Die Autoren danken W. Sun und K. Jansen für die kritischen Diskussionen und Unterstützung durch die Nano Biomechanics Lab erkennen an der National University of Singapore. NAK dankt für die Unterstützung durch ein Marie-Curie-Stipendium IIF.

1. Zellernte <ol><li> Erhalten MD-MBA-231-Zellen aus dem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Nehmen Zellen aus Gewebekulturplatte mit 0,5% Trypsin-EDTA-Lösung. Verwenden Sie 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung für die Zelle in einem T25-Kolben kultiviert. </li><li> Pellet-Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugation bei 200 × g für 4 min, saugt den Überstand, und die Zellen in 5 ml Kulturmedium. </li><li> Zählen der Zelldichte, ρ, unter Verwendung eines Hämocytometers. Hinweis: Um die Zellaussaat inneren Gel herzustellen, wird die Zellsuspension später verdünnt werden 10 x, um die endgültige Zellaussaatdichte zu erreichen. Daher ist 10 × konzentrierten Zellsuspension benötigt. </li><li> Berechnen Sie das Volumen des Mediums erforderlich, um eine 10 x Zellkonzentration zu erreichen: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> Hinweis: Eine endgültige Zellaussaatdichte, c Finale von etwa 215; 10 6 Zellen / ml für MD-MBA-231-Zellen empfohlen und ist in diesem Protokoll verwendet. Andere Einsaatdichten kann auch für andere Zelltypen untersucht werden. </li><li> Pellet-Zellen ein weiteres Mal in einem 15 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugation bei 200 × g für 4 min, und Aspiration des Überstands. </li><li> Die Zellen in der erforderlichen Menge (V Medium in Schritt 1.3 berechnet) von serumfreien Zellkulturmedium gründlich Zellverklumpung minimieren. Anmerkung: Phenolrot Autofluoreszenz und können mit Fluoreszenz / Reflexionsabbildungs ​​stören. Verwendung von phenolrotfreiem Medium kann als die beste Bildqualität zu erzielen. </li></ol> 2. Herstellung von Kollagenlösungen <ol><li> Besorgen Sie sich die Lager Kollagenlösung, 10 × PBS-Puffer, Milli-Q H 2 O, 0,1 M NaOH, und mehrere Reaktionsgefäße. Halten Sie alle auf dem Eis zu einer vorzeitigen Kollagen Polymerisation zu verhindern und zu pflegen steril. </li><li> Äquilibrieren einer sterilen GlasBodenschale durch Vorwärmen in der 37 ° C-Inkubator. Hinweis: Alle Bände in diesem Protokoll sind für die Glasbodenschale mit 12 mm und optimiert. Wenn andere Art von Geschirr verwendet wird, stellen Sie die Lautstärke entsprechend. </li><li> Berechnen des erforderlichen Volumens benötigt, um 50 &amp; mgr; l von 2,4 mg / ml Collagenlösung für die innere Gel (Lösung I), bezogen auf das Kollagen Stoffkonzentration herzustellen. Hinweis: Andere Kollagenkonzentrationen für die innere Gel kann ebenfalls verwendet werden. </li><li> In einer sterilen Umgebung (typischerweise ein Biosicherheitshaube), langsam 5 ul 10 × PBS-Puffer auf die gewünschte Menge an Kollagen-Stammlösung (in Schritt 2.3 berechnet) unter leichtem Schwenken. Achten Sie darauf, die Luftblasenbildung zu vermeiden. </li><li> Den pH-Wert der Mischung auf 7,4 unter Verwendung von 0,1 M NaOH unter Verwendung von kalibrierten pH-Meters. Als grobe Richtlinie, verwenden Sie etwa 5 &amp; mgr; der pH-Wert in der Nähe von 7,4 zu bringen (die Menge hängt von der Stoffkonzentration und pH-abhängig). Hinweis: Beachten Sie, dass die Volumina in diesem beteiligtSchritt zu klein ist für den Einsatz von Standard-pH-Meter. Verwenden Sie eine der folgenden Tricks: <ol><li> Bereiten Kollagenlösungen für mehrere Proben. Den pH-Wert in Groß mit Standard-pH-Meter und verteilen Sie die Kollagen-Lösungen in den Proben. </li><li> Alternativ kann die pH-Wert einer Kollagenlösung einzustellen in größeren Volumen (i. E., Volumen, das die Verwendung von Standard-pH-Meter zu ermöglichen). Beachten Sie die NaOH-Menge benötigt wird, um den pH-Wert auf den End-pH zu bringen. Verkleinere die Volumina und verwenden Sie die entsprechende Menge an NaOH für das Experiment. Bestätigen Sie den pH-Wert mit Lackmuspapier. </li><li> Andernfalls einen Mikro-pH-Elektrode, um den pH-Wert kleiner Mengen genauer einstellen. </li></ol></li><li> Man bringt die Lösung auf ein Volumen von 45 &amp; mgr; l mit H 2 O. Führen Sie alle Schritte auf dem Eis zu einer vorzeitigen Kollagen Polymerisation zu verhindern. </li></ol> 3. Bildung von Concentric Gel Kultur <ol><li> Nehmen Sie die vorgewärmte Glasbodenschale (siehe Schritt 2.2) von thE-Inkubator. </li><li> In 5 ul des 10 × konzentrierten Zellsuspension (in Schritt 1.5 vorbereitet) zu Lösung I resuspendieren gründlich. Achten Sie darauf, die Luftblasenbildung zu vermeiden. Die Mischung hat jetzt ein Volumen von 50 ul und enthält die endgültige Kollagenkonzentration (2,4 mg / ml) und die Zelldichte (c endgültige = 2 × 10 6 Zellen / ml). </li><li> Mit 20 &amp; mgr; l der Zellen enthaltenden Lösung I langsam auf die Mitte der Vertiefung, so dass es eine kuppelförmige Tröpfchen (1A) bildet. Achten Sie darauf, um eine Blasenbildung bei