Das Protokoll kombiniert die Kraft der Erzeugung menschlicher kardiovaskulärer Zelltypen unter Verwendung induzierter pluripotenter Stammzellen und einer vielseitigen Technik, um schlagende Herzsphäroide in weniger als 72 Stunden zu erzeugen. Diese kardialen Sphäroide können für die Krankheitsmodellierung und Drogentests verwendet werden. Einer der Hauptvorteile dieser einfachen Technik besteht darin, dass man fast 1000 schlagende Herzsphäroide in einer Standard-12-Well-Platte erzeugen konnte.
Und am wichtigsten ist, dass jedes einzelne Herzsphäroid mit bildgebender Technik auf seine kontraktile Funktion untersucht werden kann. Nachdem Sie Agarose in der Mikrowelle geschmolzen haben, legen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank und lassen Sie sie drei Minuten abkühlen. 700 Mikroliter der geschmolzenen Agarose pipettieren und in die Silikonmikroformung eines neun mal neun Arrays geben, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen.
Legen Sie die Form vorsichtig auf den vorkalten Eisblock, um die Agarosedauer zu beschleunigen. Sobald die Agarose durchscheinend ist, biegen Sie vorsichtig die Kanten der Mikroform, um die Agarose-Replik zu verlieren, und schälen Sie die Replik vorsichtig von allen Seiten, um sie von der Silikon-Mikroform zu lösen. Übertragen Sie das Agarose-Mikrogewebetablett mit 81 kreisförmigen Aussparungen in eine sterile 12-Well-Platte, geben Sie dann zwei Milliliter PBS in das Agarose-Mikrogewebetablett und untersuchen Sie es unter dem Mikroskop auf eingeschlossene Blasen oder unregelmäßig geformte Vertiefungen.
Tauchen Sie die Agaroseschale über Nacht in zwei Milliliter 70% Ethanol, gefolgt von einer UV-Behandlung in der Biosicherheitswerkbank für eine Stunde. Entfernen Sie das 70% ige Ethanol und waschen Sie es zweimal mit destilliertem Wasser und einmal mit zwei Millilitern PBS. Sobald die induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen nach Trypsinisierung und Neutralisation gezählt sind, legen Sie die Zellsuspensionen auf das Eis.
Mischen Sie in einem neuen Röhrchen die induzierten pluripotenten Stammzellen aus Kardiomyozyten, Kardioblasten und Endothelzellen. Entfernen Sie dann das PBS aus dem Brunnen und der Zellsaatkammer, ohne die Vertiefungen zu berühren, und fügen Sie 200 Mikroliter der Zellsuspension tropfenweise hinzu. Lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für zwei Stunden absetzen.
Fügen Sie mikrogewebtes Herstellungsmedium hinzu, das die Agaroseform umgibt, um die Oberfläche der inneren Kammer zu bedecken. Nach 24 Stunden auf selbstorganisierte und kompakte Sphäroide in den kreisförmigen Vertiefungen achten. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, um die Sphäroide zu erhalten.
Typischerweise kann nach 48 Stunden ein spontanes Schlagen der Sphäroide beobachtet werden. Kultivieren Sie die einzelnen Zelltypen separat auf Basalmembranmatrixmedium oder gelatinebeschichteten Kammerobjektträgern. Spülen Sie die Herzmikrogewebe vorsichtig aus den kreisförmigen Vertiefungen und sammeln Sie sie in einem 15-Milliliter-Chronikröhrchen.
Aspirieren Sie das Medium und spülen Sie die Zellen oder die Mikrogewebe mit einem Milliliter PBS ab. Fixieren Sie dann die Zellen oder die Mikrogewebe mit einem Fixationspuffer, der 4,2% PFA enthält, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die PFA und inkubieren Sie die Zellen oder die Mikrogewebe mit einem Milliliter permeabilisierender Lösung.
Dann die Lösung absaugen und mit zwei bis drei Millilitern PBS abspülen. 500 bis 1000 Mikroliter Blocklösung in die Zellen geben und mindestens eine Stunde für die Kammerobjektträger und für drei bis vier Stunden für die Mikrogewebe inkubieren. Inkubieren Sie die Proben mit konjugierten Antikörpern in der Blocklösung für eine Stunde für die Kammerobjektträger und über Nacht bei vier Grad Celsius für die kardialen Mikrogewebe.
Waschen Sie die Kammerschieber dreimal mit 500 Mikrolitern von 0,1% Tween 20, mit fünf Minuten Dauer zwischen jeder Wäsche, und führen Sie dann eine letzte Wäsche mit PBS durch. Waschen Sie das Herzmikrogewebe fünfmal mit zwei Millilitern von 0,1% Tween 20, mit einer Dauer von 20 Minuten zwischen jeder Wäsche. Führen Sie dann eine letzte Wäsche für weitere 20 Minuten durch.
