Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Muskelregeneration in einem Zebrafischmodell für Muskelerkrankungen zu untersuchen und zu quantifizieren. Diese Methode bietet eine Hochdurchsatz-Pipeline, die nicht nur kostengünstig, sondern auch hochgradig reproduzierbar ist, um das regenerative Potenzial eines erkrankten Muskels in einer In-vivo-Umgebung zu bewerten. Avnika Ruparelia, wissenschaftliche Mitarbeiterin am Australian Regenerative Medicine Institute, demonstriert mit mir das Verfahren.
Für die Genotypisierung lebender Embryonen schälen Sie den klaren Schutzfilm von der Oberseite eines 24-Kammer-DNA-Extraktionschips und verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Filterspitze mit einer Schnittspitze, um einen einzelnen betäubten Embryo in 13 Mikroliter Embryomedium in jede Kammer des Chips zu übertragen. Wenn alle Embryonen geladen sind, montieren Sie den Chip vorsichtig auf die Genotypisierungsplattform des Zebrafischembryons, indem Sie zuerst eine Seite einlegen, gefolgt vom Rest des Chips. Befestigen Sie den magnetischen Plattformdeckel über dem Chip, um die Verdunstung des Embryomediums während des DNA-Extraktionsprotokolls zu verhindern, und schließen Sie den Deckel.
Stellen Sie die Basiseinheit auf 2,4 Volt, 0,051 Ampere und 0,12 Watt ein und starten Sie das DNA-Extraktionsprotokoll. Die Plattform sollte anfangen zu vibrieren, was durch sanftes Berühren des Deckels beurteilt werden kann. Bereiten Sie während des laufenden Programms eine 24-Well-Platte vor, indem Sie jedem Bohrplatz einen Milliliter Embryomedium hinzufügen und Acht-Well-Strip-Röhrchen für die Sammlung von DNA-Material von jedem Embryo kennzeichnen.
Drücken Sie nach acht Minuten Extraktion die Ein-/Aus-Taste, um die Vibration der Plattform zu stoppen, entfernen Sie vorsichtig den Magnetdeckel und heben Sie den Chip von der Plattform an. 10 Mikroliter Embryomedium aus einer Kammer in die entsprechende Vertiefung des Acht-Well-Streifenröhrchens übertragen und sofort zwei Tropfen frisches Embryomedium in die Kammern geben. Der Embryo wird aus der Kammer in eine geeignete Vertiefung der zuvor vorbereiteten 24-Well-Platte überführen.
Wenn alle Embryonen übertragen wurden, legen Sie die Platte in einen 28 Grad Celsius Inkubator. Führen Sie die entsprechenden nachgeschalteten Genotypisierungstests an dem genetischen Material durch, das in den Acht-Well-Strip-Röhrchen gesammelt wurde, um den Genotyp jedes Embryos zu bestimmen. Sobald der Genotyp jedes Embryos identifiziert wurde, übertragen Sie die Embryonen auf 90-Millimeter-Petrischalen mit 25 Millilitern mittlerem Wasser und inkubieren Sie die Platten bei 28 Grad Celsius bis zur Muskelverletzung.
Verwenden Sie vier Tage nach der Befruchtung eine Pipette, um eine betäubte Larve in eine neue Petrischale zu übertragen und überschüssiges Medium vorsichtig unter einem Seziermikroskop aus der Schale zu entfernen. Richten Sie den Fisch so aus, dass der Kopf links, der Schwanz rechts, die dorsale Region oben und die ventrale Region unten ist, und verwenden Sie eine 30-Gauge-Nadel, um einen schnellen präzisen Stich in ein bis zwei Somiten im Epaxialmuskel über der Analpore und horizontal zum Myoseptum zu machen. Tragen Sie einen Tropfen Embryomedium auf den verletzten Zebrafisch auf und übertragen Sie die Larve vorsichtig in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die einen Milliliter frisches Embryomedium pro Vertiefung enthält.
