Die Autoren danken Mittel aus dem Australian Research Council und National Health and Medical Research Council of Australia und auch möchte ich danke Australian National Fabrication Facility für die SU-8-Master für das Mikrokontaktdruck. SHN wird durch das Ministerium für Höhere Bildung Malaysia und Universiti Sains Malaysia unterstützt.

Ein. Passivierung von Deckgläsern mit PLL-PEG-Biotin Dieser Schritt ist für die Oberfläche zu passivieren, so dass Zellen anhaften und auf spezifische Bereiche auf dem Deckglas, das mit microcontract Drucken (Schritt 2-3a) oder Dip-Pen-Lithographie (Schritt 3b) angelegt werden migrieren. Zur Passivierung ist ein Copolymer aus Poly-L-Lysin (PLL) und Polyethylenglykol (PEG) eingesetzt, bei denen 20% der PEG-Moleküle an Biotin (PLL-PEG-Biotin) gepfropft werden. <ol><li> Um Deckgläschen (18 mm x 18 mm), tauchen sie in ein Rack in 100% Ethanol reinigen und legen die Zahnstange in einer Ultraschallbehandlung Bad für 30 min. Trocknen Sie die Deckgläschen in der Luft oder unter einem Strom von Stickstoff. </li><li> Anschließend beschallen die Deckgläser für 30 min in 1 M NaOH. Danach spülen Sie die Glasoberflächen durch vorsichtiges Eintauchen des Rack in einem Becher mit 1,5 l Milli-Q H 2 O. gefüllt Wiederholen Sie den Spülvorgang dreimal mit frischem Milli-Q H 2 O jeder Zeit. Trocknen Sie die Deckgläschen ineinen Ofen bei 60 ° C. </li><li> Die Hälfte der sauberen Deckgläschen einzeln in einer feuchten Kammer, die aus einer 24-Well-Platte teilweise mit H 2 O. gefüllt wird Drop 15 ul PLL-PEG-Biotin (1 mg / ml) in PBS für jedes Deckglas. Nehmen Sie die andere Hälfte der verbleibenden sauber Deckgläschen und sorgfältig Sandwich die PEG-Lösung. Lassen Sie die Deckgläser für 1 Stunde in der feuchten Kammer. Schieben der sandwichartig Deckgläser sanft voneinander weg ohne Kratzen der PEG-beschichteten Oberfläche und spülen sie mit Milli-Q-H 2 O. Das Wasser sollte abrutschen leicht auf der PEG-behandelten Seite. Falls erforderlich, zugewandten lufttrockenem die Deckgläser auf Papierhandtuch mit der behandelten Oberfläche nach oben. Bewahren Sie die Deckgläschen in einem Vakuumexsikkator bis zur weiteren Verwendung. </li></ol> 2. Herstellung von Briefmarken für Mikrokontaktdrucken Wir beschreiben zwei Prozesse Muster Streptavidin Tracks auf der passivierten Deckgläschen. Das erste, microcontact Druck, typischerweise erfordert die Herstellung eines Silicium-Master von dem ein PDMS-Stempel gegossen wird. In unserem Fall, sind die Muster auf dem PDMS-Stempel 100 um-breite Linien, die um 290 Mitte-zu-Mitte voneinander beabstandet sind mit einer Funktion Höhe von 25 um. Nachfolgend beschreiben wir kurz wie eine geeignete Silicium-Master (Schritt 2.1-2.3) und PDMS-Stempel (Schritt 2.4) herzustellen. Es gibt jedoch mehrere Protokolle für Mikrokontaktdrucken in der Literatur 19-23, die geeignet zum Drucken Proteinmuster auf Deckgläsern sind beschrieben. Masters können auch maßgeschneiderte und gekauft aus kommerziellen Quellen. <ol><li> Zuerst reinigen Siliziumwafer (4 &quot;Durchmesser) durch Inkubation in Piranhalösung (3:1 v: v von Schwefelsäure und 30% Wasserstoffperoxid). Für 20 min Spülen des Wafers 10 mal gründlich mit MilliQ H 2 O. Trocknen der Wafer in einem Ofen bei 150 ° CO / N. </li><li> Spülen der sauberen und