Wir danken Dr. Grant Sumida für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch einen Beckman Young Investigator Award (SY), ein Hellman Familie New Faculty Award (SY), ein NIH EUREKA, die University of California Cancer Research Coordinating Committee unterstützt.

1. Generierung von stabilen Zelllinien (zB MDCK-Zellen) <ol><li> Platte Zellen bei 80-90% Konfluenz in einer p35 Gericht. Lassen Sie sich nicht Zellen bilden 100% konfluenten Monolayer, die Transfektionseffizienz verringern. </li><li> Schleusen die Zellen mit dem Plasmid von Interesse mit Lipofectamine 2000. Optimieren Transfektionsbedingungen mit dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Am nächsten Tag, Passage der Zellen in zwei p150 Petrischalen. Die große Schüssel wird empfohlen, genügend Abstand zwischen den stabilen Kolonien zu ermöglichen. </li><li> Am nächsten Tag das Medium wechseln und fügen 500 ug / ml G418 zu jedem Gericht. Die G418-Konzentration sollte für die einzelnen Zelllinien optimiert werden. </li><li> Ändern Medien jeden zweiten Tag für etwa 2 Wochen. Nach 2 Wochen sollte G418-resistente Kolonien beginnen sich zu bilden, und wird sichtbar mit bloßem Auge. </li><li> Mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, identifizieren GFP positive Kolonien. Markieren Sie diese Kolonien auf der Platte mit einem Sharpie Stift. </li><li> Um selektiv trypsinize die Kolonien aus dem Gewebekulturplatte absaugen aus den Medien, und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS oder Trypsin-Lösung. Auf dem zweiten waschen, nicht saugen alle die Lösung. Lassen Sie eine dünne Schicht von Flüssigkeit auf der Unterseite der Platte, um Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Für jedes markierte Kolonie: Verwendung einer sterilisierten Wattestäbchen, um so nah wie möglich abwischen um den Rand der Kolonie. Dadurch wird eine Insel der Nassbereich mit der Zelle Kolonie. Je 10 ul von Trypsin auf die Kolonie. Wiederholen Sie für jede Kolonie, und gehen schnell ein Austrocknen zu verhindern. Ein erfahrener Forscher können in der Regel holen ~ 12 Kolonien pro p150 Platte. </li><li> Inkubieren Platte bei 37 ° C für 5-10 Minuten, bis die Zellen von der Platte lösen und rund erscheinen. </li><li> Für jede Kolonie: Je 10 ul von Trypsin auf die Kolonie, und Pipette nach oben und unten ein paar Mal, um Zellen von der Platte zu lösen. Dann Pipette alle Zellen aus der Kolonie in einem einzigen gut in einer 24-Well-Schale. </li> &lt;li&gt; Nach stabile Kolonien gewachsen sind, Proteinexpression von jeder Kolonie ist mittels Standard Western Blot und Immunfluoreszenz. Erweitern Sie diese Zelllinien für die weitere Analyse. </li></ol> 2. Oberflächenmodifizierung von Glasboden Gericht für eine optimale Kollagenbindungsaktivität (Optional) <ol><li> Um silanisieren das Glas, Pipette 300 pl 2% 3-Aminopropyltrimethoxysilan Lösung auf das Glas Teil eines jeden p35 Schale mit einem 10 mm Öffnung. Siehe Abbildung 1 für die Silanisierung und Vernetzung schematisch. 3-Aminopropyltrimethoxysilan in gefiltertes Wasser verdünnt. </li><li> Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Sie die 3-Aminopropyltrimethoxysilan Lösung und wäscht mit gefiltertem Wasser dreimal für jeweils 10 Minuten. </li><li> Saugen Sie das Wasser und legen Gerichte auf heißer Platte auf 50 ° C für 1,5 Stunden. Legen Spitzen der Gerichte leicht aus der Schale, so dass Feuchtigkeit in die Schüssel entweichen kann. </li><li> Entfernen Sie Gerichte aus Hitze und lassen cool. </li><li> Pipette 300 pl 2% Glutaraldehyd-Lösung auf das Glas Portion von jedem Gericht. Die Glutaraldehyd in PBS verdünnt. </li><li> Inkubation für 1 Stunde. </li><li> Saugen Sie die Glutaraldehyd-Lösung und Geschirr spülen mit PBS dreimal für jeweils 10 Minuten. </li><li> Sterilisieren Gerichte durch die Einwirkung von UV-Licht für 1 Stunde. Die silanisierten Gerichte können bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. </li></ol> 3. Erstellung von 3D-Kollagen-Gel mit Tracer-Partikeln <ol><li> Wash fluoreszierender Tracer Partikel indem sie zum Stillstand 100 ul of stock Tracer-Partikel (10 10 Partikel / ml) in einer Zentrifuge bei 15.000 rpm für 5 Minuten saugen die Flüssigkeit, und fügen Sie 500 ul von Medien. 