Dieses Protokoll arbeitet mit Proben aus menschlichen und tierischen Herzen, auch nach Stunden der Transportzeit. Bis zu 200 Myozyten pro Milligramm können aus Vibratom-geschnittenen Gewebescheiben isoliert werden. Elektrophysiologische, strukturelle und biochemische Analyse von Kardiomyozyten, hilft zu entdecken und besser zu verstehen, Mechanismen von Herzerkrankungen.
Nach dem Füllen einer 100-Millimeter-Gewebekulturschale mit 20 Milliliter kaltschneidender Lösung, legen Sie die Gewebeprobe in die Kulturschale. Halten Sie das Kulturgericht auf einem Teller auf 4 Grad Celsius abgekühlt. Denken Sie daran, dass lebende Gewebeproben von Tieren und insbesondere Menschen potenziell infektiös sind.
Verwenden Sie Schere oder Skalpell, um überschüssiges fibrotisches Gewebe und Epikardialfett aus der Probe zu entfernen. Für eine optimale Vibrambearbeitung größerer Gewebeproben verwenden Sie das Skalpell, um acht Millimeter Würfel aus dem Gewebe zu schneiden. Bei kleineren Proben aus Biopsien ist dies nicht erforderlich.
Man kann das Epikardium durch die Epikardialfettschicht identifizieren. Nach dem Entfernen überschüssiges Fett, legen Sie den Gewebeblock, in die Schale, mit dem Epikard. nach unten. Zur Vorbereitung auf die Gewebeeinbettung kochen 400 Milligramm Niedrigschmelzpunkt Agarose in zehn Milliliter Schneidlösung.
Füllen Sie eine Zehn-Milliliter-Spritze mit dem heiß aufgelösten Agarose-Gel. Versiegeln Sie die Spritze und legen Sie sie mindestens 15 Minuten in ein 37 Grad Celsius Warmwasserbad, damit die Agarose ausbaalten kann. Mit Zangen bewegen Sie die Trimmprobe in eine saubere 35-Millimeter-Gewebekulturschale, wobei das Epikard nach unten zeigt.
Dann entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Probe, mit einem sterilen Tupfer. Sichern Sie das Exemplar gegen Bewegung, indem Sie es mit Zange halten. Und leeren Sie die Spritze von Agarose darüber, um sicherzustellen, dass das Exemplar vollständig eingetaucht wird.
Die Schale sofort auf Eis legen und die Agarose 10 Minuten erstarren lassen. Montieren Sie eine unbenutzte Rasierklinge am Klingenhalter des Vibratom. Kalibrieren Sie nach Möglichkeit das Vibratom, indem Sie die Z-Umlenkung der Klinge einstellen.
Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Agarose-Gewebeblock zu verbrauchen, der auf den Probenhalter des Vibratom passt. Um die Stabilität zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass das Gewebe noch ausreichend in Agarose getaucht ist. Mit Agarose-Rändern von mindestens acht Millimetern.
Tragen Sie eine dünne Schicht Cyanoacrylatkleber auf den Probenhalter auf. Und drücken Sie vorsichtig den Agarose-Gewebeblock auf den Halter. Bauen Sie ein Vibratome-Bad mit Schneidlösung.
Dann füllen Sie den äußeren Kühltank des Vibratome mit zerkleinertem Eis, um eine Temperatur von vier bis sechs Grad Celsius während des gesamten Schneidprozesses zu halten. Legen Sie den Probenhalter, der den Agarose-Gewebeblock enthält, in das Vibrammebad. Erzeugen Sie anhand der im Manuskript beschriebenen Vibratome-Einstellungen 300 Mikroliter dicke Scheiben.
Es ist wichtig, Abschnitte im parallelen Epikardien zu erstellen, da dies die Art und Weise ist, wie Kardiomyozytenfasern in der ventrikulären Wand ausgerichtet sind. Andernfalls wird es zu viel Schaden geben. Verwenden Sie ein Standard-Lichtmikroskop, um die Ausrichtung der Kardiomyozyten und der Gewebescheiben zu überprüfen.
