-Typ-Ca 2 +-Ströme werden in Voltage-Clamp-Modus mit einem Haltepotential von -80 mV und eine 100-ms-Impulses Rampe bis -40 mV, die schnellen Na +-Strom, gefolgt von einer 100-ms gemessen inaktivieren Test-Impuls auf +10 mV bei 0,5 Hz liegt.

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	<li>Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+molecular+pathophysiology+of+atrial+fibrillation.">Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.</a> J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).</li><li>Margaret, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).</li><li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart.">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-Protein+&#946;3-subunit+825T+allele+is+associated+with+enhanced+human+atrial+inward+rectifier+potassium+currents.">G-Protein &#946;3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents.</a> Circulation. 102, 692-697 (2000).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phosphorylation-dependent+regulation+of+constitutively+active+and+muscarinic+receptor-activated+IK,ACh+channels+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+IK,ACh+current+may+contribute+to+clinical+efficacy+of+class+I+and+class+III+antiarrhythmic+drugs+in+patients+with+atrial+fibrillation.">Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation.</a> Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G+protein-gated+potassium+current+IK,ACh+is+constitutively+active+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 3697-3706 (2005).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left-to-right+atrial+inward+rectifier+potassium+current+gradients+in+patients+with+paroxysmal+versus+chronic+atrial+fibrillation.">Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation.</a> Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).</li><li>Amos, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+between+outward+currents+of+human+atrial+and+subepicardial+ventricular+myocytes.">Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).</li><li>Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+delayed+rectifier+current+inactivation+in+human+atrial+myocytes:+properties+and+consequences.">Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences.</a> Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).</li><li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+IK,ACh+channels+in+the+diseased+heart.">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart.</a> Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).</li><li>Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca2++buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++content+in+cardiac+ventricular+myocytes.">A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).</li><li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart.">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+and+increased+Na+-Ca2++exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125, 2059-2070 (2012).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart.">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circ Res. 26, 679-687 (1970).</li><li>Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+calcium+tolerant+myocytes+from+adult+rat+hearts:+review+of+the+literature+and+description+of+a+method.">Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method.</a> Life Sci. 33, 1-18 (1983).</li><li>Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart.">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li><li>Bielecki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+changes+in+pH+of+the+perfusion+fluid+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox+in+the+isolated+rat+heart.">The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart.</a> Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).</li><li>Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+taurine+on+calcium+paradox+and+ischemic+heart+failure.">Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure.</a> Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).</li><li>Rich, T. L., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+depletion+in+rabbit+myocardium.+Calcium+paradox+protection+by+hypothermia+and+cation+substitution.">Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution.</a> Circ. Res. 51, 131-141 (1982).</li><li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+"KB+medium".">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).</li><li>Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes.">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).</li><li>Worthington, K., Worthington, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Worthington Enzyme Manual. , (1993).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology-specific+effects+of+the+IKur/Ito/IK,ACh+blocker+AVE0118+on+ion+channels+in+human+chronic+atrial+fibrillation.">Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).</li><li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+downregulation+of+G-protein-coupled+inward+rectifying+K++current+IK,ACh+in+chronic+human+atrial+fibrillation:+decrease+in+GIRK4+mRNA+correlates+with+reduced+IK,ACh+and+muscarinic+receptor-mediated+shortening+of+action+potentials.">Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials.</a> Circulation. 104, 2551-2557 (2001).</li><li>Hatem, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+compartments+of+sarcoplasmic+reticulum+participate+in+the+excitation-contraction+coupling+process+in+human+atrial+myocytes.">Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes.</a> Circ. Res. 80, 345-353 (1997).</li><li>Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+different+potassium+channels+in+human+atrium.+Contribution+to+the+basal+potassium+conductance.">Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance.</a> Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).</li><li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes.">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li><li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias.">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li></ol>