5 Mal wiederholen. Nach der letzten Wäsche, resuspendieren Partikel in 30 ul Medien. </li><li> Trypsinize GFP exprimierenden Zellen wie gewohnt. </li><li> Resuspendieren Zellpellet auf ca. 2 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Pipette 240 ul des Wachstums von Medien in ein Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Add 12,6 &amp;mgr; l 1 M Hepes, 20 ul gefiltertes Wasser, 50 ul Zell-Lösung, dann 10 ul von fluoreszierenden Partikeln. </li><li> Schließlich, fügen Sie 167 ul von Rindern Dermis Collagen I-Lösung (eine funktionierende Konzentration von 1 mg / ml) zu erhalten. </li><li> Mix-Lösung gründlich, dann Pipette 80 ul der Lösung auf das Glas Teil des silanisierten Glasboden Gericht. </li><li> Legen Schüssel in Inkubator und damit das Gel bei 37 polymerisieren ° C für 30 Minuten. Siehe Abbildung 1A für typische Kollagen-Gel in einer p35 Glasboden Gericht. </li><li> 2 ml Wachstumsmedium sorgfältig zu jedem Gericht. </li></ol> 4. Vorgehensweise für Zeitraffer-Bildaufnahme <ol><li> Schalten Sie die Temperaturregelung des Mikroskops Gehäuse und lassen den Umfang Kammer auf einen steady state temperieren auf 37 ° C. Siehe Abbildung 2 für ein Beispiel für Live-Cell-Imaging-System. </li><li> Ändern Medien auf die neuen Medien mit 25 mM Hepes ergänzt um einen neutralen pH-Wert aufrecht zu erhalten. FürDIC Imaging, Austausch der Spitze der Schale mit einem, dass eine Glasplatte hat. Mit einem dünnen Streifen Parafilm, decken Sie die Seite der Schale, um Medien Verdunstung zu verhindern. </li><li> Für eine Ölimmersionsobjektiv, einen Tropfen Immersionsflüssigkeit auf das Ziel. </li><li> Legen Sie die Kollagen-Gel mit Schale auf Mikroskoptisch, und vergewissern Sie sich das Gericht in Kontakt mit der Immersionsflüssigkeit. </li><li> Schwerpunkt der Probe und die Suche nach Zellen von Interesse zu Bild. Zur Minimierung der Bühne treiben, damit Teller für ca. 45 Minuten vor Beginn einer langen Aufnahme zu regeln. </li><li> Geben Sie die Parameter der Bildaufnahme. Minimieren Laserbelichtung, die die Zellen schädigen könnten, durch die Modulation der Laserleistung, Belichtungszeit, Häufigkeit und Dauer der Aufnahmezeit. Die aktuellen Parameter werden mit dem Mikroskop und Zelltyp variieren. </li><li> Während der Zeitraffer-Übernahme kann ein Inhibitor zugesetzt werden. Für den Inhibitor neben Experiment, nicht verschließen die Schale mit Parafilm. <ol><li> Prepsind Hepes ergänzt Medien mit Drogen in einer gewünschten Arbeitskonzentration. </li><li> Wenn Sie bereit sind, um Drogen zu Medien, Pause die Bilderfassung, hinzufügen und entfernen Sie vorsichtig die Schale oben, ohne die Schale. </li><li> Saugen Sie die Medien in die Schüssel, und Pipette das Arzneimittel mit Medien in die Schüssel. Ersetzen Sie dann sorgfältig die Schale oben. </li><li> Die Probe kann out-of-focus durch die Zugabe von neuen Medien, stellen Sie den Fokus. </li><li> Starten Sie die Aufnahme, überwachen Sie dann die Aufnahme für die nächsten 30 Minuten, und stellen dann wie gewünscht ein. Siehe Abbildung 4 zeigt ein Beispiel der Drogenabhängigkeit zu experimentieren. </li></ol></li></ol> 5. FRAP Verfahren und Analyse <ol><li> Die FRAP Setup variiert zwischen den Systemen, folgen Anweisungen des Herstellers. </li><li> Set up Parameter für Live-Cell-Imaging. </li><li> Set up Parameter für Bleichen. Verwenden Sie ausreichend Laserleistung auf das Fluoreszenz-Signal ohne Beschädigung der Zelle photobleach. Testen Sie diese parmesser auf die Praxis Zellen. </li><li> Starten der Aufnahme von Bildern, und warten Sie mindestens 5 Frames der Bildaufnahme vor Ausbleichen der Region von Interesse. </li><li> Weiter zu erfassen und Recovery-Zeit sollte ausreichen, um die volle fluorescence recovery erfassen. Siehe Abbildung 5 für ein Beispiel für FRAP-Experiment. </li><li> Analysieren Sie die fluorescence recovery durch die Messung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität des gebleicht Bereich (vor und nach Bleichen) über die Zeit. Mit einer statistischen Analyse-Software (zB Excel), passen die Erholung Kurve des exponentiellen Gleichung: I = I f (1-e-kt), wobei I die Intensität, I f ist die letzte Intensität, t die Zeit und τ ½ ist die Zeit, die Intensität auf die Hälfte der Endwert zu erreichen: τ ½ = ln (2) / k. Die Halbzeitpause ist ein Maß für die Mobilität des Proteins. </li><li> Erhalten Sie die Parameter, Halbzeit-und abschließenden Intensität aus dem exponentiellen Fit-Kurve. Berechnen the mobile Bruchteil, indem das Verhältnis der endgültigen zu ersten Fluoreszenz-Intensitäten. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für die live-cell imaging gesunder Epithelzellen innerhalb der Matrix ist in Abbildung 3 dargestellt. Gesunde Zellen weisen eine glatte, durchgehende Membran und deutlichen Kern, während kranken Zellen häufig eine gestörte Membran und eine übermäßige Anzahl von Vakuolen haben. In einer 3D-Matrix migrieren einzelnen Epithelzellen 1, und im Laufe von mehreren Tagen bilden Epithelzellen dreidimensionale, kugelförmige, mehrzelligen Zysten innerhalb der Matrix 2. Die Zellen sind ebenfalls sehr dynamisch, und die Migration innerhalb der Zyste (Abb. 3). Die Matrix Verformung infolge der Zugkräfte von wandernden Zellen ausgeübt wird, durch die Verschiebung der Tracer-Teilchen in der umgebenden Matrix (Abbildung 4) eingebettet analysiert. Der Tracer Partikel Bewegungen sind als maximale Projektion Bild abweichen angezeigtHNO-Zeitpunkten, und jedes Mal Punkt ist pseudo-gefärbt, um die Zeit (Abbildung 4B) zeigen. Alternativ werden die Bilder eines einzelnen Tracer Teilchen als eine Montage angezeigt, um die Bewegung des Teilchens Tracer im Laufe der Zeit (Abbildung 4C) zu zeigen. Alle Bildanalyse erfolgte mit ImageJ. Diese qualitativen Einschätzungen der Matrix Deformation und damit die Kräfte, die durch wandernden Zellen ausgeübt wird, sind nützlich, in erster Näherung der Zugkraft Verteilung. Die quantitative Bestimmung der Zugkräfte von wandernden Zellen in 3D ausgeübt wird, würde den Rahmen dieses Protokoll und wird an anderer Stelle 3,4 beschrieben. Ein typisches fluorescence recovery after photobleaching Experiment ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Region von Interesse sind gebleicht mit optimierten Laser-Einstellungen so, dass die Intensität der Fluoreszenz sichtbar ist Hintergrundwerte (an Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren) vermindert im Vergleich und gleichzeitig gesunde und unbeschädigte Zellen sein. Die optimale Einstellung muss be empirisch als jeder FRAP Setup ist anders bestimmt (zB FRAP mit Laser-Scanning-konfokalen System). Die Belichtung und Zeit-Intervall von post-FRAP Bildaufnahme müssen sorgfältig kontrolliert werden, um Hintergrund Ausbleichen zu vermeiden. Die Verwendung von niedrigeren Laserleistung, kurze Belichtungszeit, und die Verwendung von empfindlichen Kamera und hocheffizienten Optiken sind für hohe Qualität FRAP Bildgebung unverzichtbar. Wenn die Fluoreszenz Bleichen während der Bildaufnahme ist bezeichnend, muss diesem Hintergrund verblassen quantifiziert und normalisiert werden aus den beobachteten Fluoreszenzintensität Erholung. Durch 3D-Charakter der Umgebung, kann die z-Komponente der Fluoreszenz-Intensität Erholung bedeutsam werden. Deshalb ist es wichtig, eine gebleicht Volumen, indem sie vor und nach der 3D-Stapel-Bildern von gebleicht Region zu definieren. Die weitere Analyse und Modellierung von Fluoreszenz-Erholung ist an anderer Stelle 5,6 diskutiert. Die einzigartige Kombination von live-cell imaging techniques: GFP, um die Dynamik des Zytoskelett-Proteine, rote Fluoreszenz-Tracer Teilchen folgen, um die Matrix Verformung, und die Zugabe von Inhibitoren zu überwachen, können gleichzeitig für die Analyse von Protein-Dynamik, Zugkraft und molekularen Mechanismen eingesetzt werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig1.jpg" /> Abbildung 1. Herstellung von Kollagen-Gel. A) polymerisiert Kollagenmatrix auf einem Glasboden-Schüssel. Die rosa Farbe des Gels ist auf Embedded-fluoreszierende Partikel. B) Verfahren zur Behandlung der Glasboden Gerichte, die Kollagen-Gel auf der Glasoberfläche zu vernetzen. Zunächst wird der Glasboden Schüssel mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan Lösung, dann Glutaraldehyd-Lösung, die Kollagen-Matrix vernetzt, um das Glas behandelt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematics der konfokalen / FRAP Mikroskop Setup. Das konfokaleMikroskop befindet sich auf einem Zeiss AxioObserver mit einem CoolSnap HQ II CCD-Kamera basiert und vollständig Slidebook Software (Intelligent Imaging Innovations) automatisiert. Das konfokale Einheit ist speziell entwickelt und basiert auf Yokogawa drehende Scheibe Einheit CSU10 und zwei Festkörperlaser (488 nm mit 50 mW und 561 nm mit 40 mW) mit akusto-optischen Filter (AOTF) in Millisekunden Umschalten zwischen zwei Lasern lassen. Die Emission Filter 525/50 nm und 620/60 nm (# 118661 und # 118085, Chroma Technology) und