Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind nach wie vor die häufigste Todesursache weltweit. Traditionelle In-vitro-Modelle basieren auf Monolayer-Kultur. Das Herz, insbesondere der Herzmuskel oder das Myokard, ist jedoch in seiner 3D-Anisotropie und zellulären Zusammensetzung komplex.
Daher ist es wichtig, die Komplexität der Gewebezusammensetzung in In-vitro-Modellen zu verbessern, um sowohl die zellulären Bestandteile als auch die Struktur des Myokards besser nachzuahmen. Hier in dieser Arbeit demonstrieren wir ein Protokoll für die Entwicklung eines 3D-reifen Stammzell-abgeleiteten menschlichen Herzgewebes in einem neuartigen mikrofluidischen Gerät. Dieses Gerät enthält einen 3D-Hauptgewebekanal mit angeborenen elliptischen Mikropfosten, die einen hohen Grad der Ausrichtung der umgebenden Hydrogel-verkapselten Herzzellen induzieren.
Der Hauptkanal wird von Medienkanälen mit Injektionsöffnungen flankiert, die eine Nährstoffdiffusion im gesamten Gewebe ermöglichen. Aufgrund der Sorgfalt, die bei der Handhabung der mikrofluidischen Geräte erforderlich ist, ist die visuelle Darstellung dieses Protokolls hilfreich, um 3D-Herzgewebe in einem mikrofluidischen Gerät mit eingebetteten Mikropfosten für eine verbesserte Gewebeausrichtung richtig zu etablieren. Um den menschlichen Herzfibroblasten zu dissoziieren, nehmen Sie zuerst den Kolben aus dem Inkubator heraus.
In die Biosicherheitswerkbank legen und beginnen, die verbrauchten Medien aus dem Kolben abzusaugen. Nehmen Sie dann drei MLs PBS 1X, um den Kolben zu waschen. Schließen Sie die Kappe und schwenken Sie den Kolben, so dass der Boden ordnungsgemäß mit PBS beschichtet ist.
Saugen Sie das PBS an. Nehmen Sie drei MLs 37-Grad-Trypsin und fügen Sie es in den Kolben. Dann kippen Sie den Kolben und schwenken Sie, so dass der Boden vollständig beschichtet ist.
Dann für vier bis sechs Minuten in den Inkubator geben. Neutralisieren Sie das Trypsin mit FGM3, indem Sie drei MLs nehmen und in den Kolben geben. Pipetieren Sie die Lösung auf und ab, um alle Zellen zu verdrängen, die auf der Rückseite des Kolbens verbleiben.
Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 ML Falcon-Röhrchen. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension und geben Sie sie in einem Hämozytometer ab, um die Zellen mit einem Mikroskop zu zählen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 250 G für vier Minuten.
Nach der Zentrifugation saugen Sie den Überstand an, wobei Sie darauf achten, das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit frischem FGM3, um die gewünschten 75 Millionen Zellen pro ML-Suspension herzustellen. Setzen Sie die Zellen wieder auf und legen Sie das Röhrchen dann mit einer locker angebrachten Kappe ab.
Um die Kardiomyozyten zu dissoziieren, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und saugen Sie das Medium an. Nehmen Sie sechs ML PBS und waschen Sie die Brunnen, so dass sich in jedem Brunnen ein ML PBS befindet. Saugen Sie das PBS an und achten Sie darauf, die an der Platte befestigten Zellen nicht zu stören.
Fügen Sie sechs ML erwärmtes trypLE Express hinzu, so dass sich in jeder Vertiefung einer Platte mit sechs Wellen ein ML befindet. Inkubieren Sie die Zellen mit dem trypLE für 10 Minuten. Neutralisieren Sie nach 10 Minuten das TrypLE mit sechs ML RPMI plus B27 plus Insulin, so dass Sie jedem Brunnen einen ML RMPI hinzufügen.
Verwenden Sie eine ML-Pipette, um die Lösung zu sammeln und sie gegen die Rückseite der Vertiefungen zu sprengen, um sicherzustellen, dass alle Zellen abgehoben werden. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 ML Falcon-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 G für drei Minuten.
Nach der Zentrifugation das Medium und das TrypLE absaugen. Dieser Schritt ist wichtig, um die empfindlichen Kardiomyozyten zu waschen. Dieser Schritt stellt sicher, dass alle TrypLE bei der Bildung von 3D-Herzgewebe verschwunden sind.
Resuspend das Zellpellet in fünf MLs RPMI plus B27 plus Insulin. Verwenden Sie eine ML-Pipette, um die Lösung nach oben und unten zu pipetten, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension zum Zählen mit dem Hämozytometer.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 G für drei Minuten. Saugen Sie die Medien nach der Zentrifugation zum zweiten Mal an. Fügen Sie die entsprechende Menge rpmI plus B27 plus Insulin hinzu, um 75 Millionen Zellen pro ML-Suspension zu erreichen, und resuspendieren Sie dann.