diesem Schritt zu vermeiden. Wenn eine Blase bildet, vorsichtig, aber schnell versuchen, entweder brechen oder sie saugen es aus mit einer Pipettenspitze. Legen Sie vorsichtig die Schale zurück in den Inkubator der innere Gel-Polymerisation für 45 Minuten zu lassen. </li><li> Bereiten Lösung O (für die äußere, azellulärer Kollagengel) etwa 15 min vor dem Ende dieser Inkubationsstufe. Anmerkung: Die äußere Gelzustand kann hinsichtlich der Kollagenkonzentration und Polymerisation pH variiert wirderhalten Netzwerken mit unterschiedlichen Mikrostrukturen 10. In diesem Protokoll werden, sich auf eine von 1,5 bis 4,0 mg / ml Kollagen-Gel bei einem pH-Wert von 7,4 polymerisiert. <ol><li> Basierend auf der Kollagenstoffkonzentration, berechnet das erforderliche Volumen benötigt, um 200 ul Kollagenlösung O in einer Endkonzentration vorzubereiten. </li></ol></li><li> In 20 ul 10 x PBS Puffer langsam auf die erforderliche Menge an Kollagen-Stammlösung (in Schritt 3.4 berechnet) unter leichtem Schwenken. Man stellt den pH der Mischung auf den End-pH unter Verwendung von 0,1 M NaOH unter Verwendung von kalibrierten pH-Meters. Siehe Hinweis zu Schritt 2.5 in Bezug auf pH-Einstellung. </li><li> Man bringt die Lösung auf ein Endvolumen von 200 &amp; mgr; l mit H 2 O. Führen Sie alle Schritte auf dem Eis zu einer vorzeitigen Kollagen Polymerisation zu verhindern. </li><li> Nehmen Sie die Schale aus dem Brutschrank nach 45 min Polymerisation des inneren Gels (siehe Schritt 3.3). Vorsichtig hinzu 180 ul Lösung A auf der Oberseite des inneren Gels, so dass die Lösung vollständig den innerenGel und füllt den gut (Abbildung 1B). <ol><li> Führen Sie diesen Schritt vorsichtig ohne Rühren der Lösung, was zu einer ungleichmäßigen Faserorientierungen in der äußeren Gel führen kann. Achten Sie darauf, nicht zu berühren das innere Gel mit einer Pipettenspitze, und um die Bildung von Blasen oder Lufteinschlüsse zu vermeiden. Wenn eine Blase bildet, vorsichtig, aber schnell versuchen, entweder brechen oder sie saugen es aus mit einer Pipettenspitze. Legen Sie vorsichtig die Schale zurück in den Inkubator, um die äußere Gel polymerisieren lassen. </li></ol></li><li> Nehmen Sie die Schale aus dem Brutschrank nach 45 min Polymerisation. Das Gel sollte schon ziemlich an dieser Stelle verfestigt werden, obwohl es immer noch von der Bodenfläche zu lösen, wenn grob behandelt. <ol><li> Vorsichtig gießen 2 ml erwärmt Zellkulturmedium in die Schale (Abbildung 1C). Achten Sie darauf, dass das Gel vollständig in das Medium eingetaucht ist. Aktualisieren Sie das Medium alle 2 - 3 Tage während der gesamten Dauer der Kultur. </li></ol></li></ol> 4. Live-Cell-Imaging <ol><li> Führen Bildgebung mit einem inversen Konfokalmikroskop mit langfristigen Lebendzell-Imaging-Fähigkeit ausgestattet. Gehören eine eingebaute Inkubationskammer mit einer Temperatur (37 ° C) und CO 2 (5%) Kontrolle. Schalten Sie das Mikroskop und erwärmen die Bühne mindestens 1 Stunde vor dem Start des Experiments. Hinweis: Verwenden Sie Objektiv mit großem Arbeitsabstand, um die Beobachtung und Lokalisierung von Zellen in den 3D-Gele zu optimieren. </li><li> Inkubieren des Gels in Medium, das 5 &amp; mgr; l Zell-Fluoreszenzfarbstoff-Tracker für 30 min, um eine genaue Lokalisierung der Zellen in der 3D-System zu ermöglichen. Anschließend entfernen ungebundenen Farbstoff durch dreimaliges Waschen mit 1 x PBS. Anschließend fügen Zellkulturmedium zu der Schale. </li><li> Nehmen Sie die Schale aus dem Inkubator nehmen und auf dem Mikroskoptisch (1D). Hinweis: Live-Cell-Imaging kann grundsätzlich direkt nach der Polymerisation der äußeren Gel starten. Jedoch zu diesem Zeitpunkt die Zellen in die inneren Gel noch nicht verbreitet. Um die Migration der ersten Zellen, die eingedrungen sind die äußere Gel kann Abbildung lebender Zellen 24 Stunden zu starten (je nach Zelltyp) nach dem Beginn der Kultur zu untersuchen. Als grobe Richtlinie, in der Umgebung von 12 bis 14 Tagen der Kultur werden für die meisten der Zellen in der inneren Gels erforderlich, um den äußeren Gels geben. </li><li> Wählen Sie die Volumes of View (VoV die) in Regionen, in der äußeren Gel um den inneren Gel. Nach 24 Stunden Inkubation wird die Zellpopulation ausgebreitet haben, überquerte die Schnittstelle zwischen den inneren und äußeren Gele, und fing an, die äußere Gel einzudringen. <ol><li> Für die VoV ist, sind die Gel-Regionen in unmittelbarer Nähe der Gel-Grenzfläche, Zwischenbereiche und Regionen nahe am Rand der äußeren Gel 7. Regionen nicht näher als 50 &amp; mgr; m von den Boden- und Seitenflächen, als auch von der Oberseite des Gels, um mögliche Randeffekte zu vermeiden. Jedes VoV Regel misst 647 x 647 x 100 um 3 (in x, Y und z-Richtung, jeweils), mit 5 &amp; mgr; m Abstand in der z -stack. </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, Bildgebungsmodi, Kanäle / Filter, Belichtungszeit und Bildauflösungen sind richtig ausgewählt. Für