Worthington Biochemical Corp unterstützte diese Veröffentlichung durch Abdecken Herstellungskosten Videodatei. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und-analyse, Entscheidung zu veröffentlichen, oder Vorbereitung des Manuskripts.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von humanen atrialen Myozyten von rechts Herzohren von Patienten mit Operationen am offenen Herzen erhalten. Um diese Myozyten für Messungen von zytosolischen Ca 2 + verwenden wir angepasst ein zuvor beschriebenes Verfahren 4-11 durch Weglassen EGTA aus der Aufbewahrungslösung. Bereits im Jahr 1970 wurde beobachtet, dass, obwohl Myozyten in Gegenwart von Ca 2 + während der Verdauung zerfallen, alle von ihnen in Kontraktur und nicht lebensfähig. 16,17 Daher waren, wird Zellisolation in Ca 2 +-freie Lösung durchgeführt. Allerdings ist die Wiedereinführung von physiologischen Konzentrationen von Ca 2 + in Folge rasch Ca 2 +-Einstrom und Zelltod. Dies wurde als die Ca 2 + Paradox Phänomen, das ursprünglich in perfundierten Herzen von Zimmerman und Hulsman beobachtet wurde beschrieben worden. 18 Änderungen der Isolation Medien einschließlich der Verringerung des pH-Wertes auf 7,0, &lt;sup&gt; 19 Zusatz von Taurin 20 oder kleiner Mengen von Ca 2 + (siehe Schritt 3.2 und 4.1), 21 sowie die Lagerung von isolierten Myozyten in EGTA enthält storage-Lösung 22 vorgeschlagen worden, um die Ca 2 + Paradox. 17 zu verhindern Es ist jedoch bekannt, daß Ca 2 + Pufferung durch EGTA verringert die Amplitude des L-Typ-Ca 2 +-induzierte Ca 2 + Transienten Amplituden und die Ergebnisse in einem zweiphasigen Zerfall der Ca 2 + Transienten ist. 23 Daher verzichtet man EGTA während des gesamten Prozesses in Isolation, um Ca 2 +-Transienten mit typischen Eigenschaften und monophasischen zerfällt zu erhalten. Um die Zellen von der Ca 2 + schützen Paradoxon erhöhten wir die endgültige Ca 2 +-Konzentration der Aufbewahrungslösung schrittweise bis 0,2 mM. Die Wahl von Kollagenase ist wahrscheinlich der wichtigste Schritt für eine erfolgreiche myocyte Isolation. Konventionelle collagenases sind Rohpräparaten von Clostridium histolyticum erhalten und enthält Kollagenase zusätzlich zu einer Reihe von anderen Proteinasen Polysaccharidasen und Lipasen. Auf der Grundlage ihrer allgemeinen Zusammensetzung Kollagenasen sind in verschiedene Typen unterteilt. Worthington 24 Kollagenase Typ I und II wurden erfolgreich für die Isolierung von menschlichen Vorhofmyozyten. 4-10,15,25-30 In unserem vorliegend beschriebenen Protokoll verwendet, empfehlen wir die Verwendung von Kollagenase Typ I, obwohl wir waren auch in der Lage, akzeptable Mengen an lebenden Zellen mittels Collagenase Typ II zu erhalten. Selbst innerhalb eines einzelnen Collagenase Typ gibt es einen signifikanten Charge zu Charge Schwankungen in Bezug auf die Enzymaktivitäten. Diese Variationen erfordern eine sorgfältige Batch Auswahl und Prüfung der verschiedenen Chargen zu Isolation Verfahren zu optimieren. Die Online verfügbar Batch-Werkzeug aus Worthington Biochemical Corp ( <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / cls / match.php) kann verwendet werden, um verfügbaren Chargen mit einer Zusammensetzung, die gezeigt hat, dass für die Isolierung der menschlichen Vorhofmyozyten finden werden. Derzeit verwenden wir Kollagenase Typ I mit 250 U / mg Kollagenase-Aktivität, 345 U / mg Caseinase Aktivität, 2,16 U / mg Clostripainaktivität und 0,48 U / mg Trypsin-Aktivität (lot # 49H11338). Die erhaltenen Zellen unter Verwendung des in diesem Manuskript beschrieben innerhalb von 8 Stunden kann für Patch-Clamp-Technik, Ca 2 + Transienten Messungen und einer Kombination von beiden. 15 zusätzlich verwendet werden, können diese Zellen Messungen der zellulären Kontraktion als Reaktion auf ein elektrisches Feld Stimulation oder elektrische Stimulation mit der Patch-Clamp-Pipette (unveröffentlichte Beobachtungen).