Um eine Beschädigung des Gewebes zu vermeiden, halten Sie die Agarose anstelle des Gewebes selbst. Eine Kardiomyozytenfasern, sollte gleichmäßig ausgerichtet sein und die Myozyten, sollte nicht kontrahiert werden. Legen Sie eine Wärmeplatte auf den Laborschüttler und erwärmen Sie sie auf 37 Grad Celsius.
Starten Sie den Labor-Shaker bei 65 RPM. Lösen Sie die Proteinase in zwei Milliliter Lösung eins auf. Und lösen Sie die Kollagenase, in zwei Milliliter Lösung eins.
Mischen Sie jedoch nicht die Proteinase und die Kollagenase. Fügen Sie der Kollagenaselösung Calciumchlorid für eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren hinzu. Inkubieren Sie beide Lösungen bei 37 Grad Celsius.
Verwenden Sie Zangen, um eine Gewebescheibe auf eine saubere 60-Millimeter-Gewebekulturschale zu übertragen. Mit fünf Millimetern vorgekühlter Schneidlösung. Halten Sie die Schale auf Eis oder eine kalte Platte, entfernen Sie vorsichtig die Agarose aus dem Gewebe, mit einer Klinge oder Zange.
Um die erste Wäsche der Gewebescheiben durchzuführen, legen Sie eine saubere 35-Millimeter-Gewebekulturschale auf die Heizklinge. Und füllen Sie es, mit zwei Millimetern vorgewärmtLösung eins. Übertragen Sie ein oder zwei Gewebescheiben auf die vorbereitete Schale.
Dann verwenden Sie eine ein Millimeter Pipette, für die Waschschritte. Nach dem Waschen der Scheiben, entfernen Sie Lösung eins aus der Schale und fügen Sie zwei Milliliter der Proteinase-Lösung. Inkubieren Sie die Scheiben für 12 Minuten auf der Hitzeklinge, mit dem Shaker bei 65 RPM.
Waschen Sie die Gewebescheiben zweimal mehr, mit zwei Millilitern vorgewärmter Lösung ein. Als nächstes entfernen Sie Lösung eins aus der Schale und fügen Sie zwei Milliliter Kollagenase-Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Scheiben für mindestens 30 Minuten auf der Hitzeklinge, mit Schütteln bei 65 RPM.
Nach 15 Minuten Inkubation, überprüfen Sie auf kostenlose einzelne Myozyten, indem Sie die Schale unter einem Lichtmikroskop untersuchen. Fahren Sie alle fünf Minuten mit der Überprüfung fort, bis einzelne Myozyten sichtbar sind. Dann, Alt-Verdauung durch Waschen der Scheiben zweimal, mit zwei Milliliter vorgewärmt Lösung zwei.
Und füllen Sie das Gericht mit zwei MilliliterN Lösung zwei. Ziehen Sie vorsichtig die Fasern der Gewebescheibe auseinander, mit feinen Zangen. Arbeiten Sie weiterhin sorgfältig, um eine Beschädigung der Kardiomyozyten zu vermeiden.
Und Pipette mehrmals, mit einer einzigen Verwendung an Ihrer Pipette vorbei. Bestätigen Sie dann, dass sich die stabförmigen Kardiomyozyten durch Untersuchung der Schale unter einem Lichtmikroskop getrennt haben. Legen Sie die Schale bei 37 Grad Celsius wieder auf die Hitzeplatte und erregen Sie durch Schütteln.
Durch Zugabe von 10 Millimolar und 100 Millimolar Calciumchlorid-Lagerlösungen, langsam erhöhen Die Kalziumkonzentration der Gewebesuspension von fünf Mikromolar auf 1,5 Millimolar. Wenn die Kalziumerhöhung abgeschlossen ist, verwenden Sie Zangen, um alle verbleibenden unverdauten Gewebestücke zu entfernen. Beenden Sie zunächst die Aufregung der Aufhängung.
Als nächstes, mit einer 1000 Mikroliter Pipette, langsam entfernen 1/3 der Lösung, von der Oberseite der Suspension. Vermeiden Sie das Streben der Kardiomyozyten. Dann 700 Mikroliter Lösung drei zu den Zellen hinzufügen.
