Marc Wozniak für die Nutzung der Abteilung für Zell-und Entwicklungsbiologie Videografie Ausrüstung. Vanderbilt University Cell Imaging Shared Resource. Diese Arbeit wird von AHA Zuschuss 12PRE10950005 zu ERP, AHA Zuschuss 11GRNT7690040 DMB, NIH R01 HL037675 DMB unterstützt. DMB ist die Gladys P. Stahlman Lehrstuhl für Herz-Kreislauf-Forschung.

Sicherzustellen, dass alle Verfahren, die Tiere werden durch die entsprechenden Tier Verwendung zugelassen und Pflege Körper. 1. Bereiten Sie Vektor Puffer in Advance <ol><li> Herstellung von 2 L stock Ca 2 + frei Tyrode-(Tabelle 1). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4. </li><li> Herstellung von 2 L stock 1,2 mM Ca 2 + Tyrode-(Tabelle 2). Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4. </li></ol> 2. Am Tag des Experiments Bereiten Perfusion, Transfer, und die Verdauung Puffer <ol><li> Bereiten Sie 150 ml Perfusionspuffer in Ca 2 + frei Tyrode-(Tabelle 3) und durch ein 0,2 um Filter. </li><li> Vorbereitung 35 ml Ca 2 + Übertragungs freien &quot;Puffer A&quot; (Tabelle 4) und 25 ml Ca 2 + mit &quot;Puffer B&quot; (Tabelle 5). Filtern jeweils durch ein 0,2 um-Filter. </li><li> Werden die Lösungen von 00,06, 0,24, 0,6 und 1,2 mM Ca 2 + durch Mischen Puffer A und B pro Tabelle 6. </li><li> Vorbereitung 25 ml Aufschlusspuffer durch Auflösen von Verdauungsenzymen in 25 ml Perfusionspuffer (Tabelle 7), bezogen auf das Körpergewicht (BW) der Maus. Filtriert durch ein 0,2 um Filter vor der Verwendung. </li></ol> 3. Versuchsaufbau <ol><li> Zubauen einen konstanten Fluss Langendorff-Apparatur, im Handel erhältlich oder unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe, Schlauch und eine Wärmetauscherrohrschlange, um eine Fließgeschwindigkeit von 3 ml zu ermöglichen / min Spülflüssigkeit auf 37 ° C erhitzt. Eine einfache schematische in der Überprüfung im Jahr 2011 von den Bell, et al 18. </li><li> Eingestellt zirkulierenden Wasserbad Temperatur (~ 47 ° C) der Langendorff-Apparatur, so daß Ausströmen von der Kanüle ist bei 37 ° C bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml / min. </li><li> Führen Sie 70% Ethanol durch die Perfusion System für 15 Minuten, gefolgt von 100 ml Reinstwasser vom Typ I Wasser. Führen Perfusionspuffer durch die system für 5 min beim Beseitigen von Luftblasen. </li><li> Sterilisieren alle chirurgischen Werkzeugen mit einer gewünschten Methode. </li><li> Kanüle erstellen, indem ein kleines Stück (etwa 3 mm), PE-50-Schlauch an der Spitze einer 23 G Luer-Steckadapter. Wärme Spitze Schlauch an eine Lippe, über die der Aorta positioniert wird erstellen. </li></ol> 4. Cardiomyocyte Isolation <ol><li> Injizieren Maus mit 0,2 ml Heparinlösung (1000 IU / ml), durch intraperitoneale Injektion. </li><li> Nach 5 min zu betäuben Maus mit Isofluran. Wenn es vollständig betäubt (keine Reaktion auf den starken Fuß Prise), sprühen die Brust mit 70% EtOH. Öffnen Sie die Brust, schnell das Herz herauszuschneiden, man aufpassen, nicht die Aorta, und in 4 ° C Perfusionspuffer beschädigen. Verwenden einer gebogenen Pinzette zu greifen und zu heben unter dem Herzen. Das schafft Platz, um Anlagen hinter dem Herzen mit einer feinen Schere trimmen. </li><li> Kanülieren das Herz durch leichtes Greifen der Rand der Aorta mit zwei Paaren von feinen Pinzette und sorgfältig Ziehen des OPENing der Aorta über die Lippe der Kanüle. Sicherzustellen, dass die Spitze der Kanüle nicht über die Aortenklappe und in die Herzkammer, da dadurch die Durchblutung des Herzens