Die Isolierung der vorhofen Myozyten für den Einsatz in Patch-Clamp-Experimenten hat unser Wissen und Verständnis der Vorhofelektrophysiologie sowohl auf zellulärer als auch auf molekularer Ebene erheblich erweitert. Der Ansatz, den wir effektiv verwenden, ergibt eine große Anzahl isolierter Vorhofmyozyten, die zur Untersuchung der zellulären Vorhofelektrophysiologie und Arrhythmogenese in einer Vielzahl experimenteller Modelle und Bedingungen verwendet werden können. Wir haben einen Ansatz zur Stammverdauung zur Isolierung von vorgerichtlichen Myozyten gewählt.
Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er es dem Forscher ermöglicht, die spezifische Region auszuwählen, die er untersuchen möchte. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung von Geräten und Lösungen, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie die Sezierenplatte, Sezieren Werkzeuge, eine Pasteur Pipette, und die Feuer poliert Pipetten.
Dieses Protokoll kann an männlichen oder weiblichen Wildtypmäusen, Mäusen mit genetischen Mutationen und Mausmodellen von Krankheiten durchgeführt werden. Nach der Euthanasie der Maus, wie im Textprotokoll beschrieben, legen Sie die Maus auf ein Papiertuch oder ein Korkbrett und kleben Sie die Pfoten nach unten, um die Maus an Ort und Stelle zu halten. Befeuchten Sie die Brust der Maus mit 70% Ethanol.
Entfernen Sie das Fell und die Haut, die die Brust mit einer gebogenen Schere bedecken. Als nächstes verwenden Rattenzahnzange, um das Brustbein zu heben und dann schneiden Sie die Membran entlang der Kante der Rippen. Entfernen Sie den gesamten Brustkorb mit einer gekrümmten Schere, um das Herz freizulegen.
Um das Vorhof-Anhängsgut zu entfernen, heben Sie das Anhängsgut vorsichtig mit feinen Sezierenderzangen an und schneiden Sie es mit einer Federschere aus. Übertragen Sie das vorgerichtliche Anhängszeichen sofort auf eine silikonbeschichtete Sezierschale, die 20 Milliliter erwärmte modifizierte Tyrodes pH 7.4-Lösung enthält. Platzieren Sie einen Sezierenden Stift an der Oberseite und einen Pin an der Unterseite der Öffnung des Vorhofanhängs.
Mit einer Pasteur-Pipette spülen Sie die Vorhöfe mit der gewärmt modifizierten tyrodien pH 7.4-Lösung, um das Blut zu entfernen. Öffnen Sie das Vorhofanhängsfeld, indem Sie an der oberen und unteren Kante entlang schneiden. Als nächstes heften Sie die Ecken des Vorhofanhängs nach unten, um ein flaches rechteckiges Stück Gewebe zu erstellen.
Schneiden Sie das Vorhofanhängsstand mit Federschere und feiner Zange in etwa acht bis zehn gleich große Streifen. Beachten Sie, dass die Streifen zusammenziehen, sobald sie frei vom Hauptstück des Gewebes geschnitten werden. Mit der kleinbohrten feuerpolierten Pipette die Gewebestreifen in das erste Rohr mit erwärmter modifizierter Tyrodes pH 6.9-Lösung zu übertragen.
Warten Sie fünf Minuten. Verwenden Sie nun die mittellange feuerpolierte Pipette, um die Gewebestreifen auf das zweite Runde bodengebundene Rohr mit modifizierter Tyrodes pH 6.9-Lösung zu übertragen. Um die Gewebestreifen zu waschen, kappen Sie das fünf Milliliter runde Unterrohr und invertieren Sie das Rohr dreimal.
Lassen Sie die Gewebestreifen an der Unterseite des Rohres absetzen, bevor Sie die Gewebestreifen mit der mittelbohrungsfeuerpolierten Pipette in das dritte Rohr übertragen. Waschen Sie die Streifen erneut durch Umkehrung. Dann übertragen Sie die Gewebestreifen in die Enzymlösung mit einer mittelgroßen feuerpolierten Pipette und inkubieren Für 30 Minuten.
Wirbeln Sie das Rohr alle drei bis fünf Minuten, um zu verhindern, dass die Gewebestreifen zusammenhaften. Zu Beginn der enzymatischen Verdauung setzen sich Gewebestreifen nach dem Wirbeln schnell ab. Bei ca. 20 Minuten Verdauung beginnen die Gewebestreifen nach dem Wirbeln in der enzymatischen Lösung zu schweben.