Studieren elektrophysiologischen Eigenschaften von kardialen Ionenkanälen mit der Patch-Clamp-Technik und der Erforschung der zellulären Ca 2 + Handhabung Anomalien erfordern isolierten Herzmuskelzellen. Diese werden in der Regel im Anschluss an die in vitro Exposition von Herzgewebe Proben Verdauungsenzyme (Kollagenase, Hyaluronidase, Peptidase usw.) erhalten. Seit dem ersten Bericht der Isolation von lebensfähigen Herzmuskelzellen 1955 2 eine große Menge von Protokollen entwickelt worden, um einzelnen atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten aus verschiedenen Arten, darunter Maus, Ratte, Kaninchen, Hund, Meerschweinchen und Menschen ernten. In diesem Beitrag werden wir auf Isolierung von humanen Vorhofmyozyten konzentrieren. In Bezug auf Verfahren zur Isolierung von Myozyten aus anderen Spezies verweisen wir auf die &quot;Worthington Gewebedissoziation guide&quot; von Worthington Biochemical Corp, USA (vorausgesetzt <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). et al. 3 beschrieben Hier haben wir einen Schritt-für-Schritt-Beschreibung einer Technik, die von einer zuvor veröffentlichten Verfahren geeignet ist, bereitzustellen, um abgeleitet erhalten Vorhofmyozyten eignet sich nicht nur für die Patch-Clamp-Experimente als auch für die gleichzeitige intrazellulären Ca 2 +-Messungen. 4-11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td> &nbsp;</td>
 <td>Transport solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A3059</td>
 <td>Storage solution: 1%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BDM</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>31550</td>
 <td>Transport solution: 30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6501</td>
 <td>Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Transport solution: 20 
 Ca2+-free solution: 20 
 Enzyme solution E1 and E2: 20 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1251</td>
 <td>Storage solution: 70</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Transport solution: 10 
 Ca2+-free solution: 10 
 Enzyme solution E1 and E2: 10 
 Storage solution: 20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P5655</td>
 <td>Transport solution: 1.2 
 Ca2+-free solution: 1.2 
 Enzyme solution E1 and E2: 1.2 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M9397</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M1254</td>
 <td>Transport solution: 5 
 Ca2+-free solution: 5 
 Enzyme solution E1 and E2: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Transport solution: 100 
 Ca2+-free solution: 100 
 Enzyme solution E1 and E2: 100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Taurin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>86330</td>
 <td>Transport solution: 50 
 Ca2+-free solution: 50 
 Enzyme solution E1 and E2: 50 
 Storage solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>4196</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 286 U/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease XXIV</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8038</td>
 <td>Enzyme solution E1 and E2: 5 U/ml*</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 7.00 
 Ca2+-free solution: 7.00 
 Enzyme solution E1 and E2: 7.00 
 Storage solution: 7.40</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Transport solution: 1 M NaOH 
 Ca2+-free solution: 1 M NaOH 
 Enzyme solution E1 and E2: 1 M NaOH 
 Storage solution: 1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table I. Solutions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon mesh (200 &mu;m)</td>
 <td>VWR-Germany</td>
 <td>510-9527</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Jacketed reaction beaker</td>
 <td>VWR</td>
 <td>KT317000-0050</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table II. Specific equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl-sulphoxide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3 AM (special packaging)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F-1242</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-127</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>P6867</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Bath solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-aminopyridine*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A78403</td>
 <td>Bath solution: 5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BaCl2*</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>342920</td>
 <td>Bath solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2 &times; 2H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5080</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Bath solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Bath solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl &times; 6H2O</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M0250</td>
 <td>Bath solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3014</td>
 <td>Bath solution: 140</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Probenecid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8761</td>
 <td>Bath solution: 2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 7.35</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Bath solution: 1 M HCl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table IV. Bath solution for patch-clamp. *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Pipette solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DL-aspartat K+-salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2025</td>
 <td>Pipette solution: 92</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E4378</td>
 <td>Pipette solution: 0.02</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP-Tris</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G9002</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H9136</td>
 <td>Pipette solution: 10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1049360250</td>
 <td>Pipette solution: 48</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9187</td>
 <td>Pipette solution: 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2383</td>
 <td>Pipette solution: 4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-3**</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>F3715</td>
 <td>Pipette solution: 0.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>7.20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>adjusted with</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>1 M KOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table V. Pipette solution for patch-clamp*. *On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents

