Darüber hinaus danken wir den Herzchirurgen an der Universität Heidelberg für die Bereitstellung von menschlichen Vorhofgewebe und Claudia Liebetrau, Katrin Kupser und Ramona Nagel für ihre ausgezeichneten technischen Support. Besonderer Dank gilt auch Andy W. Trafford für seine Anregungen und Ratschläge während der Errichtung der Ca 2 + transiente Messungen. Die Autoren wollen ihre tiefste Dankbarkeit an die Mitglieder der Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie (Leitung: Ursula Ravens) Ausdruck der TU Dresden für die Gelegenheit boten sie uns in die grundlegenden Techniken und Fertigkeiten in zelluläre Elektrophysiologie und cardiomyocyte Isolierung zu lernen. Die Autoren Forschung wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Do769/1-1-3), das Bundesministerium für Bildung und Forschung im Rahmen des Kompetenznetzes Vorhofflimmern (01Gi0204) und das Deutsche Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung, der Europäischen Union unterstützt durch die Euischen Netzwerk für Translationale Forschung bei Vorhofflimmern (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, groß angelegte Projekt Integration, Vorschlag Nr. 261057) und der europäisch-nordamerikanischen Vorhofflimmern Research Alliance (ENAFRA) Erteilung Fondation Leducq (07CVD03). Die schematische Übersicht in der Videodatei gezeigt wurde mit Hilfe von Servier ärztlichen Kunst.