Um die Kollagenlösung für die Verkapselung vorzubereiten, haben Sie alle Reagenzien auf einem Eiskasten in der Haube. Nehmen Sie dann 75 Mikroliter des Kollagens. Das Kollagen ist sehr viskos, also langsam mit der Pipette aufnehmen, dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis dosieren.
Nehmen Sie 13,85 Mikroliter RPMI und fügen Sie das Kollagen in der Falcon-Röhre hinzu. Dann nehmen Sie 10 Mikroliter Phenolrot und fügen Sie der Mischung auf Eis hinzu und resuspend. Nehmen Sie schließlich 1,15 Mikroliter eines normalen NaOH und fügen Sie der Suspension hinzu, um sie zu neutralisieren.
Nehmen Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze und brauen Sie die Suspension wieder auf. Der nächste Schritt ist die Verkapselung der Zellen innerhalb des Kollagen-Metrogels. Dann nehmen Sie ein Aliquot von acht Mikrolitern CMs und fügen Sie es zu einem frischen Falcon-Rohr auf Eis hinzu.
Nehmen Sie dann zwei Mikroliter CS und fügen Sie sie zu dieser Zellmischung hinzu. Resuspendieren Sie die Zellsuspension und greifen Sie 5,6 Mikroliter der Zellsuspension und geben Sie sie in ein frisches Falcon-Röhrchen. Dann schnappen Sie sich das Kollagen, das Sie gerade zubereitet haben, nehmen Sie vier Mikroliter des Kollagens und nehmen Sie dann 2,4 Mikroliter Metrogel.
Pipetten Sie die Mischung auf und ab, um eine homogene Verteilung der Zellhydrogelsuspension zu gewährleisten. Sobald die Gelinjektion vorbereitet ist, können Sie sie in Geräte einführen. Nehmen Sie einen neuen Tipp und resuspendieren.
Nehmen Sie die Petrischale der Geräte, führen Sie die Spitze in den Injektionsanschluss ein und injizieren Sie langsam und stetig. Sie werden sehen, wie sich der Gerätekanal mit der Zellhydrogelsuspension füllt. Sobald der andere Anschluss gefüllt ist, stoppen Sie die Injektion und entfernen Sie die Spitze.
Nach der Injektion die Geräte mit einer Pinzette umdrehen und neun Minuten lang mit Wasser in die größere Petrischale legen. Nach neun Minuten nehmen Sie die Geräte aus dem Inkubator und drehen sie aufrecht und legen Sie sie dann für weitere neun Minuten in den Inkubator, um die Hydrogelpolymerisation abzuschließen. Jetzt ist es an der Zeit, die Medien hinzuzufügen.
Nehmen Sie also RMPI plus B27 und stecken Sie die Spitze in den Medienanschluss und beginnen Sie langsam zu drücken. Tun Sie dies dann auf dem gegenüberliegenden Medienanschluss. Möglicherweise stellen Sie fest, dass das Medium nicht injiziert wird, sodass Sie einen Tropfen Medien auf den Anschluss legen und dann die Pipette nehmen und Unterdruck verwenden können, um das Medium von der anderen Seite durchzuziehen.
Sie werden also sehen, wie die Medien beginnen, durch den Kanal gezogen zu werden. Sobald alle Medienkanäle mit Medien versehen wurden, werden die Geräte bei 37 Grad wieder in den Inkubator gestellt. Das mikrofluidische Gerät ist in der oberen linken Ecke dargestellt.
Die Tage eins, sieben und 14 der Kultur werden dieses Bild gezeigt. Nach 14 Tagen Kultur sollten die Zellen zu stark ausgerichteten Strukturen kondensieren, die sich um die Mikropfosten bilden. Spuren des 14. Tages sind hier in C der spontanen Kontraktion sowie immunfluoreszierende Bilder von Aktin-gefärbtem und herzmarkergefärbtem Gewebe gezeigt.
Zu sehen sind hoch ausgerichtete Aktinfasern, die sich nach 14 Tagen in Kultur bilden, sowie parallele streifenreife Sarkomere und lokalisierte Gap Junctions. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Materialien während der Zellhydrogelinjektion bei niedrigen Temperaturen auf Eis zu halten, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern. Die mikrofluidischen Geräte sollten sowohl bei der Herstellung, Injektion als auch bei der erweiterten Gewebekultur mit Vorsicht behandelt werden.
Die Zellinjektionen sollten ein stetiger Prozess sein, um sicherzustellen, dass sich der gesamte Kanal gefüllt hat, während sie schnell durchgeführt werden, um eine vorzeitige Polymerisation oder ein Austrocknen des Hydrogels vor der Medienzugabe zu verhindern.