markierungsfreie Bildgebung des Kollagennetzwerk verwenden konfokalen Reflexionsmikroskopie gleichzeitig während der Zeitraffer-Live-Cell-Imaging. </li><li> Nehmen Sie Beispielbilder, zeichnen Sie die Intensität Histogramme, und passen Sie die Gewinne und Offsets, um eine ausreichende Signal beobachten und Sättigung zu vermeiden, indem sichergestellt wird, dass das Histogramm liegt zwischen Null und der maximalen Intensität. Diese Einstellungen nicht mehr während der gesamten Dauer des Experiments nicht verändern. </li><li> Nehmen Sie Zeitraffer-Aufnahmen der ausgewählten VoV die mit einem Zeitintervall Δ t, von 10 min 8 Stunden (oder länger, falls erforderlich). </li></ol> 5. Zellverfolgung und Datenanalyse <ol><li> Führen Sie quantitative Bildnachbearbeitung von der z -stack Bildern mit? Fall<html> te Bildverarbeitungs-Software. <ol><li> Segment die Zeitraffer-Aufnahmen, um automatisch die 3D-Zellpositionen (x, y, z, t). </li><li> Für jeden Rahmen manuell überprüfen Sie die Lokalisierungsgenauigkeit und entfernen False Positives durch Zelltrümmer und Zell Vorsprünge, die für Zellen geirrt haben kann. Entfernen proliferativen Zellen von der Analyse und Split Überlappung oder verbundenen Zellen in verschiedene Objekte. </li></ol></li><li> Generieren 3D Zeitrafferzellspuren aus den Zellkoordinaten (x, y, z, t) in dem vorhergehenden Schritt durch Verknüpfung der Position jeder Zelle in der Zeitsequenz erhalten. </li><li> Beseitigen zufälligen und Systemrauschen durch Entfernen Spuren kürzer als eine Schwellengleislänge (typischerweise 20 min). </li><li> Korrigieren Sie für die Probendrift durch Subtraktion der Gesamtnettoverschiebungen von den Gleisen, wenn nötig. </li><li> Berechnen Zell Verschiebung,iles / ftp_upload / 52.735 / 52735eq2.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt;, und die Zellwanderung Abstand, <img alt="Gleichung 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> ,, Wobei aus den beobachteten Zell Trajektorien ein Vektor, der die 3D-Position von einer Zelle an Zeit und ist die Gesamtzahl von Zeitpunkten. <ol><li> Berechnen Zellengeschwindigkeit S = d / (n • Δ t), wo Δ t ist das Zeitintervall zwischen den Rahmen. Berechnen der Zellmigration Direktionalität (oder Persistenz) mit P = &amp; Dgr; d / d. Durch diese einfache Maßnahme der Persistenz bedeutet, dass für P = 0 ist die Nettoverschiebung Null ist und für P = 1 die Bahn eine gerade Richtungslinie. </li></ol></li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+migrating+cell-induced+matrix+reorganization+on+3D+cancer+cell+migration.">Effects of migrating cell-induced matrix reorganization on 3D cancer cell migration.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7 (2), 205-217 (2014).</li><li>Achilli, M., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+mechanical+properties+of+collagen-based+scaffolds+for+vascular+tissue+engineering:+the+effects+of+pH,+temperature+and+ionic+strength+on+gelation.">Tailoring mechanical properties of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering: the effects of pH, temperature and ionic strength on gelation.</a> Polymers. 2 (4), 664-680 (2010).</li><li>Kurniawan, N. A., Wong, L. H., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stiffening+and+softening+of+collagen:+interplay+of+deformation+mechanisms+in+biopolymer+networks.">Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).</li><li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy.">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).</li><li>Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+fibrillar+matrix+architecture+on+tumor+cell+invasion+of+physically+challenging+environments.">The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments.</a> Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+limits+of+cell+migration:+control+by+ECM+space+and+nuclear+deformation+and+tuning+by+proteolysis+and+traction+force.">Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force.</a> J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration:+a+mechanistic+perspective.">Collective cell migration: a mechanistic perspective.</a> Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+modulate+microRNA-dependent+PTEN+expression+to+regulate+malignant+progression.">Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression.</a> Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+microrheology+of+heterogeneous+biopolymer+hydrogels+using+covalently+bound+microspheres.">Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).</li><li>Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+feedback+between+actomyosin+and+focal-adhesion+systems+optimizes+rapid+cell+migration.">Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration.</a> Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho/ROCK-dependent+matrix+reorganization.">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion.">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar...

