Die Autoren möchten sich die Mitglieder des Dowling Labor (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta und William Telfer), die zur Entwicklung der Technik und der Herstellung des Manuskripts beigetragen haben. Diese Arbeit wurde von der Taubman-Institut, der Abteilung für Pädiatrie an der University of Michigan, und zum Teil aus Zuschüssen von der Gesellschaft für Muskeldystrophie (JJD MDA186999) und den National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835) finanziert.

1. Herstellung von Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser (Dauer: 1 h) Deckbeschichtung ermöglicht eine schnelle Einschwingzeit myofiber und Haftung. Dies kann während der Dissoziationsstufe der myofiber Trennung (Schritt 2 unten) durchgeführt werden. <ol><li> Schneiden und Parafilm auf dem Boden einer 60 mm Petrischale (alle Marken). </li><li> Zeigen Mikroskop Deckglas rutscht (12 mm Durchmesser) auf Parafilm in einer 60-mm-Gewebekulturschale oder sie einzeln in einzelnen Wells der 24-Well-Platten. </li></ol> Anmerkung 1: Diese kleine, runde Deckgläser helfen, myofiber Zahlen konzentrieren und reduzieren überschüssige Antikörper Nutzung. Hinweis 2: Andere Größe Deck funktionieren wird, jedoch werden die Volumina der Reagenzien und Embryonen verwendet werden, müssen entsprechend angepasst werden. <ol start="3"><li> Pipette 50-200 ul Poly-L-Lysin-Lösung (0,01%) auf jedem Deckglas in der Petrischale. </li><li> Lassen Sie die Deckgläser zu sitzen mindestens eine hour bei 37 ° C. Längere Inkubationen nicht negativ beeinflussen Ergebnisse. </li><li> Entfernen Poly-L-Lysin-Lösung aus dem Deckglas und zweimal waschen mit einem Minimum von 100 ul 1x PBS. </li><li> Deck ermöglichen zu trocknen. </li><li> Die Deckgläser sind nun bereit für Muskelfasern. </li></ol> Hinweis 3: Um die Sterilität zu gewährleisten, kann die Beschichtung in einer Haube und autoklaviert Deckgläschen durchgeführt werden. Anmerkung 4: Halten Sie die 60 mm Petrischale mit Parafilm auf der Unterseite. Dieses Setup wird während myofiber Beschichtungs-und Immunmarkierung (später Stufen) verwendet werden. Alternative 1: Statt der Deckbeschichtung unmittelbar vor der Anwendung kann eine beschichtete Deck Lager verwendet werden. Eine 60 mm-Petrischale, die ein Minimum von 2 ml Poly-L-Lysin kann bei 4 ° C mit zahlreichen Deck gespeichert werden. Bei dieser Alternative beginnen Sie mit Schritt 1,5 bis die Deckgläser für Muskelfasern zu verarbeiten. Alternative 2: Wir haben auch Decklack in Poly-L-Ornithin. Tseiner ist arbeitsintensiv, aber ist nützlich für längerfristige Kultivierung da Poly-L-Ornithin-beschichteten Deckgläsern können UV behandelt sein. Mit UV-Behandlung und sorgfältige steriler Technik Live Muskelfasern können in der Regel in der Kultur 4-7 Tage aufrecht erhalten werden. 2. Die Dissoziation von Zebrafischembryonen und Oberflächen von Muskelfasern (Dauer: 1 bis 3 Std.) Hinweis: Die Standard-Protokoll gilt besten bis 3 dpf (Tage nach der Befruchtung) Embryonen. <ol><li> Übertragen Zebrafischembryonen in ein Standard 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie so viel überschüssige Wasser Fische wie möglich. Typischerweise können 10-20 Embryos pro Rohr, wenn auch weniger eingesetzt werden. Verwendung von mehr als 20-25 Embryonen führt oft zu einer Herstellung von übermäßiger Dichte. <ol><li> Chorion vor der Dissoziation entfernen, manuell mit Nr. 5 Pinzette. Alternativ wird chemische Chorion Entfernung mit 10-15 min Pronase Behandlung erreicht. Typischerweise wird die vorherige Entfernung der Chorion nur notwendig, wenn vor der Bestätigung des MUTant Phänotyp oder Morphologie erforderlich ist, oder bei der Verwendung Bühnen, auf denen Embryonen werden natürlich von ihren Chorion geschlüpft. </li></ol></li><li> In 900 ul der CO 2-unabhängigen Medien an der Röhre, die die Embryonen. </li><li> 100 l Collagenase Typ II, Endkonzentration 3,125 mg / ml (Auf Collagenase-Lösung mit 31,25 mg / ml in 1x PBS), um die Dissoziation zu beginnen. Collagenase IV auch zur Spaltung verwendet werden. </li><li> Drehen Embryonen auf einem Orbitalschüttler und verreiben alle 30 min bei RT mit einem Pipetman P1000 für das Verreiben. </li></ol> Hinweis 2: Embryo Dissoziation sorgfältig zu überwachen; über