Experimentelle Protokolle müssen von der lokalen Ethikkommission genehmigt werden und alle Patienten müssen eine schriftliche Einverständniserklärung geben. Unsere Forschung wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg (# 2011-216N-MA) zugelassen und wurde in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung. 0. Gewinnung von menschlichem Vorhofgewebe Im Routinebetrieb Kanülierung Verfahren bei Patienten mit Operationen am offenen Herzen für Herz-Lungen-Bypass-Operation, wird die Spitze des rechten Herzohr Regel entfernt und zur Isolierung von atrialen Kardiomyozyten verwendet werden. Nach Exzision der Gewebeprobe wird sofort in einem 50 ml Falcon-Röhrchen mit sterilem Ca 2 +-freien übertragen Transportlösung mit 2,3-butanedione Monoxim (Tabelle I; BDM, kontraktilen Inhibitor, verhindert myocyte contracture). Mit Transportzeiten zwischen 30 und 45 min, haben wir nicht erkennen, einen klaren Vorteil von Kühl-oder Sauerstoffversorgung sowohl in Bezug auf Anzahl und Qualität der isolierten atrialen Kardiomyozyten. Im allgemeinen Transport zum Labor sollte so schnell wie möglich. Allerdings, wenn längere Transportzeit nicht vermieden werden kann, Transport bei 4 ° C in sauerstoffhaltigen Lösung könnte von Vorteil sein. 1. Prearrangements <ol><li> Schalten Sie den Thermostatenkreislauf, der die Temperatur der ummantelten Becherglas (Tabelle II) steuert. Achten Sie darauf, die Temperatur innerhalb des Bechers beträgt 37 ° C. Das Becherglas wird mit einem Glasdeckel, um eine konstante Temperatur im Becherglas während der gesamten Trennung aufrechtzuerhalten. </li><li> Wiegen Sie die Collagenase I und Protease XXIV in drei Bechergläser und speichern Sie es bei Raumtemperatur. Die Enzyme werden unmittelbar vor der Anwendung verdünnt werden. </li><li> Shop 20 ml Ca 2 + freier Lösung in einer Petrischale bei 4 ° C. </li><li>Shop 250 ml von Ca 2 + freier Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C </li></ol> 2. Reinigung des Tissue <ol><li> Übertragen Sie die Gewebeprobe zusammen mit dem Transport-Lösung in eine Petrischale (~ 10 cm Durchmesser) und entfernen Fettgewebe grob mit einer Schere. </li><li> Wiegen Sie die Gewebeprobe. Zwischen 200 und 600 mg sind für die Zell-Isolierung verwendet. Der verbleibende Gewebe in flüssigem Stickstoff für eine spätere biochemische Analyse eingefroren. </li><li> Übertragen Sie die Gewebeprobe in die Petrischale mit 20 ml Ca 2 + kostenlose Lösung bei 4 ° C (siehe Schritt 1.3) und hacken die Gewebeprobe in kleine Stücke von etwa 1 mm 3 in der Größe. </li><li> Die folgenden Schritte sollten bei 37 ° C und unter ständiger Begasung mit 100% O 2 ausgeführt werden. Eine Pipettenspitze auf die Sauerstoff-Schlauch gelegt werden, um starke Blasenbildung zu vermeiden und kontinuierliche Luftstrom erzeugen. </li><li> Übertragen Sie die Gewebe Stücke zusammen mit dem Ca 2 +-freie Lösung inder ummantelten Becherglas und rühren Sie vorsichtig für etwa 3 min mit einem magnetischen Rührstab. </li><li> Stoppen Rühren und lassen Sie die Stücke Gewebe niederlassen für ein paar Sekunden. Vorsichtig belasten den Überstand durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II). Bringen Sie die verhaltene Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas mit einer Pinzette. </li><li> Refill das Becherglas mit Ca 2 + kostenlose Lösung und wiederholen Sie den Waschschritt 2.4 und 2.5 zwei mal. </li></ol> 3. Erste enzymatische Verdauung <ol><li> Re-suspend die Gewebe Brocken mit 20 ml Enzymlösung E1 (Tabelle I), die Kollagenase und Protease und vorsichtig umrühren für 10 min. </li><li> In 40 ul 10 mM CaCl 2-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 20 &amp;mgr; M Ca 2 + erhalten. </li><li> Nach 35 min Belastung der Überstand vorsichtig durch ein Nylonnetz (200 um, Tabelle II) in einer Weise, dass die meisten der Stücke Gewebe im Becherglas verbleiben. Zurück Restregnete Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas. </li></ol> 4. Second enzymatische Verdauung <ol><li> Resuspendieren der Gewebe Brocken wieder mit 20 ml Enzymlösung E2 mit Kollagenase ich nur (Tabelle I). In 40 ul 10 mM CaCl 2-Lösung sofort, um eine Endkonzentration von 20 &amp;mgr; M Ca 2 + erhalten. </li><li> Während der zweiten Verdauung Verwendung Schere weiter zu hacken Gewebe Blutgerinnsel gelegentlich. </li><li> Nach 5 min eine Probe mit einer Pasteurpipette auf die Dissoziation von Zellen zu überprüfen. Wiederholen Sie diese alle 2-3 min bis stabförmigen, gestreift Kardiomyozyten erscheinen. </li><li> Stoppen Rühren und damit die Gewebe