getrockneten Siliziumwafers mit 100% Aceton, um 100% Isopropylalkohol gefolgt. NächsteSpin-Coat 2 ml GM1070 SU-8 Fotolack (Gersteltec Sarl) auf den Wafer bei 3.100 Umdrehungen pro Minute für 40 Sek. eine 25 um dicke Schicht. Die Probe wird dann auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 5 min gebacken um weitere 5 min bei 95 ° C. </li><li> Freilegen SU-8 Photoresist mit UV-Licht für 60 Sekunden unter einer Photomaske mit dem gewünschten Muster (zum Beispiel unter Verwendung eines Quintel Q6000 Maskaligner) und wiederholen der Backvorgang in 2,2 beschreiben. Anschließend wird die Probe durch Eintauchen des Wafers in SU-8 Entwicklers (Gersteltec Sarl) für 4 min, 100% Isopropylalkohol gespült und getrocknet unter Stickstoffstrom entwickelt. Die Fläche des SU-8 Photoresist, die nicht dem UV-Licht ausgesetzt war wird somit entfernt, wodurch die inversen Muster der PDMS-Stempel. </li><li> Der nächste Schritt ist es, ein PDMS-Stempel von dem Silizium-Master gegossen. Zuerst wird gründlich gemischt 1 Teil (w / w) des Härtungsmittels mit 10 Teilen Elastomer Prepolymer (Sylgard 184). Um mögliche Luftblasen zu entfernen, entgasen die Mischung in einem Exsikkator an eine Saugleitungfür 1 Stunde. Anschließend gießen PDMS Elastomer auf die Silizium-Master in einer Petrischale bis etwa 1 cm in der Höhe und Heilung der Master-und PDMS-Gemisch in einem Ofen bei 70 ° C für 1 Stunde. Schließlich wird die PDMS-Stempel aus dem Silizium-Master entfernt und auf Maß geschnitten. </li></ol> 3. Patterning Streptavidin oder Adhesive Cues auf Passivated Deckgläschen Nach Passivierung Deckgläschen werden Proteinmuster mit Mikrokontaktdrucken (Step 3a) oder Dip-Pen-Lithographie (Step 3b) gedruckt. In unserem Fall wird Streptavidin als Linien, die die Grundlage für RGD Gradienten (Schritt 4) bilden gedruckt. Das gleiche Verfahren kann auch zum Bedrucken von Matrixproteinen an Klebemuster erstellen verwendet werden. Eine alternative Methode zur Mikrokontaktdruck für die Strukturierung von Biomolekülen an Oberflächen ist Dip-Pen-Lithographie. In Dip-Pen-Lithographie ist ein Ausleger verwendet, um ein kleines Volumen der Lösung auf die Oberfläche übertragen. Die Größe der Ausleger, viskosität der Lösung, Kontaktzeit des Auslegers auf der Oberfläche, zu bestimmen Hydrophobie der Oberfläche und Luftfeuchtigkeit in der Druckkammer die Größe der gedruckten Features. Der Vorteil dieser Methode ist, dass verschiedene Muster für jedes Experiment gedruckt werden kann, da es keine Notwendigkeit, Mastern und Stempel herzustellen. Der Nachteil ist, dass es länger dauert, bis ein bestimmtes Muster zu drucken und Dip-Pen-Lithographie erfordert einen Spezialisten Instrument, das nicht sein kann in vielen Labors zur Verfügung. Der Dip-Pen-Lithographie Instrument, das wir verwendet wurde, war die NanoeNabler von Bioforce Nanowissenschaften. Hier druckten wir kleine Punkte, die &lt;10 um im Durchmesser waren, für die wir SPT10 Cantilever verwendet. 