Inkubieren Sie die Zellen oder die Mikrogewebe vor der konfokalen Mikroskopie mit DAPI, übertragen Sie dann die kardialen Mikrogewebe vorsichtig auf eine 35-Millimeter-Glasbodenschale und fügen Sie PBS hinzu, um das Mikrogewebe unterzutauchen. Spülen Sie die Mikrogewebe mit einer breiten oder einer Milliliter-Pipettenspitze aus den kreisförmigen Vertiefungen mit mittlerer oder einer Milliliter-Pipettenspitze in ein chronisches 15-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie sie sich absetzen. Dann das Medium absaugen und mit einem Milliliter PBS abspülen.
200 bis 300 Mikroliter des Enzymaufschlusspuffers zugeben und 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Mischen Sie dann die Mikrogewebe vorsichtig für eine Minute und wiederholen Sie die Inkubation. Nach der Inkubation mischen Sie die Mikrogewebe kräftig mit einer normalen Pipettenspitze von einem Milliliter, um sie in einzelne Zellen zu verdauen.
Erhalten Sie eine trübe Zellsuspension und neutralisieren Sie die Zellsuspension sofort mit fünf Millilitern Medium, das 5% FBS enthält. Die Zellsuspension durch ein 40 Mikrometer großes Zellsieb abseihen und die Gesamtzahl der Zellen zählen. Zentrifugieren Sie die Einzelzellsuspension bei 300 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Den Überstand aspirieren und die Zellen im Annexin-Bindungspuffer mit FITC Annexin V und Propidiumiodid oder TO-PRO-3-Totzellausschlussfarbstoff resuspendieren und 10 Minuten auf Eis inkubieren. Nach der Inkubation werden 300 Mikroliter des Annexin-Bindungspuffers in die Zellsuspension gegeben und zur durchflusszytometrischen Analyse in ein FACS-Röhrchen mit rundem Boden überführt. Gereinigte induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten, Endothelzellen und Herzfibroblasten wurden mittels Phasenkontrastmikroskopie visualisiert.
Die Reinheit verschiedener Zelltypen wurde mittels Immunfärbung und Durchflusszytometrie bestimmt. Troponin T wurde als Marker für Kardiomyozyten verwendet, und es wurde eine Reinheit von über 90% erreicht. Das Thrombozyten-Endothelzelladhäsionsmolekül CD31 und Vimentin wurden als Marker für Endothelzellen und kardiale Fibroblasten verwendet und zeigten eine Reinheit von über 98% bzw. 96% an.
Die Immunfluoreszenzfärbung ergab, dass die Kardiomyozyten am schwersten waren und das Zentrum der Mikrogewebe einnahmen, während die Endothelzellen in den Mikrogeweben eingestreut waren und die Herzfibroblasten überwiegend die Peripherie besetzten. Die Verdauung der Mikrogewebe mit diesem Tempo eins und Liberase TL führte nach zwei Wochen in Kultur zu hoch lebensfähigen Zellproportionen mit weniger apoptotischen Zellen. Die einstündige Exposition der kardialen Mikrobeschwerden gegenüber einer hohen Konzentration von Doxorubicin induzierte dosisabhängige Kardiotoxizität.
Die Kontraktilität des Mikrogewebes und die Bewegung der Vektoren erzeugten eine Pseudo-Wärmekarte, die das durchschnittliche Kontraktionsprofil über das Mikrogewebe veranschaulichte. Die kontraktile Bewegung der kardialen Mikrogewebe erzeugte positive Spitzen, die als Kontraktionsgeschwindigkeit, Relaxationsgeschwindigkeit und Schlagfrequenz gemessen wurden, die als Zeit zwischen zwei Kontraktionszyklen berechnet wurde. Die Kontraktilität der kardialen Mikrobeschwerden war über vier Wochen in Kultur konsistent.
Die Erwärmung der Zellen ist einer der wichtigsten Schritte in diesem speziellen Protokoll, bei dem darauf geachtet werden muss, die Zellsuspension tropfenweise in das Agarose-Array zu dosieren, um eine gleichmäßige Verteilung innerhalb der Mikrotiterwerke zu gewährleisten und ein Überlaufen zu verhindern. Mit dem optimierten Bestrahlungsprotokoll dieser Mikrogewebe könnte man diese Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien wie Einzelzell-RNA-seq oder Einzelzell-ATAC-seq unterziehen, um zellspezifische Genexpressionsmuster zu verstehen, die sich aus unterschiedlichen Behandlungsbedingungen ergeben.