Brocken, um sich niederzulassen für ca. 20-30 sek. </li><li> Der Stamm der Überstand vorsichtig durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II) in einem 50 ml Falcon-Röhrchen (Tube A). Bringen Sie die verhaltene Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas. </li><li> Re-suspend die Gewebe Brocken im Becherglas mit 20 ml storage Lösung (Tabelle I) und 10 weitere distanzieren die Zellen durch vorsichtiges mechanisches Verreiben mit 20 ml serologische Pipette mit Spender. Versuchen Sie, Blasenbildung zu vermeiden, da Blasen nachteilig auf das Überleben der Zelle und Qualität sind. </li><li> Der Stamm der Überstand vorsichtig durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II) in einem 50 ml Falcon-Röhrchen (Tube B). </li></ol> 5. Abschließende Vorbereitung und Einstellung von Final Ca 2 +-Konzentration <ol><li> Zentrifuge sowohl Falcon-Röhrchen A und B (siehe Schritt 4.5 und 4.7) bei 95 g für 10 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand von beiden Rohre sorgfältig durch Aspiration. Achten Sie darauf, das Pellet stören. Überstand verwerfen. </li><li> Re-suspend sowohl Pellets in 1,5 ml-Storage-Lösung (Tabelle I) jede (Raumtemperatur). </li><li> Fügen Sie zwei mal 7,5 ul 10 mM CaCl 2-Lösung in jedes Falcon und vorsichtig umrühren. Inkubieren für 10 min nach jedem Schritt. </li><li>In 15 ul 10 mM CaCl 2-Lösung, um eine endgültige Ca 2 +-Konzentration von 0,2 mM zu erhalten. </li></ol> 6. Laden von Myozyten mit dem fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator Fluo-3 AM (Abbildung 1) <ol><li> Übertragen 1,5 ml Zellsuspension (Röhrchen A und / oder das Rohr B) in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf-Röhrchen). </li><li> Die folgenden Schritte sollten unter Berücksichtigung der Lichtempfindlichkeit des fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator Fluo-3 ausgeführt. </li><li> Lösen Sie 50 ug der Membran durchlässig Acetoxymethylester Derivat Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabelle III) in 44 ul der Pluronic F-127 (Tabelle III) stock Lösung (20% w / v in wasserfreiem DMSO) zu erhalten eine 1 mM Fluo-03.00 Lager-Lösung, die bei -20 ° C für höchstens 1 Woche gelagert werden können. </li><li> In 15 ul der Fluo-03.00 Stammlösung der Mikrozentrifugenröhrchens mit 1,5 ml Zellsuspension (siehe Schritt 6.1) und agitierensorgfältig. </li><li> Inkubation der Zellsuspension für 10 min in einem optisch undurchsichtige Box. </li><li> Kurz bei etwa 6.000 rpm zentrifugiert. </li><li> Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 ml Badlösung (Tabelle IV). </li><li> Verlassen Sie die Zellsuspension für etwa 30 min für Entesterung vor Beginn mit Experimenten. </li></ol> 7. Gleichzeitige Patch-Clamp-und Epifluoreszenz Ca 2 + Messungen Seit dem Patch-Clamp-Messungen sind nicht das große Thema dieser Bewertung verweisen wir den interessierten Leser auf andere Publikationen Bereitstellung eines genauere Beschreibung dieser Technik. 11-14 Aus Gründen der Vollständigkeit stellen wir eine kurze Zusammenfassung eines Protokolls zu messen Aktionspotentiale oder L-Typ-Ca 2 +-Ströme, die beide bei gleichzeitiger Ca 2 +-Transienten-Aufnahmen. Bei Versuchen Myozyten werden bei 37 ° C mit Bad Lö superfundiertauf (Tabelle IV) mit einem schnellen Perfusion System (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Für Voltage-Clamp-Experimente, K +-Ströme durch Zugabe von 4-Aminopyridin (5 mmol / l) und BaCl 2 (0,1 mmol / L) der Badlösung blockiert. Borosilikatglas Mikroelektroden verwendet werden und sollte kippen Widerstände von 2-5 MOhm haben, wenn sie mit Pipette Lösung (Tabelle V) gefüllt. Neben der Fluo-3 AM des Myozyten Laden (siehe Schritt 6) wird Fluo-3 auch in der Pipette Lösung (Tabelle V) enthalten. Fluoreszenz wird bei 488 nm angeregt und emittiert Licht (&lt;520 nm) auf [Ca 2 +] i vorausgesetzt umgewandelt <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> wo k d = Dissoziationskonstante von Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3-Fluoreszenz;. F max = Ca 2 +-gesättigten Fluoreszenz am Ende jedes Experiments 12 erhaltenen beiden elektrischen Signalen und epifluoreszenten Ca 2 +-Signale werden gleichzeitig erfasst. Aktionspotentiale werden in 0,5 Hz in Current-Clamp-Modus mit 1 ms Stromimpulse 1.2x Schwelle Stärke stimuliert. L-Typ-Ca 2 +-Ströme werden in Voltage-Clamp-Modus mit einem Haltepotential von -80 mV und eine 100-ms-Impulses Rampe bis -40 mV, die schnellen Na +-Strom, gefolgt von einer 100-ms gemessen inaktivieren Test-Impuls auf +10 mV bei 0,5 Hz liegt.