oder unter Dissoziation (vor allem über) sind die häufigsten Gründe für die Protokoll-Fehler. Zeiten für die Verdauung wird je nach Intensität der Verreibung, die Anzahl der Embryonen pro Röhrchen und Alter des Embryos variieren. Es ist auch oft weniger (im Vergleich zu Wildtypen) für Embryonen aus der Skelettmuskulatur Mutanten. Anmerkung3: Durchschnittlich Verdauungszeit pro Embryoalter: 1 dpf = 1 h, 2 dpf = 1,5 h, 3 dpf = 2 h und 4 dpf = 2-2,5 Stunden. <ol start="5"><li> Stoppen Sie die Verdauung, wenn keine ganze Embryonen sind sichtbar, aber feste Stücke sind noch sichtbar - das ist wichtig, overdigestion verhindern. </li><li> Zentrifugenröhrchen mit dissoziierten Embryonen bei 0,8 bis 2,3 g für 3-5 min auf Pellet-Zellen. </li><li> Überstand entfernen von pelletierten Zellen und waschen 2x mit CO 2 unabhängige Medien. </li><li> Add frischen CO 2 unabhängige Medien, um Zellen zu resuspendieren. 1 ml wird typischerweise für Preps von 10-20 Embryonen verwendet. Die Lautstärke kann auf Basis Embryo Anzahl skaliert werden. </li><li> Mit einer Pipette P1000, vorbei Embryo Suspension durch ein 70-um-Filter. Dies hilft, entfernen Sie unerwünschte Ablagerungen aus dem prep. </li></ol> Anmerkung 4: Embryo Suspension kann ein zweites Mal durch ein 40-um-Filter gefiltert, um weiter zu entfernen unerwünschte Ablagerungen werden. Von einem Doppelfiltration, ist die Wiederherstellung approximLICH 800 ul von einem Ausgangsvolumen von 1 ml. <ol start="10"><li> Füllen Sie ungefähr 50-100 ul myofiber Suspension in jede Poly-L-Lysin beschichteten Deckglas. </li></ol> Anmerkung 5: Führen Sie den Schritt 2.9 in die Petrischalen mit Parafilm auf dem Boden, die zuvor vorbereitet. Der Parafilm hält die Aussetzung myofiber Verlaufen die beschichtete Deckgläser. Halten Petrischalen abgedeckt, um Verdunstung zu verhindern. <ol start="11"><li> Lassen Muskelfasern auf ca. 1 Stunde auf die beschichtete Deckgläser bei Raumtemperatur zu regeln. </li></ol> Anmerkung 6: Muskelfasern beginnen, innerhalb von 5-10 min zu begleichen. Doch für gute myofiber Anhang, mindestens 1 h (02.01 h) wird empfohlen. Zulassen von Muskelfasern, für längere begleichen werden nicht schaden, die prep. Für längere Inkubationen (inkl. Übernachtung), können Antibiotika zu den Medien geben. Mit Antibiotika und steriler Technik lebenden Kulturen typischerweise für 1-2 Tage gehalten. <ol start="12"><li> Live-myofibers kann an dieser Stelle beobachtet werden. Muskelfasern aus Embryonen 2 dpf und wird später als Rillen und längliche Zellen (Fig. 1) zu sehen. An diesem Punkt sind nun bereit für die Live-Muskelfasern Analyse oder zur Immunmarkierung. </li></ol> Anmerkung 7: Die Skelettmuskulatur von 1 dpf Embryonen nicht als Lang und deutlich quergestreiften Fasern plattieren. Stattdessen sind groß myoballs sichtbar. Zusätzlich wird während der Pelletierung Phase Post-Dissoziation (Schritt 2.6), 1 dpf myoballs müssen für ein Minimum von 8 min bei 5.000 g zentrifugiert, um ein Pellet zu erreichen. Für die Analyse von Embryonen in diesem Stadium, ist es empfehlenswert, den transgenen Linie EGFP speziell im Skelettmuskel 23 zu verwenden. Dies wird Identifikation von Zellen aus Muskel Herkunft im Vergleich zu anderen Quellen zu ermöglichen. 3. Fluoreszenz-Immunfärbung von Dissoziierte Zebrafisch Muskelfasern (Dauer: ca. 1 Tag) 3.1. Immunomarkierung <ol><li> Einen Teil entfernenMedien von Muskelfasern auf die beschichtete Deckglas geklebt </li><li> Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd oder Methanol. Für PFA, ½ Volumen der Medien entfernen und ersetzen mit der gleichen Menge an PFA. Fix für 10 min bei RT, dann entfernen Gesamtvolumen, ersetzen mit 50-100 ul PFA, und befestigen Sie für weitere 10 min. Alkoholfixierung, eiskaltem Methanol oder Aceton bei 4 ° C für 10 min oder 5 min aufgebracht werden, auf. </li><li> Muskelfasern mindestens 3-5x mit 1x PBS oder 1x PBS plus 0,1% Tween waschen. Durchschnittliche Waschvolumen beträgt 50-100 ul pro Deckglas. </li><li> In Blocklösung zu Muskelfasern (Arbeits Lager) und Inkubation von 20-60 min bei Raumtemperatur. Blockierungslösung wird je nach den primären und sekundären Antikörper variieren. Die beiden häufigsten im Labor verwendet werden, sind (1) 1 × PBS, 2 mg / ml BSA, 