Das Studium der elektrophysiologischen Eigenschaften von kardialen Ionenkanälen mit der Patch-Clamp-Technik und der Erforschung von Herz-zellulären Ca 2 + Umgang mit Anomalien erfordert isolierten Herzmuskelzellen. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, Myozyten von Patienten mit diesen Techniken zu untersuchen eine wertvolle Voraussetzung, um die molekulare Basis von Herzerkrankungen wie Vorhofflimmern (AF) aufzuklären. 1 Hier ein Verfahren zur Isolierung von humanen atrialen Myozyten, die für beide beschreiben Patch-Clamp-Technik und gleichzeitige Messungen der intrazellulären Ca 2 +-Konzentrationen. Zuerst werden das rechte atriale Anhängsel von Patienten Operation am offenen Herzen erhalten in kleine Stücke Gewebe (&quot;Chunk-Methode&quot;) zerkleinert und gewaschen in Ca 2 +-freien Lösung. Dann werden die Gewebe Brocken werden in Kollagenase und Protease verdaut haltigen Lösungen mit 20 uM Ca 2 +. Danach werden die isolierten Myozyten harvested durch Filtration und Zentrifugation des Gewebes Suspension. Schließlich wird der Ca 2 +-Konzentration in der Zelle Aufbewahrungslösung angepasst schrittweise bis 0,2 mm. Diskutieren wir kurz die Bedeutung Ca 2 + und Ca 2 + Pufferung bei der Isolierung Verfahren und auch Vertreter Aufnahmen von Aktionspotentialen und Membranströme sowohl bei gleichzeitiger Ca 2 + Transienten Messungen in diesen isolierten Myozyten durchgeführt.