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Res. 66, 1277-1286 (1990).</li><li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes.">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li><li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias.">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li></ol>

Worthington Biochemical Corp unterstützte diese Veröffentlichung durch Abdecken Herstellungskosten Videodatei. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und-analyse, Entscheidung zu veröffentlichen, oder Vorbereitung des Manuskripts.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von humanen atrialen Myozyten von rechts Herzohren von Patienten mit Operationen am offenen Herzen erhalten. Um diese Myozyten für Messungen von zytosolischen Ca 2 + verwenden wir angepasst ein zuvor beschriebenes Verfahren 4-11 durch Weglassen EGTA aus der Aufbewahrungslösung. Bereits im Jahr 1970 wurde beobachtet, dass, obwohl Myozyten in Gegenwart von Ca 2 + während der Verdauung zerfallen, alle von ihnen in Kontraktur und nicht lebensfähig. 16,17 Daher waren, wird Zellisolation in Ca 2 +-freie Lösung durchgeführt. Allerdings ist die Wiedereinführung von physiologischen Konzentrationen von Ca 2 + in Folge rasch Ca 2 +-Einstrom und Zelltod. Dies wurde als die Ca 2 + Paradox Phänomen, das ursprünglich in perfundierten Herzen von Zimmerman und Hulsman beobachtet wurde beschrieben worden. 18 Änderungen der Isolation Medien einschließlich der Verringerung des pH-Wertes auf 7,0, &lt;sup&gt; 19 Zusatz von Taurin 20 oder kleiner Mengen von Ca 2 + (siehe Schritt 3.2 und 4.1), 21 sowie die Lagerung von isolierten Myozyten in EGTA enthält storage-Lösung 22 vorgeschlagen worden, um die Ca 2 + Paradox. 17 zu verhindern Es ist jedoch bekannt, daß Ca 2 + Pufferung durch EGTA verringert die Amplitude des L-Typ-Ca 2 +-induzierte Ca 2 + Transienten Amplituden und die Ergebnisse in einem zweiphasigen Zerfall der Ca 2 + Transienten ist. 23 Daher verzichtet man EGTA während des gesamten Prozesses in Isolation, um Ca 2 +-Transienten mit typischen Eigenschaften und monophasischen zerfällt zu erhalten. Um die Zellen von der Ca 2 + schützen Paradoxon erhöhten wir die endgültige Ca 2 +-Konzentration der Aufbewahrungslösung schrittweise bis 0,2 mM. Die Wahl von Kollagenase ist wahrscheinlich der wichtigste Schritt für eine erfolgreiche myocyte Isolation. Konventionelle collagenases sind Rohpräparaten von Clostridium histolyticum erhalten und enthält Kollagenase zusätzlich zu einer Reihe von anderen Proteinasen Polysaccharidasen und Lipasen. Auf der Grundlage ihrer allgemeinen Zusammensetzung Kollagenasen sind in verschiedene Typen unterteilt. Worthington 24 Kollagenase Typ I und II wurden erfolgreich für die Isolierung von menschlichen Vorhofmyozyten. 4-10,15,25-30 In unserem vorliegend beschriebenen Protokoll verwendet, empfehlen wir die Verwendung von Kollagenase Typ I, obwohl wir waren auch in der Lage, akzeptable Mengen an lebenden Zellen mittels Collagenase Typ II zu erhalten. Selbst innerhalb eines einzelnen Collagenase Typ gibt es einen signifikanten Charge zu Charge Schwankungen in Bezug auf die Enzymaktivitäten. Diese Variationen erfordern eine sorgfältige Batch Auswahl und Prüfung der verschiedenen Chargen zu Isolation Verfahren zu optimieren. Die Online verfügbar Batch-Werkzeug aus Worthington Biochemical Corp ( <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / cls / match.php) kann verwendet werden, um verfügbaren Chargen mit einer Zusammensetzung, die gezeigt hat, dass für die Isolierung der menschlichen Vorhofmyozyten finden werden. Derzeit verwenden wir Kollagenase Typ I mit 250 U / mg Kollagenase-Aktivität, 345 U / mg Caseinase Aktivität, 2,16 U / mg Clostripainaktivität und 0,48 U / mg Trypsin-Aktivität (lot # 49H11338). Die erhaltenen Zellen unter Verwendung des in diesem Manuskript beschrieben innerhalb von 8 Stunden kann für Patch-Clamp-Technik, Ca 2 + Transienten Messungen und einer Kombination von beiden. 15 zusätzlich verwendet werden, können diese Zellen Messungen der zellulären Kontraktion als Reaktion auf ein elektrisches Feld Stimulation oder elektrische Stimulation mit der Patch-Clamp-Pipette (unveröffentlichte Beobachtungen).