Migration von Zellen spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen Reaktionen, wie der Embryonalentwicklung, Hämostase und Immunantwort als auch in pathologischen Prozessen, wie Gefäßerkrankungen, Entzündungen und Krebs 1. Sezieren der biochemischen und biophysikalischen Faktoren Zellmigration ist es daher von grundlegender Bedeutung nicht nur für die Grundprinzipien der zellulären Funktionen zu verstehen, sondern auch für verschiedene biomedizinische Anwendungen, wie zB im Tissue Engineering, Anti-Metastasen und entzündungshemmenden Medikamentenentwicklung voranzutreiben. Da in vivo Beobachtung ist technisch anspruchsvoll, hat viele Bemühungen auf die in vitro Rekapitulation Zellmigration konzentriert. In-vitro-Verfahren zur Zellmigration zu untersuchen sind weitgehend für Assays auf zweidimensionale (2D) Oberflächen der Grund auf neu konzipiert worden, vor allem oder Wundheilungs Test 2. Solche Tests bieten einfachen Versuchsaufbau, einfache Live-Cell Imaging und liefern nützliche Einblicke in verschiedene biochemische Mechanismen der Zellmigration zugrunde liegen. Allerdings sind diese Tests nicht für die extrazelluläre Matrix (ECM) Architektur und Umbau, die kritischen Aspekte im Verständnis in vivo Migration berücksichtigen. Kürzlich wurde zunehmend klar, dass ein 3D-Kulturmodell häufig Kollagen-Matrices auf der Basis 3, eine Plattform, die besser ähnelt der in vivo Situation. Tatsächlich Zellen zeigen Migrations Dynamik, die sich von denen auf 2D Oberflächen sind, insbesondere aufgrund der unterschiedlichen Dimensionalität der Umgebung 4. Darüber hinaus sind die biophysikalischen und mechanischen Eigenschaften der Matrix beeinflussen empfindlich Zellmigration 5, auch im Rahmen der Tumorzellinvasion 6. Hier präsentieren wir eine Methode zur 3D-Zellmigrationsverhalten in ECM mit biophysikalischen Eigenschaften, die mit Herstellungsbedingungen leicht variiert werden kann studieren. Die Zellen sindin einem &quot;inneren Gel&quot; ausgesät und dürfen sich zu entkommen und dringen in die anfänglich zellfreie &quot;äußeren Gel&quot;. Das Verfahren stützt sich auf die Fähigkeit der Zelle, das Vorhandensein von zu erkennen, und die Neigung in der äußeren Gel, das in engem Zusammenhang mit Zell mechanosensing 7 verbunden ist, in zellfreien Bereiche migrieren. In dieser Studie beschäftigen wir Kollagen Netzwerke wie die ECM von hoch invasiven Brustkrebszellen, MD-MBA-231 eingedrungen. Die mechanischen Eigenschaften und die Mikrostruktur sowohl der inneren und äußeren Gele können abgestimmt werden, 8 und 9 dadurch um physiologisch relevante Bedingungen zu erreichen. Rekonstruktion und Analyse der Zellspuren erlauben detaillierte quantitative Untersuchung der raumzeitlichen Wanderungsverhalten sowohl auf Bevölkerungsebene und Einzelzellebene. Wichtig ist, dass der Aufbau des konzentrischen Gelsystem ahmt die in vivo Gewebetopologie durch wandernde Zellen, insbesondere Krebszellen eindringen und bietet somit wichtige Einblicke in konfrontiertan die physikalischen Mechanismen der Zellmigration und Metastasierung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Fisher Scientific Pte Ltd</td>
			<td>Model: 371, S/No 318854-6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td></td>
			<td>Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C2927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dish</td>
			<td>IWAKI Cell Biology</td>
			<td>3931-035</td>
			<td>35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iN CYTO</td>
			<td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprocessor pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>pH 211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutragen Collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>#5010-D</td>
			<td>Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S/No 29153352</td>
			<td>Basic pH Meter PB-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration

Die Fähigkeit von Zellen zur Migration entscheidend ist in einer Vielzahl von Zellfunktionen während des gesamten Lebens aus embryonalen Entwicklung und bei der Wundheilung zur Tumor- und Krebsmetastasierung. Trotz intensiver Forschung, die grundlegenden biochemischen und biophysikalischen Prinzipien der Zellwanderung immer noch nicht vollständig verstanden, insbesondere in ihre physiologisch relevanten dreidimensionalen (3D) Mikroumgebungen. Hier beschreiben wir ein in vitro Test zur quantitativen Untersuchung der 3D-Zellmigration Verhalten ermöglichen. Das Verfahren nutzt mechanosensing Fähigkeit der Zelle, und die Neigung, in vorher unbesetzten extrazellulären Matrix (ECM) zu migrieren. Wir nutzen die Invasion von hochinvasiven Brustkrebs-Zellen, MDA-MB-231, in Kollagengele als Modellsystem. Die Verbreitung der Zellpopulation und die Migrationsdynamik einzelner Zellen über Wochen Kultur kann mit Abbildung lebender Zellen überwacht und analysiert, um raumzeitlich aufgelösten Daten zu extrahieren. Darueber HinausDas Verfahren ist für verschiedene extrazelluläre Matrizen leicht an und bietet so eine einfache, aber leistungsstarke Möglichkeit, die Rolle der biophysikalischen Faktoren in der Mikroumgebung auf die Zellmigration zu untersuchen.