3a. Mikrokontaktdrucken (mCP) Technik <ol><li> Zu reinigen und um das PDMS-Stempel mehrere hydrophile, behandeln des gemusterten Seite der PDMS-Stempel in einer UV-und Ozon (beispielsweise UV-Ozon aus Procleaner Bioforce Nanoscience) für 1,5 Stunden. Alternativ können Sie einen Plasma-Reiniger für eine kürzere Zeit für den gleichen Zweck. Dieser Prozess erzeugt eine oxidierte PDMS Oberfläche 24, die den Druckvorgang verbessert. </li><li> Unmittelbar nach der Ozon-oder Plasmabehandlung, Ort und ausgebreitet 10 ul Streptavidin (1 mg / ml in PBS) auf die PDMS-Stempel und lassen für 1 Stunde in einer feuchten Kammer (z. B. eine teilweise gefüllte 6-Well-Platte, siehe Schritt 1.3) . Wenn Bahnen müssen unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar, verwenden Streptavidin, die an ein Fluorophor konjugiert wie Streptavidin-AlexaFluor350 ist. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Streptavidin aus dem Stempel mit Seidenpapier und Luft trocknen den Stempel für ca. 1 min. Drücken Sie den Stempel auf die PLL-PEG-Biotin-beschichteten Deckglas. </li><li> Wenn fluoreszierenden Streptavidin in Schritt 3.a2 verwendet wurde, überprüfen Sie die Muster mit unter einem Epifluoreszenzmikroskop. Bewahren bedruckten Oberflächen in einem Exsikkator. </li></ol> 3b. Dip Pen Lithography <ol><li> Zuerst mischen Sie 1 Teil 1 mg / ml Streptavidin oder streptavidin-AlexaFluor350 mit 10 Teilen Glycerin (v / v) und laden Sie 5 ul der Mischung auf dem Ausleger. Dann beginnen die Druckverfahren wie in der Bedienungsanleitung des Dip-Pen-Lithographie Instruments beschrieben. Um die Punktgröße zu verringern etwa 5 um, einzustellen Druckgeschwindigkeit Kontaktzeit des Auslegers auf der Oberfläche oder vertikale Abstand des Auslegers an die Oberfläche. In dem Beispiel in Abbildung 2c gezeigt, wurden Punkte in einer Linie mit Zeile und Spalte Trennung auf 10-15 um gedruckt. Dieser Abstand reicht aus, um Punkte von ineinander übergehen zu verhindern, sondern ermöglicht die Anzeige von mehreren Punkten in einem einzigen Blickfeld mit den meisten Mikroskopeinstellungen. </li><li> Bewahren bedruckten Oberflächen in einem Exsikkator. </li></ol> 4. Erstellen Adhesive Farbverläufe auf Streptavidin-pattern Surfaces Wir erzeugen Klebstoff Gradienten auf Deckgläschen, die mit Streptavidin (Abbildung 3) oder Co beschichtet sind Biotin-RGDntain Streptavidin Muster auf passiviert Deckgläschen (Abbildung 5). Eine Fläche Gradienten erzeugen, verwendeten wir ein handelsübliches Mikrofluidvorrichtung (Slide genannt klebrig-Chemotaxis 3D von Ibidi), die eine stabile Lösung Gradienten durch passive Diffusion erzeugt. Um für Streptavidin Bindungsstellen konkurrieren, beschäftigten wir zwei gegenüberliegenden Gradienten von Biotin-RGD und Biotin, das war nicht konjugiert RGD (siehe Abbildung 1). <ol><li> Kleben Sie die Streptavidin-beschichteten oder strukturierten Deckgläschen auf die Klebeseite des sticky-Slide Chemotaxis 3D-Gerät. Um sicherzustellen, daß es keine Leckage für mehrere Stunden, werden die Kanten der Vorrichtung mit einer dünnen Schicht aus Vaseline erwärmt und mit einer zweiten Schicht aus einem Gemisch aus 1 Teil bis 1 Teil Vaseline aus Paraffinwachs (w / w) abgedichtet ist. </li><li> Füllen Sie den Kanal des Gerätes mit 6 ul PBS in den Kanal. Dann füllen Sie die beiden Reservoire mit 70 ul von 0,03 ug / ul Biotin-4-Fluorescein in PBS und 70 &amp; mu; l von 0,03 ug / ul Biotin-RGD in PBS, jeweils. Inkubieren der Proben bei RT im Dunkeln für 1 Stunde. </li><li> Entfernen Sie die Biotin-Lösungen und sorgfältig spülen die Oberfläche, während noch der mikrofluidischen Vorrichtung zweimal mit PBS