Studieren elektrophysiologischen Eigenschaften von kardialen Ionenkanälen mit der Patch-Clamp-Technik und der Erforschung der zellulären Ca 2 + Handhabung Anomalien erfordern isolierten Herzmuskelzellen. Diese werden in der Regel im Anschluss an die in vitro Exposition von Herzgewebe Proben Verdauungsenzyme (Kollagenase, Hyaluronidase, Peptidase usw.) erhalten. Seit dem ersten Bericht der Isolation von lebensfähigen Herzmuskelzellen 1955 2 eine große Menge von Protokollen entwickelt worden, um einzelnen atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten aus verschiedenen Arten, darunter Maus, Ratte, Kaninchen, Hund, Meerschweinchen und Menschen ernten. In diesem Beitrag werden wir auf Isolierung von humanen Vorhofmyozyten konzentrieren. In Bezug auf Verfahren zur Isolierung von Myozyten aus anderen Spezies verweisen wir auf die &quot;Worthington Gewebedissoziation guide&quot; von Worthington Biochemical Corp, USA (vorausgesetzt <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). et al. 3 beschrieben Hier haben wir einen Schritt-für-Schritt-Beschreibung einer Technik, die von einer zuvor veröffentlichten Verfahren geeignet ist, bereitzustellen, um abgeleitet erhalten Vorhofmyozyten eignet sich nicht nur für die Patch-Clamp-Experimente als auch für die gleichzeitige intrazellulären Ca 2 +-Messungen. 4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 286 U/ml</td></tr><tr><td>Protease XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 7.40</td></tr><tr><td>adjusted with</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table I. Solutions.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon mesh (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Germany</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>Jacketed reaction beaker</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table II. Specific equipment.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl-sulphoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (special packaging)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminopyridine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl2*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 7.35</td></tr><tr><td>adjusted with</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 1 M HCl</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table IV. Bath solution for patch-clamp.&lt;/strong&gt; *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-aspartat K+-salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 0.02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7.20</td></tr><tr><td>adjusted with</td><td></td><td></td><td>1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table V. Pipette solution for patch-clamp*. &lt;/strong&gt;*On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents

Das Studium der elektrophysiologischen Eigenschaften von kardialen Ionenkanälen mit der Patch-Clamp-Technik und der Erforschung von Herz-zellulären Ca 2 + Umgang mit Anomalien erfordert isolierten Herzmuskelzellen. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, Myozyten von Patienten mit diesen Techniken zu untersuchen eine wertvolle Voraussetzung, um die molekulare Basis von Herzerkrankungen wie Vorhofflimmern (AF) aufzuklären. 1 Hier ein Verfahren zur Isolierung von humanen atrialen Myozyten, die für beide beschreiben Patch-Clamp-Technik und gleichzeitige Messungen der intrazellulären Ca 2 +-Konzentrationen. Zuerst werden das rechte atriale Anhängsel von Patienten Operation am offenen Herzen erhalten in kleine Stücke Gewebe (&quot;Chunk-Methode&quot;) zerkleinert und gewaschen in Ca 2 +-freien Lösung. Dann werden die Gewebe Brocken werden in Kollagenase und Protease verdaut haltigen Lösungen mit 20 uM Ca 2 +. Danach werden die isolierten Myozyten harvested durch Filtration und Zentrifugation des Gewebes Suspension. Schließlich wird der Ca 2 +-Konzentration in der Zelle Aufbewahrungslösung angepasst schrittweise bis 0,2 mm. Diskutieren wir kurz die Bedeutung Ca 2 + und Ca 2 + Pufferung bei der Isolierung Verfahren und auch Vertreter Aufnahmen von Aktionspotentialen und Membranströme sowohl bei gleichzeitiger Ca 2 + Transienten Messungen in diesen isolierten Myozyten durchgeführt.