1% Schafserum, 0,25% Triton X-100 final und (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % BSA) und 5% Schaf / Ziegenserum. </li><li> Blockierlösung entfernen und hinzufügen primären Antikörper entweder b verdünntVerriegelungslösung oder PBS. Muskelfasern über Nacht Inkubation bei 4 ° C. Stellen Sie sicher, dass Sie entweder Parafilm oder wickeln Sie sie in Frischhaltefolie die Petrischale mit den myofiber belasteten Deckgläser mit einem Antikörper beschichtet. Kleine Stücke von angefeuchteten Papiertuch kann hinzugefügt werden, um eine befeuchtete Kammer zu erzeugen. </li><li> Entfernen primären Antikörper aus Deckgläser Deckgläser und waschen 3-5x für 5 min mit PBS oder Blocking-Lösung. </li><li> In sekundären Antikörper in geeigneter Konzentration in 1x PBS oder Blockierungslösung für 1-2 h bei RT verdünnt. </li><li> Sekundärantikörper entfernen und waschen Muskelfasern 3-5x in PBS für jeweils 5 min bei RT. </li></ol> 3.2. Montagedeck <ol start="9"><li> 1-2 Tropfen Antifade Reagenz auf einen Objektträger. </li><li> Sorgfältig Abholung der beschichteten und immunolabled Deckglas mit einer Pinzette und Ort (Muskelfasern nach unten) das Deckglas auf der Antifade Reagenz auf dem Objektträger. </li></ol> Anmerkung 1: Die Beachtung der Ausrichtung der coated Deck ist kritisch. <ol start="11"><li> Legen 1-2 Kimwipes auf eine harte feste Oberfläche. Invertieren Sie schnell den Schlitten mit den beschichteten Deckgläser auf der Antifade Reagenz ruht und legen Sie es (Deckglas nach unten) auf der Kimwipes. </li><li> Wenden Sie leichten Druck auf die Ecken des Mikroskop-Objektträger, um überschüssige Antifade entfernen und eine gute Abdichtung zu bilden zwischen dem Schieber und Deckglas </li><li> Veröffentlichung der verbleibende, für 5-10 min bei RT trocknen Antifade, dann die Muskelfasern sind bereit, Bild (2A und B) oder bei 4 ° C </li></ol> 4. Live Cell Calcium Imaging Mit GCaMP3 Lebendzellexperimenten auf Muskelfasern vor der Fixierung (nach Schritt 2.10) durchgeführt werden. Das folgende Protokoll beschreibt die Live-Darstellung in Muskelfasern exprimieren GCaMP3 24, eine genetisch kodierte Kalzium-Indikator, der Skelettmuskel-spezifischen Zebrafisch-α-Aktin-Promotor (PSKM) 23 ausgedrückt. AlternativDieses Verfahren kann leicht angepasst werden, um Calcium-Indikator-Farbstoffe, wie Fura-2 verwendet werden. <ol><li> Inject Embryonen mit PSKM: GCaMP3 bauen an der 1-2 Zell-Stadium </li><li> Bei 3 dpf, sammeln und bereiten Larven Muskelfasern wie in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben. Muskelfasern zu ermöglichen für ein Minimum von 1 Stunde zu halten. Für diese Technik bereitet Deckgläschen in 24-Well-Platten erforderlich. </li><li> Überschüssiges Material vorsichtig entfernen, und 300 ml frisches CO 2 unabhängige Medien bei RT. </li><li> Beachten Zellen unter einem inversen Mikroskop. GCaMP3 positive Muskelfasern sollte unter grünen Fluoreszenz sichtbar sein. </li><li> Richten Sie die Kamera für die Aufnahme, wenn gewünscht. </li><li> Bereiten Sie eine 30 mM Koffein-Lösung in CO 2 unabhängige Medien. Um Zellen zu stimulieren, sanft Pipette 300 ul von Koffein-Lösung in die gut unter Vergrößerung. Innerhalb von 5-10 sec, soll GCaMP positiven Muskelfasern Koffein mit einem schnellen Anstieg der Fluoreszenz (Fig. 3) zu reagieren. Myofibten kann auch schrumpfen. Zu beachten ist, induziert Koffein Calcium-Freisetzung aus den Retikulum speichert 25. Andere Mittel, wie KCl 26 und Ryanodin-4, verwendet werden, um induzierbare Calciumfreisetzung zu untersuchen. </li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs.">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li><li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture.">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li><li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation.">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical,+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies.">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li><li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Ca2+-conducting+Ca2++channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling.">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine widerstreitenden Interessen.