angebracht. Markieren Sie die Richtung des Klebers Steigung und, wenn nötig, speichern Sie das Gerät mit PBS bei 4 ° C gefüllt für, sondern sicherzustellen, dass das Gerät nicht austrocknen. Falls erforderlich, den Klebstoff zu analysieren Gradienten mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol> 5. Kennzeichnung von Zellen mit Farbstoffen für das Live Cell Imaging Zellen werden mit fluoreszierenden Farbstoffen, die Zellen-Tracking unter dem Fluoreszenzmikroskop unterstützen beschriftet. Gemeinsamen Sonden fluoreszierend sind Organelle Marker, wie Syto 64 Red, die den Zellkern markiert. Dazu werden die Zellen zunächst dreimal mit PBS gewaschen, dann mit 1 uM Syto 64 Rot in Kulturmedien für 45 min inkubiert und schließlich gewaschen noch dreimal mit PBS. Bitte beachten Sie, dass die Zellen sollten nichtgehalten in PBS für lange Zeiträume. Alternative Farbstoffe für die Zell-Tracking sind CellTracker Serie, die das Zytoplasma Flecken und werden während der Zellwanderung und Teilung erhalten. Transfektion von Zellen mit einem fluoreszierenden Fusionsproteins ist besonders nützlich, um die subzelluläre Verteilungen eines Proteins von Interesse während der Migration aufzuzeichnen. Allerdings fluoreszierende Proteine ​​typischerweise Foto-bleach schneller als organische Farbstoffe, so dass langfristige Beobachtungen nicht möglich sein. 6. Laden der Zellen mit einem löslichen Gradient in der Mikrofluidik Geräte <ol><li> Fluoreszenzmarkierte Zellen zu zählen und in zwei Rohren mit gleichem Zellzahlen. Waschen und resuspendieren einen Röhre von Zellen mit Medium, das die chemische Lockstoffe wie modifiziertes Eagle low glucose Dulbeccos Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Waschen und resuspendieren Sie das andere Rohr von Zellen in Medien ohne Lockstoff, dh DMEM mit 0% FBS. Die Endkonzentrationder Zellen in jedem Schlauch sollte 5 x 10 5 Zellen / ml liegen. </li><li> Entfernen Sie alle Lösungen aus der Mikrofluidik-Vorrichtung (aus Schritt 4,3) und legen Sie es auf dem Mikroskoptisch (siehe Schritt 7). Leistung 70 ul Zellen (5 × 10 5 Zellen / ml in DMEM 0% FBS) in einem Reservoir und 70 ul von HeLa-Zellen (5 x 10 5 Zellen / ml in 10% FBS DMEM) in eine andere. Locker legen einen Band über den Stauseen um Verdunstung zu vermeiden. Wenn Zellen auf der Oberfläche vorinkubierten sind vor der Bebilderung, ist es ratsam, dass die Zellen in die Vorrichtung in Wachstumsmedium ohne die Gradienten geladen. Die Vorrichtung wird dann auf dem Mikroskoptisch platziert und die Medien ersetzt Gradienten dh Medien DMEM ohne FBS in ein Reservoir und DMEM mit 10% FBS in der anderen. </li></ol> 7. Live Cell Imaging and Data Analysis <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop (Nikon Ti-E) und erwärmen die Bühne mindestens 1 Stunde vor dem Start des Experiments. </li><li> Sicherzustellen, dass der Kanal des Mikrofluidic Vorrichtung im Sichtfeld und Zellen sind im Fokus. Wählen Bildaufnahme Parameter wie Belichtungszeiten und fluoreszierenden Filter, Bildsequenz Hellfeld und Fluoreszenz, die Zellen und Spuren erfasst sowie Zeitpunkten und Aufzeichnungslänge (zB alle 15 Minuten für 16 Stunden). </li><li> Analysieren von Daten mit den entsprechenden Software wie ImageJ Manuelle Tracking oder Ibidi Chemotaxis und Migration Tool. </li></ol>