Während dieser Zeit ändern sich die Vorhofgewebestreifen auch im Aussehen von blassrosa zu weiß, wenn sie verdaut werden. Führen Sie nach der enzymatischen Verdauung drei Wälvorgänge mit 2,5 Milliliter KB-Lösung in den vorbereiteten fünf Milliliter runden Bodenröhren durch. Für jede Wäsche, sanft invertieren das Rohr dreimal vor dem Verschieben des Gewebes zum nächsten Rohr mit der mittleren Bohrung Feuer poliert Pipette.
Nach der Endwäsche die Streifen in das 14 Milliliter runde Unterrohr mit 2,5 Milliliter KB-Lösung geben. Warten Sie fünf Minuten. Das Gewebe mit der breitgebohrten, feuerpolierten Pipette 7,5 Minuten lang sanft trituieren.
Dadurch werden die Gewebestreifen mechanisch getrennt und eine trübe Lösung mit individuellen Vorhofmyozyten gefüllt. Die erste Trituration muss so zugeschnitten sein, dass sie eine große Anzahl von Zellen ohne Schäden an den Zellen ergibt. Berücksichtigen Sie Faktoren wie das Alter der Mäuse und den Krankheitszustand.
Passen Sie die Triturationskraft auf die individuelle Isolation zu, indem Sie sowohl die Frequenz als auch die Geschwindigkeit des Ausstoßens der Gewebestreifen aus der breitgebohrten, feuerpolierten Pipette verändern. Sanfte Trituration führt zu einer niedrigen Zellausbeute, während harte Trituration viele abgestorbene Zellen hervorbringt. Füllen Sie das 14 Milliliter runde Bodenrohr mit den trituierten Gewebestreifen mit KB-Lösung auf ein Endvolumen von sieben bis 10 Millilitern, abhängig von der gewünschten Dichte der Zellen für den experimentellen Einsatz.
Legen Sie dieses Rohr eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf. Nach dieser Inkubationszeit können Zellen für eine Vielzahl von Experimenten für bis zu sieben Stunden verwendet werden. Hier sind Beispiele für isolierte Vorhofmyozyten von normalen Mäusen zu sehen.
Isolierte Vorhofmyozyten sind in der Regel in der Größenordnung von 100 Mikrometern Länge und 10 Mikrometer in der Breite mit klaren Streifen. Die Kapazität isolierter Vorhofmyozyten beträgt typischerweise 40 bis 70 Picofaraden. Ein Beispiel für ein vorgerichtliches Myozyten-Aktionspotential, das mit der perforierten Patch-Clamp-Technik im aktuellen Klemmmodus aufgezeichnet wurde, wird gezeigt.
Eine repräsentative Familie von Natriumströmen wurde in der gesamten Zellkonfiguration der Patch-Clamp-Technik aufgezeichnet. Diese Ströme wurden mit 50 Millisekunden Spannungsklemmenschritten zwischen negativen 100 und positiven 10 Millivolt aus einem Haltepotential von negativen 120 Millivolt aufgezeichnet. Eine zusammenfassende Natriumstrom-Spannungsbeziehung wird hier vorgestellt.
Eine repräsentative Familie von Calciumströmen wurde mit 250 Millisekunden Spannungsklemmenschritten zwischen negativen 60 und positiven 80 Millivolt aus einem Haltepotential von negativen 70 Millivolt aufgezeichnet. Hier wird eine summarische Calciumstrom-Spannungsbeziehung angezeigt. Eine repräsentative Familie von Kaliumströmen wurde aus einem Haltepotential von negativen 80 Millivolt mit 500 Millisekunden Spannungsklemmenschritten zwischen negativen 120 Millivolt und positiven 80 Millivolt aufgezeichnet.
Hier wird die summarische Stromspannungsbeziehung für den gesamten Kaliumstrom angezeigt. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine erfolgreiche Myozytenisolation sowohl von einer geeigneten enzymatischen Verdauung als auch von der mechanischen Dissoziation der Zellen während der Trituration abhängt. Einmal isoliert, können Vorhofmyozyten in Patch-Clamp-Experimenten für die Messung von Aktionspotentialmorphologie und Ionische Ströme, wie Natriumströme, Kalziumströme und Kaliumströme verwendet werden.
Die Untersuchung von Veränderungen in der Vorhoffyzelektrophysiologie war wesentlich für die Bestimmung der zellulären und molekularen Grundlage lebensbedrohlicher Atrialarrhythmien und für die Entwicklung und Prüfung von antiarrhythmischen Verbindungen für Atrialarrhythmien.