über den Koronararterien zu inhibieren. </li><li> Sicherung der Aorta an der Kanüle durch das Binden einer Schleife von 5-0 Seidenfaden um die Aorta unmittelbar oberhalb der Lippe der Kanüle. </li><li> Hinweis: Die Schritte 4.2 bis 4.4 sollten so schnell wie möglich für beste Qualität Verdauung abgeschlossen sein. </li><li> Hinweis: Das Herz kann direkt auf die Kanüle bereits auf das Langendorff-Apparatur mit fließenden Perfusionspuffer befestigt aufgehängt werden. Jedoch hängt das Herz auf eine Kanüle zu einer kleinen Spritze von Perfusionspuffer unter einem Präpariermikroskop angebracht ist gefunden worden, am erfolgreichsten. Dies ermöglicht eine kleine Menge Perfusionspuffer durchgeschoben werden, gerade für die Reinigung der Koronararterien und Herz Gewährleistung fest mit Kanüle befestigt. Die Kanüle wird dann hing an der Langendorff-Perfusion mit Laufpuffer. </li><li> PerfuseDas Herz mit Ca2 + freien Puffer Perfusion bei einem Fluß von 3 ml / min für 2-3 min. </li><li> Wechseln, um die Verdauung Enzym und Puffer für 7-10 min durchströmen, werden Herz weicher und heller in der Farbe. </li><li> Hinweis: Verdauungszeit kann auf der Grundlage der Enzymaktivität und Herzgröße eingestellt werden. </li><li> Sobald Herz ist spürbar schlaff, zu entfernen Herz aus Kanüle und in eine sterile p60 Gericht mit Puffer A (Ca 2 + ablösefrei Puffer). </li><li> Entfernen Vorhöfe und der großen Gefäße. Entfernen rechten Herzkammer, wenn gewünscht. Mit einer Pinzette, trennen die Kammer in kleine Stücke. Pipette mehrmals mit einer sterilen 5 ml Transferpipette weiter zerstreuen Zellen. </li><li> Filtern der Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen durch ein 250 um Nylonmaschenfilter. </li><li> Ermöglichen die Suspension für etwa 10 Minuten zu pelletieren. </li><li> Übertragen Sie die Pellets in der 0,06 mM Ca 2 +-Lösung. Sodass die Zellen für 10 min pelletieren. Gesunde Zellen werden pelletieren, während die meisten toten Zellen zu schweben. </li&gt; <li> Saugen Sie den Überstand, und übertragen Sie die Pellets in der 0,24 mM Ca 2 +-Lösung. </li><li> Wiederholen Sie 10 min Inkubation, Aspiration, und übertragen Sie durch die verbleibenden zwei Ca 2 +-Lösungen, bis die Zellen sind in der 1,2 mM Lösung. An diesem Punkt sollte die Mehrzahl der stabförmigen Zellen Myozyten sind. </li></ol> 5. Mess Kontraktilität und Calcium Transienten <ol><li> Anmerkung: sind Kontraktilität und Calcium Transienten gleichzeitig gemessen werden können. </li><li> Vorbereitung Fura-2 AM-Lösung durch Resuspendieren in wasserfreiem DMSO auf eine Konzentration von 1 ug / ul. Fura-2-AM-Lösung kann in einem Exsikkator bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Last 1 ml suspendierten Zellen mit 1 ul Fura-2 AM. Sodass die Zellen in dunkel 10 min und dann gründlich absaugen Überstand sitzen. Zweimal waschen mit Ca 2 + Tyrode-Lösung, so dass Zellen, die in der Dunkelheit für 10 Minuten zwischen den Waschgängen zu pelletieren. </li><li> Legen Sie ein Deckglas in einem Stadium, Einsatz, beheizten pe ermöglichtrfusion / Aspiration und Elektrode Stimulation mit einem myocyte Feld Stimulator. Ort Tischeinsatz auf inverse Mikroskop für Fluoreszenzmessung eingestellt, indem Sie einen Tropfen Öl auf die Linse, wenn unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektiv. </li><li> Bis beheizten Schwerkraft Perfusion mit 1,2 mM Ca 2 + Tyrode-Lösung so eingestellt, Lösung auf der Bühne erreicht 37 ° C. Bringen Anspruch, Vakuum. Bringen Elektroden. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop-System, und öffnen Sie die ratiometrischen Fluoreszenz und Zell Dimensionierung Datenerfassungssoftware. </li><li> Fügen Sie ein paar Tropfen des Fura-2 AM beladenen Zellen auf die Bühne Einsatz, Sperrung Durchblutung vorübergehend, damit die gesunden Zellen zu begleichen. </li><li> Verwenden, um die gewünschten Ziel 40X Zelle zu lokalisieren. Eine gesunde Zelle sollte stabförmigen und nicht spontan kontra. Es sollte sichtbar und gleichmäßig zusammenziehen, wenn Zelle bei 5-20 V. Tempo </li><li> Hinweis: Physiologische Analyse erfordert eine hohe Qualität der Verdauung. Es ist möglich, Zellen, die gesund aussehen, aber nicht pa haben<html> gut CE-Kennzeichnung für physiologische Analyse. Verdauung Protokoll kann verlangen, Verfeinerung, um qualitativ hochwertige, gesunde Muskelzellen zu erhalten. Zusätzlich kann Mutante oder kranken Herzen Änderungen des Protokolls erfordern. </li><li> Adjust Linsendrehung und Veränderung Blende so gewünschte Zelle wird horizontal auf dem Bildschirm und Hintergrund ausgekleidet ist nicht sichtbar. </li><li> Richten Kantenerkennung Bars an jedem Ende der Myozyten und passen Schwelle. Richten Sarkomer Erkennung auf einem Teil der Zelle mit einheitlichen Sarkomere. Je länger Sie diese bar zu machen, desto genauer wird das mathematische Modell der Sarkomerlänge sein, solange es nicht auf zwei Populationen von Sarkomere. </li><li> Tempo-Zellen mit 2 Hz und 5-20 V für 10-15 Sekunden vor der Aufnahme. </li><li> Rekordverfolgung. Umgebungslicht sollte die besten Kalzium-Transienten-Aufzeichnung minimiert werden. </li></ol> 6. Analyse <ol><li> Analysieren Sie mit ratiometrischen Fluoreszenzspuren und Zell Dimensionierung Datenerfassungssoftware. </li></ol>Titel &quot;&gt; 7. Weitere Studien <ol><li> Dieses Protokoll stellt überschüssige Zellen, die für eine Vielzahl von anderen Experimenten verwendet werden können, einschließlich: Fixierung und Immunfärbung Beurteilung direkte Arzneimittelwirkungen, Kurzzeitkultur, und Atomkraftmikroskopie. </li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF23+is+a+novel+regulator+of+intracellular+calcium+and+cardiac+contractility+in+addition+to+cardiac+hypertophy.">FGF23 is a novel regulator of intracellular calcium and cardiac contractility in addition to cardiac hypertophy.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. , (2013).</li><li>Helmes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titin+Determines+the+Frank-Starling+Relation+in+Early+Diastole.">Titin Determines the Frank-Starling Relation in Early Diastole.</a> The Journal of General Physiology. 121, 97-110 (2003).</li><li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+heart+perfusion:+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion.">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 940-950 (2011).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302 (2011).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Isolation von Kardiomyozyten Qualität erfordert ein gewisses Maß an Übung und Optimierung. Dieses Protokoll enthält die wichtigsten Schritte, die das Ergebnis der Verdauung wesentlich beeinflussen können. Diese sollten bei der Durchführung und Fehlersuche das Protokoll sorgfältig geprüft werden. Die Zeit von der Entfernung des Herzens Kanülierung und Perfusion sollte minimiert werden, idealerweise weniger als fünf Minuten. Spülen des Herz sofort in eiskaltem Perfusionspuffer nach dem Entfernen von der Maus un...