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Wir haben keine kommerziellen Interessen offen zu legen.

Bei diesem Protokoll, verwendeten wir ein handelsübliches Mikrofluidvorrichtung (Slide-klebrigen Chemotaxis 3D von Ibidi), um die Effekte von chemisch modifizierten Oberflächen und chemoattraktive Gradienten auf Zellmigration studieren. Diese mikrofluidischen Einrichtung erfordert keine Strömung, da der Gradient durch Diffusion entlang der Länge des Kanals einstellt. Dies ist wichtig, weil Flow unterschiedlich beeinflussen könnte langsam wandernden Zellen wie Fibroblasten, die stabil fokalen Adhäsionen ...

Regie Zellwanderung ist eine grundlegende Eigenschaft von vielen Zellen und ist ein wichtiger Aspekt von vielen physiologischen Prozessen, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Infektabwehr und Wundheilung. Zusätzlich Zellwanderung spielt auch eine wichtige Rolle bei vielen Krankheiten wie Gefäßerkrankung, Tumorzellenmetastase und chronischen Entzündungen 1,2. Während die klassischen Zuständen der Zellwanderung - Polarisation Vorsprung Erweiterung, Bildung Haftung, Krafterzeugung und hinten Rückzug - in der Regel 3,4 angenommen werden, hat die Aufklärung der raumzeitlichen Mechanismen, durch die Signal-Integration koordiniert wurde schwieriger. Die extrazelluläre Matrix (ECM) dient als Substrat für die Zelladhäsion und durch inhärente chemische und physikalische 5 6 Vielfalt stellt Richtungshinweise für Zellennavigationsmodus 7,8. Neben diesen Klebstoff Cues 9, lösliche Faktoren 10-12 &lt;/ Sup&gt;, wie Chemokine und Wachstumsfaktoren können induzieren gerichteten Zellmigration durch chemoattraktive Rezeptoren und deren stromabwärts motogenic Signalisierung. Derzeit ist es nicht bekannt, ob Eingriff und Signalisierung durch Adhäsionsrezeptoren (dh Integrine) oder chemoattraktive Rezeptoren, wie Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), dominant sind. Auch ist es nicht bekannt, ob Hierarchien von Rezeptor-Systeme Zelltyp spezifisch sind. Live-Mikroskopie bietet eine Fülle von Informationen, die nicht zugänglich ist lose Assays und kann mit mikrofluidischen Bauteilen kombiniert werden, um Steigungen von immobilisierten 13,14 und löslichen Cues 15 16 zu generieren. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine Reihe von einfachen und bewährten Schritte zur Oberflächenmodifizierung in Verbindung mit einem handelsüblichen Mikrofluidik-Kammer, eine Abbildungsanordnung Assay für Zellmigration, dass leicht in einer Zelle Biologielaboranten (Abbildung 1) implementiert werden erstellen. Die zusammengebauteMikrofluidikvorrichtung besitzt optische Eigenschaften, die vergleichbar mit Glas und 17 sind die Steigungen der diffundierbare Moleküle sind für mindestens 16 Stunden stabil. Das System kann für Epifluoreszenz-Mikroskopie und fortschrittliche Techniken verwendet werden. Im Gegensatz zu anderen Chemotaxis Setups 18, eignet sich dieses System zum Aufzeichnen langsam wandernden, adhärenten Zellen. Wichtig ist, ist das System modular aufgebaut und leicht ermöglicht die Einführung alternativer Kleber oder lösliche Migration Signale und Prüfung verschiedener Zelltypen.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverglass staining outfits</td>
 <td>Thomas Scientific</td>
 <td>8542 E40</td>
 <td>Coverslip rack</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oven</td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td>ED 53 series</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon wafer</td>
 <td>Silicon Quest</td>
 <td>708-007</td>
 <td>Boron doped &lt;100&gt; wafer, 4" diameter, 500 &mu;m, single side polished</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GM1070 SU-8 photoresist</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 developer</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 curing agent</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 elastomer prepolymer</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td >&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLL-PEG-biotin (20%)</td>
 <td>SuSos AG</td>
 <td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>46955</td>
 <td>1 mM in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-AlexaFluor350</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S-11249</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-4-fluorescein</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B-1370</td>
 <td>0.03 &mu;g/&mu;l in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-RGD</td>
 <td>GenScript</td>
 <td>SC1208</td>
 <td>0.03 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syto 64 Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td> S-11346 </td>
 <td>1 &mu;M in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sticky slide chemotaxis 3D</td>
 <td>Ibidi</td>
 <td>80328</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l Greiner yellow bevelled tip</td>
 <td>Greiner Bio-One</td>
 <td>739261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaseline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>16415</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin wax, mp 55-57 &deg;C</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>327204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nano eNabler 10 &mu;m cantilever </td>
 <td>BioForce</td>
 <td>SPT-S-C-10s</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Image J software</td>
 <td>National Institute of Health</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Tracking plugin</td>
 <td>Fabrice Cordeli&egrave;res</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemotaxis and Migration Tool</td>
 <td>Ibidi GmbH</td>
 <td></td>
 <td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

creating adhesive and soluble gradients for imaging cell migration with fluorescence microscopy