2A zeigt drei repräsentative Beispiele aus isolierten Menschenrecht Vorhofmyozyten. Um die Zellausbeute wir Pipette 10 ul Zellsuspension (Schritt 5.5) auf einem Objektträger CellFinder (quantifizieren <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). Gemittelte Zellausbeuten in 2B zeigen deutlich, dass es eine Tendenz zu niedrigeren Zellausbeuten bei chronischen AF (CAF) Patientenproben (Röhre A: 16,5 ± 3,1 Zellen/10 ul (n = 29) vs 5,1 ± 2,3 Zellen/10 ul (n = 10) in SR und CAF, p &lt;0,05; Rohr B: 17,9 ± 3,9 Zellen/10 ul (n = 29) im Vergleich zu 5,9 ± 2,0 Zellen/10 ul (n = 9) in SR und CAF, , p = 0,107). Repräsentative Beispiele für Action-Potential-Messungen und gleichzeitige Aufnahmen von zytosolischen Ca 2 + Transienten in Abbildung 3 dargestellt. In etwa 90% der untersuchten Zellen, ter Action-Potential ausgelöste Ca 2 +-Freisetzung verursacht klare und regelmäßige Kontraktionen Zelle. Wie bereits berichtet, lag die Ruhemembranpotenzial, die ein akzeptierter Indikator für die Integrität der Zelle ist, etwa -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 Myozyten / Patienten) und -77.7 ± 1,8 mV (n = 19/8 Myozyten / Patienten ) in SR und CAF (p&gt; 0,05). 15 Abbildung 4 zeigt repräsentative gleichzeitige Aufnahmen von spannungsabhängigen L-Typ-Ca 2 +-Ströme und cytosolischen Ca 2 +-Transienten. Verwendung des nicht-selektiven β-Adrenozeptor-Agonisten Isoprenalin (1 uM) erhöht Amplituden der beiden I Ca, L und zytosolischen Ca 2 + Transienten, was intakte β-adrenergen Signaltransduktion. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Fild 1. Flussdiagramm der Myozyten Fluo-03.00 Be-Protokoll (siehe Schritt 6.1-6.5). m / v, Masse / Volumen. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> Abbildung 2. A, Isoliert Menschenrecht Vorhofmyozyten nach einer Stunde in Storage-Lösung. B, Mittelwert ± SEM der Zelle Ausbeute in 10 ul Zellen in Storage-Lösung gezählt (siehe Schritt 5.5). n bezeichnet die Anzahl der Vorbereitung innerhalb jeder Gruppe. * P &lt;0,05. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Aufnahmen von Action-Potential ausgelöste Ca 2 +-Transienten (CAT) in einer atrialen Myozyten von einem Sinusrhythmus und chronic Vorhofflimmern Patienten. Top: Injected Membran Strom (I M) zur Stimulation (0,5 Hz) verwendet. Unten: Gleichzeitige Aufnahme von Membran-Potential (V M), und löste Katze (unten). (Neu gezeichnet mit Erlaubnis von Voigt et al. 2012) 15 <img alt="Fig. 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Aufnahmen der Isoprenalin (1 uM) Wirkung auf L-Typ-Ca 2 +-Strom ausgelöste Ca 2 +-Transienten (CAT) in einer atrialen Myozyten von einem Sinusrhythmus und einer chronischen Vorhofflimmern Patienten. Top: Voltage-Clamp-Protokoll (0,5 Hz). Unten: Gleichzeitige Aufnahme des Netto-Membran (I M), überwiegend aufgrund einer L-Typ-Ca 2 +-Strom (Mitte) und ausgelöst Katze (unten). (Neu gezeichnet mit Erlaubnis von Voigt,et al. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="Tabelle 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> Tabelle I. Lösungen. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="Tabelle 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> Tabelle II. Ausstattung. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="Tabelle 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> Tabelle III. Stoffe für das Laden von Myozyten mit Fluo-3 Uhr. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tabelle 4" fo:content-width = &quot;2,5 Zoll&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; Tabelle IV. Bath Lösung für Patch-Clamp. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="Tabelle 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> Tabelle V. Pipette Lösung für Patch-Clamp *.

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Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Wir beschreiben die Isolierung von humanen Vorhofmyozyten die für die intrazelluläre Ca verwendet werden kann<sup&gt; 2 +</sup&gt; Messungen in Kombination mit elektrophysiologischen Patch-Clamp-Studien.

Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienten und Membrane Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

20.3K Aufrufe.  University of Duisburg-Essen. Wir beschreiben die Isolierung von humanen Vorhofmyozyten die für die intrazelluläre Ca verwendet werden kann 2 + Messungen in Kombination mit elektrophysiologischen Patch-Clamp-Studien.