dichroitische Spiegel ist 488-568 BrightLine Dual-Band (Semrock). Die Ziele sind eine lange Distanz 40x C-Apochromat Objektiv mit NA 1,1 und Arbeitsabstand von 0,62 mm und einem 63x Plan-Apochromat Objektiv mit NA 1,4 und einem Arbeitsabstand von 0,19 mm. Das Mikroskop enthält auch eine FRAP Photoablation System, das von einer Faser optisch gepumpte Farbstofflaser, einen Computer gesteuert Strahlposition und Intensität, und einem beugungsbegrenzten Spotgröße besteht. Darüber hinaus ist das Mikroskop ausgestattet miteinem xy-motorisierten Bühne, die 0,1 Mikron Längenmessgeräte auf jeder Achse enthält. Während der Zeitraffer-Bildgebung, ist die Umgebungstemperatur um ein kundenspezifisches Mikroskop Kammer und eine Heizung mit einem Feedback-Temperaturregelung aufrechterhalten. Zur Isolierung jedes Geräusch und Vibration, wird das gesamte Mikroskop-System auf einem vibrationsfreien Tisch. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig3.jpg" /> Abbildung 3. Live Cell Imaging von Epithelzellen, die GFP-Aktin. Diese Zellen bilden eine Zyste nach 4 Tagen der Kultur in einer 3D-Kollagen-Matrix. Einige Zellen bewegen sich entlang der Oberfläche der Zyste (gelbe Pfeilspitze), während andere im Inneren der Zyste (roter Pfeil) zu migrieren. Maßstab 10 um, die Zeit in Stunden. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die Wirkung von Rho-Kinase-Hemmung auf Zugkraft. A) DIC Bild eines wandernden MDCK Zelle, die GFP getaggt nukleare Marker. Das Bild wurde unmittelbar vor der Behandlung von Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 entnommen. Maßstabsleiste 10 pm. B) Particle Verschiebung durch die Zugabe von Y-27632. Die Partikel-Positionen zu verschiedenen Zeitpunkten (0 bis 52 min) wurden pseudo-farbig nach der Intensität Maßstab, dann auf ein einziges Bild projiziert. Der weiße Bereich ist der GFP positiven Kern in den wandernden Zellen. Maßstabsleiste 10 pm. Zeit in Minuten. C) Die Partikelbewegung an der Hinterkante der Zelle (siehe Pfeil in B). Asterisk bezeichnet das letzte Bild vor dem Y-27632 zusätzlich erfasst. Der Tracer Partikel bewegt hin und weg von der Hinterkante des wandernden Zellen vor und nach der Zugabe von Y-27632, bzw.. Maßstab 1 um. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3589/3589fig5.jpg" /> Abbildung 5. FRAP Analyse von GFP-Aktin exprimierende Zelle Migration in einer dreidimensionalen Matrix. A) Timelapse Bilder der GFP-Aktin exprimierende Zelle vor und nach dem Bleichen. Ein kleiner Bereich der GFP-Aktin an der Zelle hinten angesammelt wurde gebleicht (rote Pfeilspitze) Zum Zeitpunkt 0 ist. Zeit in Sekunden, Maßstab 5 um. B) Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität des gebleicht Region (durchgezogene Linie) und die exponentielle Anpassung der Fluoreszenz Recovery (Kreise) aufgetragen über die Zeit. Die Fluoreszenzintensität wurde auf den ursprünglichen Wert vor Ausbleichen normalisiert.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Verwendung live-cell imaging, die Mechanismen der Zellwanderung in einer dreidimensionalen Matrix zu studieren. Der Erfolg dieses Verfahrens hängt von den Erhalt &quot;gut&quot; Klone stabil exprimieren GFP-markierten Proteine. Das niedrige Niveau der GFP-Proteine ​​erfordert einen Überschuss Anregung Exposition der Zelle Gesundheit Kompromisse, während ein zu hoher GFP Ebene unerwünschte Nebenwirkungen auf die Zelle haben wird. Somit ist der Vektor Wahl, um Gene in Zellen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Collagen, Rinder-, Typ-I- </td><td> BD Biosciences </td><td> 354231 </td><td> Stock ist ca. 3 mg / ml </td></tr><tr><td> 3-Aminopropyltrimethoxysilan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 281778 </td><td> Verdünnen in Wasser </td></tr><tr><td> Glutaraldehyd </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 340855 </td><td> Verdünnen Sie in PBS </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Fluospheres Polystyrol-Mikrokügelchen 1 um, rote Fluoreszenz (580/605) </td><td> Invitrogen </td><td> F13083 </td><td></td></tr><tr><td> Geneticin (G418) </td><td> Invitrogen </td><td> 11811-031 </td><td></td></tr&gt; <tr><td colspan="4"> Kultur Media-Komponenten: </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31600-034 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S115500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15160-054 </td><td></td></tr></tbody></table>