Wiederholen Sie diese Waschschritte nach 10 Minuten Erregung. Übertragen Sie die Suspension in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr. Und lassen Sie die Kardiomyozyten bei Raumtemperatur sedimentieren, für mindestens 10 Minuten und maximal 30 Minuten.
Entfernen Sie den Überstand vollständig. Und setzen Sie das Pellet in modifizierter Tyrode-Lösung oder dem gewünschten Experimentierpuffer wieder auf. Überprüfen Sie mit einem Lichtmikroskop die Zellqualität.
30 bis 50% der Kardiomyozyten sollten stabförmig, glatt ohne Membranblebs sein. Und Display, klare Kreuz-Striationen. Um die Isolationseffizienz zu überprüfen, wurde das Protokoll auf Rattenmyokard angewendet.
Und verglichen mit der Isolierung durch koronare Perfusion und Isolierung, aus kleinen Gewebestücken. Ein geringerer Anteil von stabförmigen Zellen wurde bei der Verwendung des Protokolls beobachtet, dann nach der Isolierung durch Perfusion. Aber die Gesamtzahl war immer noch hoch.
Im Gegensatz dazu ergab die Isolierung von Gewebestücken weniger stabförmige Zellen. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Ergebnisse quantitativ zu vergleichen. Die Isolierung von Kardiomyozyten aus Gewebescheiben, erreicht nicht die Ausbeute durch koronare Perfusion erhalten.
Aber bietet, deutlich höhere Erträge als Myozyten-Isolierung, aus Gewebestücken. Als nächstes wurde das Protokoll auf humanes Myokard angewendet. Isolation von Myokardscheiben, ergab Hyde-Zahlen und einen großen Anteil an stabförmigen menschlichen Myozyten.
Und nur ein kleiner Teil der gerunde Cardiomyozyten. Die Isolierung von Myokardscheiben führte zu einer auffallend höheren Anzahl von stabförmigen Myozyten als die Isolierung von Gewebestücken. Die photometrische Quantifizierung bestätigte eine wesentlich höhere Myozytenlebensfähigkeit nach Isolierung von Myokardscheiben.
Menschliche Zellen, die mit dem beschriebenen Protokoll isoliert sind, können einer Strukturanalyse unterzogen werden. Alpha-Aktin-Färbung, zeigte ein dichtes regelmäßiges Z-Linienmuster und eine mittlere Sarcomere-Länge von 1,92 Mikrometern, in ruhenden Kardiomyozyten. LTCC und RyR Färbung, zeigte klare Cluster ist ko-lokalisiert in der Nähe der Zellmembran und T Tubules.
Die isolierten Kardiomyozyten waren erregbar und konnten für Studien zur zellulären Elektrophysiologie oder Anregungskontraktionskopplung verwendet werden. Aktionspotential Form und Dauer, war im Bereich von anderen berichtet, für ventrikuläre Kardiomyozyten, von versagenden menschlichen Herzen. Die Kalziumtransienten, die von Khan Vocal Line Scanning aufgenommen wurden, zeigten einen deutlichen Aufschlag nach der Stimulation.
Und, ein akzeptables Signal-Rausch-Verhältnis. Die Verkürzung der Kardiomyozyten durch Kontraktion kann durch die Umlenkung des unteren Zellrandes gesehen werden. Aufgrund der hohen Anzahl von Isolatoren Kardiomyozyten durch dieses Protokoll erhalten, Zellkultur ist möglich.
Dies kann Gentransfer, pharmakologische Tests und Gewebetechnik menschlicher Kardiomyozyten ermöglichen. Eine wichtige Anwendung ist die Überprüfung von Befunden aus Tiermodellen in menschlichen Zellen. Herzinsuffizienz ist ein klinisches Syndrom mit sehr begrenzten therapeutischen Möglichkeiten.
Verbesserte Kardiomyozyten-Isolationstechniken werden dazu beitragen, zelluläre Ziele für diagnose- und zukünftige Therapien zu identifizieren.