Zebrafische sind ein leistungsfähiges Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der Muskelentwicklung und Funktion in vivo 25,27,28. Sie haben auch gezeigt, als ein wertvolles Gut für die Modellierung menschlichen Muskelerkrankungen 14,15,20,29. Während große Schritte unternommen wurden, um die Nutzung und Anwendung der Zebrafisch für die Untersuchung der Muskelfunktion und Muskelerkrankungen voranzubringen, gibt es eine ständige kritische Notwendigkeit, Werkzeuge, die mehr in di...

Die Skelettmuskulatur ist ein hoch spezialisiertes Gewebe für die Erzeugung der für die Motilität notwendig Kontraktionskräfte verantwortlich. Die Kontraktion wird durch einen Prozess wie Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung, die elektrische Signale an Calcium-Freisetzung aus intrazellulären Speichern 1,2 wandelt bekannt initiiert. Intrazelluläre Calcium-Freisetzung aktiviert die Sarkomer zu verkürzen und zu erzeugen Kraft. Die vielen spezifischen Komponenten der molekularen Maschinen für die Vermittlung der neuromuskulären Synapse Getriebe 3 EG-Kupplung 4,5, und Aktin-Myosin-abhängigen Kontraktionen 6 verantwortlich weiterhin die anhaltende Gegenstand intensiver Forschung. Darüber hinaus Proteine, die die Muskelmembran während der Kontraktion 7,8 und dieser mittelbaren Signalisierung zwischen der myofiber und der extrazellulären Matrix 7,9 stabilisieren wurden identifiziert und untersucht im Detail. Mutationen in mehreren Genen, die für ein Muskelstrukturnd Funktion haben als Ursachen der menschlichen Skelettmuskelerkrankungen identifiziert ( <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ). Diese Krankheiten, allgemein als Skelett Myopathien und Muskeldystrophien, basierend auf klinischen und histopathologischen Merkmalen klassifiziert, werden mit Muskelschwäche, lebenslange Behinderung und frühe Sterblichkeit 10,11 verbunden. Der Zebrafisch hat sich als ein hervorragendes System zur Modellierung und Untersuchung der menschlichen Skelettmuskelerkrankungen 8,12,13 sein. Es wurde eingesetzt, um neue Gen-Mutationen 8 validieren, definieren neue Aspekte der Krankheit Pathophysiologie 14,15, zu erkennen und neue Therapieansätze 15,16. Die Leistung des Zebrafisches zur Untersuchung menschlicher Muskelerkrankung bezieht sich auf die große Anzahl von Nachkommen, die rasche Entwicklung der Muskelstruktur und-funktion, die optische Klarheit des Zebrafischembryos, und der Leichtigkeit der genetischen und pharmakologischen Manipulation der EntwicklungszebraFisch 17. Wir und andere 12,18,19 haben vor kurzem eine einfache Technik für die schnelle und effiziente Isolierung von Muskelfasern aus dem Zebrafisch-Entwicklung entwickelt. Diese Methode wurde die Prüfung von Muskelfasern näher, als durch ganze Embryo Analyse zur Verfügung gestellt werden aktiviert. Die Technik hat sich für die Charakterisierung von Protein subzelluläre Lokalisation 20 als auch für die Identifizierung von wichtigen histopathologischen Merkmale als Teil der Validierungsstudien in neu entwickelten Krankheitsmodelle 21 genutzt. Darüber hinaus können isolierte Muskelfasern zusätzlich für Live-Bildgebung und für elektrophysiologische Studien 22, Techniken, die für die Abfrage der Schlüsselaspekte der Muskelfunktion ermöglichen verwendet werden. Das spezifische Protokoll für myofiber Isolierung sowie zwei Beispiele für nachfolgende analytische Experimente ist in den übrigen Teilen des Manuskripts detailliert.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Invitrogen Gibco</td>
			<td>70011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Independent medium</td>
			<td>Invitrogen Gibco</td>
			<td>18045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004186</td>
			<td>Lot 41H12764</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>L5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>12-545-82 12CIR-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Filter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Filter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-Actinin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RYR antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>34C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Fischerbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations

Der Zebrafisch hat sich als ein wertvolles Modellsystem für die Erforschung der Skelettmuskelfunktion und für das Studium der menschlichen Muskelerkrankungen sein. Trotz der vielen Vorteile, die durch in vivo-Analyse von Skelettmuskel im Zebrafisch angeboten, die Visualisierung der komplexen und fein strukturierten Protein Milieu für die Muskelfunktion verantwortlich, insbesondere im gesamten Embryos, kann problematisch sein. Dieses Hindernis ergibt sich aus der geringen Größe des Zebrafisch-Skelettmuskel (60 um) und der noch geringeren Größe des Sarkomers. Hier beschreiben wir und zeigen, eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Skelett Muskelfasern von Zebrafisch-Embryonen und Larven. Wir berücksichtigen auch Protokolle, die Postvorbereitungstechniken für die Analyse von Muskel-Aufbau und Funktion zu veranschaulichen. Insbesondere haben wir ausführlich die anschließende immunzytochemische Lokalisation von Skelettmuskelproteine ​​und die qualitative Analyse der Calcium-Freisetzung stimuliert via Live-Zelle Kalzium-Imaging. Insgesamt ist dieses VideoArtikel bietet eine unkomplizierte und effiziente Methode für die Isolierung und Charakterisierung von Zebrafisch-Skelett-Muskelfasern, eine Technik, die eine Leitung für unzählige nachfolgende Studien der Muskelstruktur und-Funktion bietet.

Fluoreszenz-Immunmarkierung von Muskelfasern (Fig. 2) Bilder, die erwarteten Fluoreszenzmarkierungsmuster von Muskelfasern immun nach erfolgreicher Isolierung und Beschichtung. Die Muskelfasern wurden mit entweder Anti-Ryanodin-Rezeptor (1:100) (2A) oder anti-α-Actinin (1:100) (2B) Antikörpern markiert worden sind, und zeigen die Immunfärbung der Triade und der Z-Bande auf. Sekundäre Antikörper waren Alexa Fluor 555 (1:500). Bi...

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Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Aufrufe.  University of Michigan.  Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie. 

Serie: Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Forschung

Biologie

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Mikrodissektion von Zebrafisch Embryonale Augentücher

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.