live-cell imaging of migrating cells expressing fluorescently-tagged proteins in a three-dimensional matrix

Traditionell wurde die Zellwanderung auf zweidimensionalen, steife Kunststoff-Oberflächen untersucht. Doch bei wichtigen biologischen Prozessen wie der Wundheilung, Geweberegeneration und Krebs Metastasen, müssen die Zellen durch komplexe, dreidimensionale extrazelluläre Gewebe zu navigieren. Zum besseren Verständnis der Mechanismen hinter diesen biologischen Prozessen ist es wichtig, die Rolle der Proteine ​​verantwortlich für den Antrieb Zellmigration zu untersuchen. Hier skizzieren wir ein Protokoll, um die Mechanismen der Zell-Migration mit der epithelialen Zelllinie (MDCK)-Studie, und eine dreidimensionale, faserig, Selbst-Polymerisation von Matrix als Modellsystem. Diese optisch klare extrazellulären Matrix ist leicht zugänglich live-cell imaging Studien und besser imitiert die physiologische, Weichteil-Umgebung. Dieser Bericht zeigt eine Technik für die direkte Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Dynamik, und die Verformung des umgebenden dreidimensionalen Matrix. PrüfungEliminierung von Protein-Lokalisierung und Dynamik bei zellulären Prozessen bietet wichtige Einblicke in Protein-Funktionen. Genetisch kodierte fluoreszierende Tags bieten eine einzigartige Methode zur Beobachtung Proteinlokalisierung und Dynamik. Mit dieser Technik können wir die subzelluläre Ansammlung von Schlüssel zu analysieren, Kraft generierenden Komponenten des Zytoskeletts in Echtzeit, wie die Zelle Manöver durch die Matrix. Darüber hinaus mit mehreren fluoreszierenden Markierungen mit unterschiedlichen Wellenlängen, können wir die Ortung von mehreren Proteinen gleichzeitig, so dass wir zu testen, zum Beispiel, ob unterschiedliche Proteine ​​ähnliche oder unterschiedliche Rollen haben. Darüber hinaus kann die Dynamik der Fluoreszenz-markierten Proteinen quantifiziert unter Verwendung von fluoreszierenden Recovery After Photobleaching (FRAP) Analyse sein. Diese Messung Assays das Protein Mobilität und wie stabil gebunden werden die Proteine, die Zytoskelett-Netzwerks. Durch die Kombination von live-cell imaging mit der Behandlung von Protein-Funktion Inhibitoren,Wir können in Echtzeit die Änderungen in der Verteilung der Proteine ​​und die Morphologie der wandernden Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus kombinieren wir auch live-cell imaging mit der Verwendung von fluoreszierenden Tracer-Partikel in der Matrix eingebettet werden, um die Matrix Verformung während der Zellmigration zu visualisieren. So können wir visualisieren, wie eine wandernde Zelle krafterzeugenden Proteine ​​verteilt, und wo die Zugkräfte auf die umgebende Matrix ausgeübt. Durch diese Techniken können wir wertvolle Einblicke in die Rolle von spezifischen Proteinen und ihre Beiträge zu den Mechanismen der Zellwanderung zu gewinnen.