Cardiomyocytes provide the contractile force for the heart. Each myocyte contains organized cytoskeletal and contractile elements essential to contraction. The heart not only contains cardiomyocytes but also fibroblasts, connective tissue, and modified myocytes such as Purkinje fibers. Changes in any or all of these cell types can be seen in heart failure, making determination of the ultimate cause of heart dysfunction difficult. Decreased ventricular contractility of a failing heart is preceded by varying degrees of fibrous tissue build-up and hypertrophy and dysfunction of the cardiomyocytes1. Arrhythmias can be caused by dysfunction in the conducting cells2, fibrosis interrupting cardiac conduction3, or changes in the expression of ion channels in cardiomyocytes1,4. Indeed, these problems often co-exist in a complicated fashion.
Isolating and studying cardiomyocytes allows one to examine contractile and electrical dysfunction of individual myocytes in the context of overall heart function. Techniques to isolate individual cardiac myocytes were developed over 40 years ago in an effort to better study physiology of this &#8216;workhorse&#8217; cell of the heart. Isolation techniques have been improved to increase yield and quality of cells, with the vital development of coronary perfusion via cannulation of the aorta, first performed in 19705. This article describes cardiomyocyte isolation followed by measurement of contractility and calcium transients using ratiometric fluorescence and cell dimensioning data acquisition software. In both genetic and environmental models of heart disease, utilizing this protocol provides key information about cell contractility, sarcomeric contractility and relaxation, calcium transients, and cytoskeletal disruption. This system is often used to test the effect of drugs on isolated cardiomyocytes6,7. We employ the system to compare contractility and calcium transients of cardiomyocytes between wild type mice and mice with a mutation leading to dilated cardiomyopathy.
Studying individual cardiac myocytes has numerous advantages over other commonly used methods to study cardiac anatomy and physiology. Echocardiography and electrocardiography provide information about the contractile function and electrical conduction of the heart overall. Neither of these methods explains the cause or nature of the dysfunction below the level of the whole organ. Measuring contractility of individual cardiomyocytes using edge-detection and sarcomere length algorithms can demonstrate that changes within the contractile cell of the heart are present within global heart dysfunction. Measuring calcium transients demonstrates the influence of changes in ion flux at a cellular level to contractile dysfunction or arrhythmias.
In addition to complementing whole organ studies, this protocol provides cells easily stained for sub-cellular components. It is possible to see cytoskeletal changes by staining tissue sections of the whole heart; however, one is only able to visualize a cross section of cells. A whole cardiomyocyte is thicker than the typical tissue section, and given the arrangement and length of the cardiomyocytes, it is difficult to see whole cells in a single section. Isolated cardiomyocytes can be fixed immediately and stained for a variety of cytoskeletal elements and ion channels. Confocal images can be compiled into full thickness z-stacks of the cell. Additionally, staining isolated cardiac myocytes allows for staining of components that are impossible to visualize in sections, such as the membrane invaginations known as t-tubules.
Cultured cell lines of cardiac myocytes do exist, some of which have similar transcriptional profiles and phenotypic features to cardiac myocytes. Some, such as the HL-1 cell line, even retain some sarcomeric organization and rudimentary contractile ability8. Despite these qualities, cultured cells lack the &#8220;box car&#8221; shape and t-tubule structure of cardiomyocytes and have less sarcomeric organization. These components are essential to the function of cardiomyocytes in vivo. In addition, using cultured cells allows genetic manipulation but not in vivo physiologic manipulation. Isolated cardiomyocytes retain their cellular organization long enough to study but are still easily imaged and even transduced9. 