Die konzentrische Geltest hier vorgestellt wurde unter Verwendung hochinvasiven Brustkrebszellen MDA-MB-231 mit 2,4 mg / ml inneren Kollagen-Gel und einer Zellansiedlungsdichte = 2 x 10 6 Zellen / ml, als Beispiel. Wie in Abbildung 2 dargestellt, in der Regel nach wenigen Tagen Kultur verletzt die Zellen die Innen-Außen-Gel-Grenzfläche und damit begonnen, die äußeren Gel einzudringen. Die Zellpopulation verbreiten überwiegend radial nach außen. Die Polymeris...

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Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Die mechanischen Eigenschaften und die Mikrostruktur der extrazellulären Matrix stark beeinflussen 3D Migration von Zellen. In vitro-Verfahren, um die Raumzeit-Zellmigrationsverhalten in biophysikalisch variable Umgebungen sowohl Bevölkerung und einzelnen Zellebenen zu studieren, wird beschrieben.

Concentric Gel-System, um die biophysikalische Rolle der Matrix Mikromilieu auf 3D-Zellmigration Studieren

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K Aufrufe.  FOM Institute AMOLF.  Die mechanischen Eigenschaften und die Mikrostruktur der extrazellulären Matrix stark beeinflussen 3D Migration von Zellen. In vitro-Verfahren, um die Raumzeit-Zellmigrationsverhalten in biophysikalisch variable Umgebungen sowohl Bevölkerung und einzelnen Zellebenen zu studieren, wird beschrieben. 

Serie: Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Forschung

Biotechnik

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Studium der Zellmigration in Microfabricated Kanäle

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Diffusionssystem, um Chemotaxis in einem 3D-Kollagen-Matrix Untersuchen

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

Markierung extrazellulärer Vesikel zur Überwachung der Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

Mikrogel-extrazelluläre Matrix-Komposit-Unterstützung für den eingebetteten 3D-Druck menschlicher neuronaler Konstrukte

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...