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Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Zellulären Prozessen wie Zellmigration haben sich traditionell auf zweidimensionale, steifen Kunststoff-Oberflächen untersucht. Dieser Bericht beschreibt eine Technik zur direkten Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Analyse von Protein-Dynamik in Zellen wandern in eine physiologisch relevante, dreidimensionale Matrix.

Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

live-cell-imaging-migrating-cells-expressing-fluorescently-tagged

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Aufrufe.  University of California, Davis. Zellulären Prozessen wie Zellmigration haben sich traditionell auf zweidimensionale, steifen Kunststoff-Oberflächen untersucht. Dieser Bericht beschreibt eine Technik zur direkten Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Analyse von Protein-Dynamik in Zellen wandern in eine physiologisch relevante, dreidimensionale Matrix.

Serie: Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Planar-und Drei-Dimensional Printing von Leitfähige Druckfarben

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously attaining anatomical, functional and molecular contrast in deep optically opaque tissues. While enormous potential has been recently demonstrated in the application of optoacoustics for small animal research, vast efforts have also been undertaken in translating this imaging technology into clinical practice. We present here a newly developed optoacoustic tomography approach capable of delivering high resolution and spectrally enriched volumetric images of tissue morphology and function in real time. A detailed description of the experimental protocol for operating with the imaging system in both hand-held and stationary modes is provided and showcased for different potential scenarios involving functional and molecular studies in murine models and humans. The possibility for real time visualization in three dimensions along with the versatile handheld design of the imaging probe make the newly developed approach unique among the pantheon of imaging modalities used in today&#8217;s preclinical research and clinical practice.

We provide herein a detailed description of the experimental protocol for imaging with a newly developed hand-held optoacoustic (photoacoustic) system for three-dimensional functional and molecular imaging in real time. The demonstrated powerful performance and versatility may define new application areas of the optoacoustic technology in preclinical research and clinical practice.

Universal-Hand Dreidimensionale Optoakustische Bildgebung Sonde für Deep Tissue Menschen Angiographie und Funktions präklinischen Studien in Echtzeit

The exclusive combination of high optical contrast and excellent spatial resolution makes optoacoustics (photoacoustics) ideal for simultaneously ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Elektrospinnen Schreiben von dreidimensionalen Poly(ε-caprolactone) Gerüste mit steuerbaren Morphologien für Tissue Engineering Anwendungen zu schmelzen

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...