2A zeigt drei repräsentative Beispiele aus isolierten Menschenrecht Vorhofmyozyten. Um die Zellausbeute wir Pipette 10 ul Zellsuspension (Schritt 5.5) auf einem Objektträger CellFinder (quantifizieren <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). Gemittelte Zellausbeuten in 2B zeigen deutlich, dass es eine Tendenz zu niedrigeren Zellausbeuten bei chronischen AF (CAF) Patientenproben (Röhre A: 16,5 ± 3,1 Zellen/10 ul (n = 29) vs 5,1 ± 2,3 Zellen/10 ul (n = 10) in SR und CAF, p &lt;0,05; Rohr B: 17,9 ± 3,9 Zellen/10 ul (n = 29) im Vergleich zu 5,9 ± 2,0 Zellen/10 ul (n = 9) in SR und CAF, , p = 0,107). Repräsentative Beispiele für Action-Potential-Messungen und gleichzeitige Aufnahmen von zytosolischen Ca 2 + Transienten in Abbildung 3 dargestellt. In etwa 90% der untersuchten Zellen, ter Action-Potential ausgelöste Ca 2 +-Freisetzung verursacht klare und regelmäßige Kontraktionen Zelle. Wie bereits berichtet, lag die Ruhemembranpotenzial, die ein akzeptierter Indikator für die Integrität der Zelle ist, etwa -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 Myozyten / Patienten) und -77.7 ± 1,8 mV (n = 19/8 Myozyten / Patienten ) in SR und CAF (p&gt; 0,05). 15 Abbildung 4 zeigt repräsentative gleichzeitige Aufnahmen von spannungsabhängigen L-Typ-Ca 2 +-Ströme und cytosolischen Ca 2 +-Transienten. Verwendung des nicht-selektiven β-Adrenozeptor-Agonisten Isoprenalin (1 uM) erhöht Amplituden der beiden I Ca, L und zytosolischen Ca 2 + Transienten, was intakte β-adrenergen Signaltransduktion. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Fild 1. Flussdiagramm der Myozyten Fluo-03.00 Be-Protokoll (siehe Schritt 6.1-6.5). m / v, Masse / Volumen. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> Abbildung 2. A, Isoliert Menschenrecht Vorhofmyozyten nach einer Stunde in Storage-Lösung. B, Mittelwert ± SEM der Zelle Ausbeute in 10 ul Zellen in Storage-Lösung gezählt (siehe Schritt 5.5). n bezeichnet die Anzahl der Vorbereitung innerhalb jeder Gruppe. * P &lt;0,05. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Aufnahmen von Action-Potential ausgelöste Ca 2 +-Transienten (CAT) in einer atrialen Myozyten von einem Sinusrhythmus und chronic Vorhofflimmern Patienten. Top: Injected Membran Strom (I M) zur Stimulation (0,5 Hz) verwendet. Unten: Gleichzeitige Aufnahme von Membran-Potential (V M), und löste Katze (unten). (Neu gezeichnet mit Erlaubnis von Voigt et al. 2012) 15 <img alt="Fig. 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Aufnahmen der Isoprenalin (1 uM) Wirkung auf L-Typ-Ca 2 +-Strom ausgelöste Ca 2 +-Transienten (CAT) in einer atrialen Myozyten von einem Sinusrhythmus und einer chronischen Vorhofflimmern Patienten. Top: Voltage-Clamp-Protokoll (0,5 Hz). Unten: Gleichzeitige Aufnahme des Netto-Membran (I M), überwiegend aufgrund einer L-Typ-Ca 2 +-Strom (Mitte) und ausgelöst Katze (unten). (Neu gezeichnet mit Erlaubnis von Voigt,et al. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="Tabelle 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> Tabelle I. Lösungen. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="Tabelle 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> Tabelle II. Ausstattung. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="Tabelle 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> Tabelle III. Stoffe für das Laden von Myozyten mit Fluo-3 Uhr. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tabelle 4" fo:content-width = &quot;2,5 Zoll&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; Tabelle IV. Bath Lösung für Patch-Clamp. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="Tabelle 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> Tabelle V. Pipette Lösung für Patch-Clamp *.

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Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Wir beschreiben die Isolierung von humanen Vorhofmyozyten die für die intrazelluläre Ca verwendet werden kann<sup&gt; 2 +</sup&gt; Messungen in Kombination mit elektrophysiologischen Patch-Clamp-Studien.

Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienten und Membrane Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

isolation-human-atrial-myocytes-for-simultaneous-measurements-ca2

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

20.2K Aufrufe.  University of Duisburg-Essen. Wir beschreiben die Isolierung von humanen Vorhofmyozyten die für die intrazelluläre Ca verwendet werden kann 2 + Messungen in Kombination mit elektrophysiologischen Patch-Clamp-Studien.

Serie: Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

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Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Techniques for Imaging Ca 2 + Signaling in menschlichen Spermien

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Verfahren zur Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung von Sinoatrialknoten Myozyten aus erwachsenen Mäusen

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

Gleichzeitige Zuordnung und Quantifizierung der Purine im menschlichen mitochondrialen DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...