Wenn alle Larven verletzt wurden, legen Sie die Platte in den 28 Grad Celsius Inkubator, bis die Zebrafische abgebildet sind. Um die Muskelregeneration zu quantifizieren, öffnen Sie ein eintägiges Bild nach der Verletzung in einem geeigneten Bildanalyse-Softwareprogramm und verwenden Sie das Polygon-Tool, um eine Form um die Wundstelle zu zeichnen. Verwenden Sie die Software, um die Fläche und die mittlere Doppelbrechungsintensität des Bereichs zu messen und diese Werte in die Zellen D3 und E3 der bereitgestellten Vorlage zu kopieren.
Zeichnen Sie zwei zusätzliche Regionen, die jeweils ein bis zwei unverletzte Somiten umfassen, und messen Sie die Fläche und die mittleren Doppelbrechungsdichten jeder dieser Regionen. Kopieren Sie diese Werte in die Zellen D4 und D5 sowie E4 und E5 in der Vorlage. Wiederholen Sie dann die Messung für dieselben Regionen im Bild von drei Tagen nach der Verletzung.
Wenn die Doppelbrechung in allen Bildern auf die gleiche Weise gemessen wurde, berechnen Sie die normalisierte Doppelbrechung für jede Region, indem Sie die mittlere Doppelbrechungsintensität jeder Region durch ihre Fläche dividieren. Berechnen Sie für jeden Zeitpunkt die durchschnittliche normalisierte Doppelbrechung der beiden unverletzten Regionen, um einen Referenzpunkt für den unverletzten Muskel bereitzustellen. Um das Ausmaß der Muskelverletzung am ersten Tag nach der Verletzung zu bestimmen, dividieren Sie die normalisierte Doppelbrechung der Verletzungsregion durch die durchschnittliche normalisierte Doppelbrechung der unverletzten Regionen.
Um das Ausmaß der Muskelregeneration zu bestimmen, dividieren Sie die normalisierte Doppelbrechung der Verletzungsregion im Bild von drei Tagen nach der Verletzung durch die durchschnittliche normalisierte Intensität der unverletzten Regionen in diesem Stadium. Berechnen Sie schließlich den regenerativen Index, indem Sie den Wert für das Ausmaß der Muskelregeneration am dritten Tag nach der Verletzung durch den Wert für das Ausmaß der Muskelverletzung am ersten Tag nach der Verletzung dividieren. In dieser repräsentativen Analyse wurde ein Gelege von Embryonen aus einer Kreuzung zwischen zwei heterozygoten Lama2-Zebrafischen auf einen DNA-Extraktionschip übertragen und anschließend genotypisiert.
Während Muskelverletzungen am ersten Tag nach der Verletzung zu einer Verringerung der Doppelbrechungsintensität führen, führt die erfolgreiche Regeneration des Muskels zu einer erhöhten Doppelbrechung innerhalb derselben Region. Es ist auch bemerkenswert, dass, während Wildtyplarven aufgrund einer normalen Muskelstrukturierung eine gleichmäßige Doppelbrechungsintensität aufweisen, die Doppelbrechungsintensität im Muskel von Lama2-Knockout-Larven ungleichmäßig und sehr sporadisch ist, wahrscheinlich aufgrund einer verminderten Muskelintegrität. Wie beobachtet, zeigen sowohl Wildtyp- als auch Lama2-defiziente Larven eine signifikant erhöhte Doppelbrechungsintensität in der Wundstelle drei Tage nach der Verletzung im Vergleich zu einem Tag nach der Verletzung, was darauf hindeutet, dass sich der Muskel regeneriert hat.
Die Bestimmung des regenerativen Index zeigt, dass Lama2-defiziente Larven im Vergleich zu Wildtyptieren eine auffällige Zunahme der Muskelregeneration aufweisen. Während dieses Protokoll es uns ermöglicht, Veränderungen in der Regenerationsfähigkeit des Muskels in Modellen von Muskelerkrankungen zu identifizieren, müssen nachgeschaltete zelluläre und molekulare Analysen durchgeführt werden, um die Mechanismen zu identifizieren, die für die beobachteten Veränderungen verantwortlich sind. Mit dieser Methode konnten wir feststellen, wie eine beeinträchtigte Muskelstammzellfunktion und eine Beeinträchtigung der damit verbundenen Nischenelemente zur Pathogenese von Muskelerkrankungen beiträgt, so dass wir neue Krankheitsmechanismen identifizieren können.