Zellen können zu erfassen und zu höheren Konzentrationen an Klebstoff Zeitgeber wie die Glycoproteine ​​der extrazellulären Matrix und löslichen Cues wie Wachstumsfaktoren migrieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur gegenüberliegenden Gradienten aus Klebstoff und löslichen Signale in einem Mikrofluidik-Kammer, die mit lebenden Zellen zu schaffen. Ein Copolymer aus Poly-L-Lysin und Polyethylenglykol (PEG-PLL) wird eingesetzt, um Glasdeckgläser passivieren und verhindern eine unspezifische Adsorption von Biomolekülen und Zellen. Weiter, Mikrokontaktdrucken oder Dip-Pen-Lithographie verwendet werden, um Spuren von Streptavidin an den passivierten Oberflächen zu schaffen, um so Verankerungspunkte für das biotinylierte Peptid Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) als klebende Cue dienen. Mikrofluidische Vorrichtung wird auf die modifizierte Oberfläche platziert und verwendet, um den Gradienten des Klebstoffs Queues (100% bis 0% RGD RGD) an den Streptavidin Spuren zu erzeugen. Schließlich wird der gleichen mikrofluidischen Vorrichtung verwendet, um einen Gradienten eines chemoattraktiven erfolg erstellenh wie fötalem Rinderserum (FBS), wie die lösliche Cue in der entgegengesetzten Richtung des Gradienten aus Klebstoff Signale.

Zelle zu verstehen, wie Wanderungssignale integrieren 25 haben wir ein Verfahren entwickelt, um Bildzellen mit Fluoreszenzmikroskopie dass in einer Umgebung mit konkurrierenden Klebstoff und löslichen Gradienten (Abbildung 1) zu migrieren. Klebstoff Spuren, die fluoreszierende Streptavidin und biotinyliertem RGD enthalten waren, mit Mikrokontaktstruktur gedruckten Spuren und Dip-Pen-Lithographie (Abbildung 2) geschaffen. Erfolgreiche Mikrokontaktdruck wird durch die Linie Pr...

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Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

creating-adhesive-soluble-gradients-for-imaging-cell-migration-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Aufrufe.  The University of New South Wales. Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Serie: Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Microelectrode arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film polymer are expected to have extended functional lifetime because the flexible material may minimize adverse tissue response caused by micromotion. However, their flexibility prevents them from being accurately inserted into neural tissue. This article demonstrates a method to temporarily attach a flexible microelectrode probe to a rigid stiffener using biodissolvable polyethylene glycol (PEG) to facilitate precise, surgical insertion of the probe. A unique stiffener design allows for uniform distribution of the PEG adhesive along the length of the probe. Flip-chip bonding, a common tool used in microelectronics packaging, enables accurate and repeatable alignment and attachment of the probe to the stiffener. The probe and stiffener are surgically implanted together, then the PEG is allowed to dissolve so that the stiffener can be extracted leaving the probe in place. Finally, an in vitro test method is used to evaluate stiffener extraction in an agarose gel model of brain tissue. This approach to implantation has proven particularly advantageous for longer flexible probes (&gt;3 mm). It also provides a feasible method to implant dual-sided flexible probes. To date, the technique has been used to obtain various in vivo recording data from the rat cortex.

Insertion of flexible neural microelectrode probes is enabled by attaching probes to rigid stiffeners with polyethylene glycol (PEG). A unique assembly process ensures uniform and repeatable attachment. After insertion into tissue, the PEG dissolves and the stiffener is extracted. An in vitro test method evaluates the technique in agarose gel.

Einfügen von Flexible Neural Sonden mit starren Versteifungen Biodissolvable mit Klebstoff befestigt

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Forschung

Biotechnik

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polydimethylsiloxanhaltigen Polycarbonat Mikrofluidiksysteme für Zellmigrationsstudien unter Perpendicular Chemische und Sauerstoff Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...