Isolated cardiomyocytes are extremely versatile, providing a substrate to identically analyze cells from varied experimental conditions. Isolation and physiological analysis of myocytes have been used by countless labs for a variety of experiments including studying the effect of drugs6,7 or small molecules10, environmental stressors11, infection12, illness13, or genetic mutation14,15 on contractility and/or calcium transients and studying the regulation of contractility and calcium release within a cardiomyocyte15-17. With the application of any of these stressors, changes in heart function could be due to any combination of changes in the cardiomyocytes themselves and changes in the surrounding environment of the heart, such as scarring, changes in conductivity, or changes to the extracellular matrix. This is an ideal protocol for answering research questions regarding individual myocyte structure and function in the context of heart failure from any cause.
Although it has countless advantages over other techniques, physiological analysis of isolated cardiomyocytes is not ideal for every research question. Isolation is a terminal procedure, thus cardiomyocytes can only be assessed at one time in the mouse&#8217;s life. This can be partially overcome using cohorts and sacrificing individual mice along the course of illness development or by monitoring the mouse to determine whether it has clinically significant heart failure before isolation. Although this protocol can determine whether cardiomyocyte dysfunction has occurred, one cannot draw the conclusion that this dysfunction is the root cause of heart failure without additional experimental information. It is possible that cardiomyocyte dysfunction itself is secondary to other changes in the heart. Despite these challenges, studying cardiomyocytes offers valuable information in determining the nature of dysfunction in the heart, especially when combined with other experiments. 
The following protocol is adapted from one provided by Dr. Chee Lim, Vanderbilt University. Although contractility and calcium flux data are highly reproducible and useful in comparing hearts with genetic or environmental manipulation, isolation itself remains a technique dependent protocol, requiring optimization. Minimizing the time between removing the heart from the mouse and perfusing the heart via aortic cannulation is essential for a quality digestion. In addition, digestion time and enzyme concentration can be optimized for the highest quality myocytes. Steps likely requiring optimization, along with suggestions for optimization, are noted below.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">NaCl</td>
			<td style="width:221px;">RPI</td>
			<td style="width:159px;">S23020</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">KCl</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P-3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:253px;">MgCl2</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">M-8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">HEPES</td>
			<td style="width:221px;">EM Science</td>
			<td style="width:159px;">S320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:253px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:253px;">CaCl2 &#376; 2H2O</td>
			<td style="width:221px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">C79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">2,3-Butanedione-monoxime (BDM)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">Taurine</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">T-0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">A-7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">Collagenase B</td>
			<td style="width:221px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">1-088-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:221px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:159px;">1-088-882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">Protease XIV</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P-5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">Heparin</td>
			<td style="width:221px;">APP Pharmaceuticals, LLC</td>
			<td style="width:159px;">401586D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:221px;">Butler Schein</td>
			<td style="width:159px;">11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:221px;">Teflabs</td>
			<td style="width:159px;">103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">DMSO &#8211; anhydrous</td>
			<td style="width:221px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:253px;">IonOptix cell pacing and fluorescent analysis system</td>
			<td style="width:221px;">IonOptix</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">250 um nylon mesh filter</td>
			<td style="width:221px;">Sefar America</td>
			<td style="width:159px;">Lab Pak 03-250/50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">23G leur-stub adaptor</td>
			<td style="width:221px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:159px;">1482619E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:253px;">PE-50 tubing</td>
			<td style="width:221px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:159px;">427410</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Sobald die Kontraktilität und transiente Kurven werden gesammelt (Abbildung 2), werden die Daten einfach mit der geeigneten Software analysiert. Die gesamte Ablaufverfolgung oder Teile davon können gemittelt werden (Abbildung 3). Kontraktilität kann in einer Vielzahl von Weisen analysiert werden. Systolischen Funktion kann man die Stärke der Kontraktion mit fraktionelle Verkürzung oder Kontraktionsgeschwindigkeit mit der Zeit bis zum Peak Verkürzung und Kontraktionsgeschwindigkeit...

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Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

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