Serie: Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Forschung

Medizin

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Biologie

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

Isolierung von Vorhofflimmern Herzzellen aus einem Rattenmodell der metabolischen Syndrom im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz mit erhaltener Auswurffraktion

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

Isolierung von Atrial Myozyten von erwachsenen Mäusen

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Spannung und Calcium Dual Channel Optical Mapping von Cultured HL-1 Vorhofmuskelzellen Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction and electrical activity. Hence, isolating viable, high-quality cardiomyocytes from the heart is the initial and most crucial experimental step. Comparing the various protocols for isolating the cardiomyocytes of adult mice, the Langendorff retrograde perfusion is the most successful and reproducible method reported in the literature, especially for isolating ventricular myocytes. However, isolating quality atrial myocytes from the perfused heart remains challenging, and few successful isolation reports are available. Solving this complicated problem is extremely important because apart from ventricular disease, atrial disease accounts for a large part of heart diseases. Therefore, further investigations on the cellular level to reveal the mechanisms are warranted. In this paper, a protocol based on the Langendorff retrograde perfusion method is introduced and some modifications in the depth of aorta cannulation and the steps that may affect the digestion process to isolate atrial and ventricular myocytes were simultaneously made. Moreover, the isolated cardiomyocytes are confirmed to be amenable to patch clamp investigation.

This protocol describes modifications of the Langendorff method including the depth of aorta cannulation for simultaneous Isolation of atrial and ventricular myocytes from adult mice.

Modifikationen der Langendorff-Methode zur gleichzeitigen Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus erwachsenen Mäusen

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...

Camera-based Measurements of Intracellular [Na+] in Murine Atrial Myocytes

Intracellular sodium concentration ([Na+]i) is an important regulator of intracellular Ca2+. Its study provides insight into the activation of the sarcolemmal Na+/Ca2+ exchanger, the behavior of voltage-gated Na+ channels and the Na+,K+-ATPase. Intracellular Ca2+ signaling is altered in atrial diseases such as atrial fibrillation. While many of the mechanisms underlying altered intracellular Ca2+ homeostasis are characterized, the role of [Na+]i and its dysregulation in atrial pathologies is poorly understood. [Na+]i in atrial myocytes increases in response to increasing stimulation rates. Responsiveness to external field stimulation is therefore crucial for [Na+]i measurements in these cells. In addition, the long preparation (dye-loading) and experiment duration (calibration) require an isolation protocol that yields atrial myocytes of exceptional quality. Due to the small size of mouse atria and the composition of the intercellular matrix, the isolation of high quality adult murine atrial myocytes is difficult. Here, we describe an optimized Langendorff-perfusion based isolation protocol that consistently delivers a high yield of high quality atrial murine myocytes.
Sodium-binding benzofuran isophthalate (SBFI) is the most commonly used fluorescent Na+ indicator. SBFI can be loaded into the cardiac myocyte either in its salt form through a glass pipette or as an acetoxymethyl (AM) ester that can penetrate the myocyte&#8217;s sarcolemmal membrane. Intracellularly, SBFI-AM is de-esterified by cytosolic esterases. Due to variabilities in membrane penetration and cytosolic de-esterification each cell has to be calibrated in situ. Typically, measurements of [Na+]i using SBFI whole-cell epifluorescence are performed using a photomultiplier tube (PMT). This experimental set-up allows for only one cell to be measured at one time. Due to the length of myocyte dye loading and the calibration following each experiment data yield is low. We therefore developed an EMCCD camera-based technique to measure [Na+]i. This approach permits simultaneous [Na+]i measurements in multiple myocytes thus significantly increasing experimental yield.

The intracellular Na+ concentration ([Na+]i) in cardiac myocytes is altered during cardiac diseases. [Na+]i is an important regulator of intracellular Ca2+. We introduce a novel approach to measure [Na+]i in freshly isolated murine atrial myocytes using an electron multiplying charged coupled device (EMCCD) camera and a rapid, controllable illuminator.

Intracellular sodium concentration ([Na+]i) is an important regulator of intracellular Ca2+. Its study provides insight into the activation of the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten aus Vibratome-Cut Myokardscheiben

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca

Zusammenfassung

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