Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse GM45916 und GM66834 zu JCH und ein Stipendium der Internationalen Rett Syndrome Foundation, diese Arbeit AK unterstützt wurde auch von NIH gewähren GM088409 und Howard Hughes Medical Institute Beiträge zur KL unterstützt

1. Montage von rekombinantem Core-Histone in Octamere Begründung: Der erste Schritt in nukleosomalen Array Rekonstitution ist es, nativen Kern Histon Octamere aus lyophilisierten rekombinanten Histone vorzubereiten. Histon-Proteine ​​werden in äquimolaren Mengen kombiniert und durch Dialyse der Proben aus einem denaturierenden Puffer in Rückfaltungspuffer in Histon Octamere montiert. <ol><li> Entschlacken und lyophilisiert rekombinanten Histone (H2A, H2B, H3, H4) wie beschrieben 13. </li><li> Auflösen etwa 5 mg jeder lyophilisierten Kern Histon in 3 ml Entfaltungspuffer (6 M Guanidinium-HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT). Es jedem Aliquot für mindestens eine Stunde auflösen. Sicherzustellen, dass kein Protein an den Seiten des Behälters verbleibt. </li><li> Messen Sie die Absorption jeder Histon bei 276 nm mit Entfaltung Puffer als Referenz. </li><li> Berechnen Sie die Molarität von jedem Histon mit ihren Extinktionskoeffizienten (siehe Tabelle 1 </strong&gt; für Xenopus Histon Extinktionskoeffizienten). Vergleichen der Absorption bestimmten Konzentration des Histons an die lyophilisierte Trockenmasse, und Schätzung, wenn der Großteil des Proteins gelöst. </li><li> Bestimmen Sie, welche Histon Sie die wenigsten Mol haben, da dies die Höchstzahl der Mole für alle Histone sein. </li><li> Vereinige die Histone in gleichen molaren Mengen und Entfalten Puffer auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml zu verdünnen. </li><li> Legen Sie die Probe in 6-8 kDa MWCO Dialyseschlauch. Abdichten des Schlauchs aufnehmen und in 2 l kaltes Rückfaltungspuffer (2 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 mM β-Mercaptoethanol). </li><li> Dialyse der Probe für 18 Stunden bei 4 ° C unter Rühren. Sicherstellen, dass die Dialyseschläuche frei und kräftig zu drehen, oder aber die Histone ausfallen. </li><li> Ändern Sie zweimal in der 18 Stunden-Zeitraum (dh ändern Sie die Rückfaltungspuffer über jede 6 Stunden, bis getan) die Dialysepuffer. Auch wenn Niederschlag bildet nicht verwerfendie Probe kann einige Octamer gewonnen, wobei die Ausbeute wird verringert werden. </li></ol> Hinweis: Siehe Schritt 2.1-2.2 Spaltenausgleich für den nächsten Tag vorzubereiten. 2. Reinigung von Histon Octamere durch Size Exclusion Chromatography Begründung: Nach dem Abschluss mit § 1, werden Proben Histon Octamere sowie andere Histon-Komplexe wie Aggregate, H3/H4 Tetramere und Dimere H2A/H2B enthalten. Histon Octamere wird von diesen anderen Komplexen mit Größenausschluss-Chromatographie (SEC) gereinigt werden. <ol><li> Schließen Sie einen HiLoad 16/60 Superdex 200 16/60 (S200) Spalte zu einer FPLC-System. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in das System nicht. </li><li> Reinigen Sie die Spalte S200 mit 0,2 um gefiltertes Wasser. Verwenden Sie eine Durchflussrate von 0,3 ml / min und setzen einen Gegendruck Grenze von 0,5 MPa. Stellen Sie sicher, Sie haben genug Wasser und lassen Sie die Spalte, über Nacht zu reinigen. </li><li> Äquilibrieren Sie die S200-Säule und Probenschleife des FSPS über Rückfaltungspuffer. Verwenden 1 L von 0,2 um filtriert Rückfaltungspuffer. Rückfaltungspuffer fließen durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min und einem maximalen Druck von 0,5 MPa für ca. 2 Stunden. </li><li> Äquilibrieren einer Vivaspin Zentrifugal-Konzentrator (MWCO 50 kDa) mit 1 ml Rückfaltungspuffer. Entfernen der Probe aus Dialyseschlauch und Zentrifugieren der Probe bei 4 ° C bis keine Niederschläge zu entfernen. Pipettieren des Probenüberstand in den Konzentrator. Konzentrieren sich die Probe bis auf ein Volumen von etwa 500 &amp;mgr;. </li><li> Entfernen Sie die konzentrierte Octamers Probe in einen neuen Container und spülen Sie den Konzentrator mit 1 ml Rückfaltungspuffer. Konzentrieren Sie die Spülung auf 500 ul und es an die Oktamer Probe hinzufügen. Dies hilft, das noch in der Konzentrator restlichen Octamers retten. </li><li> Drehen die Probe in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für 5 Minuten bei 10.000 UpM bei 4 ° C Sammeln Sie den Überstand und übertragen in ein neues Röhrchen. Dies hilft, jede Niederschlag vor dem Laden der Probe auf der FPL entfernenC. </li><li> Laden der Probe auf die Säule S200. Laden Sie ein Maximum von 1,5 ml Volumen oder 15 mg Oktamer in einem einzigen Reinigungs. </li><li> Eluiere das Beispiel mit frisch gemachten Rückfaltungspuffer. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min und eines Rückdrucks Grenze von 0,5 MPa. Verwenden Sie zwei Säulenvolumen (400 ml) Rückfaltungspuffer und 2 ml Fraktionen. Überwachung der Absorption bei 280 nm während der Elution. Die verschiedenen Arten werden in der Reihenfolge der abnehmenden Größe zu eluieren. Histon-Aggregaten in der Regel eluieren bei etwa 45 ml, Oktamer bei etwa 65 ml, und Dimer zu etwa 84 ml (Abbildung 1). </li><li> Analyse der Elutionsfraktionen von Peaks von Interesse indem Proben auf einem 18-20% SDS-PAGE. Fraktionen, die gereinigtes Octamere sollten gleichen molaren Mengen der vier Kern-Histon-Proteine ​​(Abbildung 1). </li><li> Pool der Fraktionen, die gereinigt Octamere enthalten und zu konzentrieren, um mit einer Vivaspin Zentrifugal-Filter ≤ 15 mg / ml. Wenn links verdünnter kann Octamere distanzieren into H2A/H2B Dimere und Tetramere H3/H4. </li><li> Bestimmen die Octamer Konzentration durch Messen der Absorption bei 280 nm und die Berechnung unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von Tabelle 1. </li><li> Histon Octamere kann kurzfristig in Rückfaltungspuffer bei 4 ° C gehalten werden, Wenn gespeichert wird langfristig die Octamere bei -20 ° C in einer 50% Glycerinlösung stabiler. Octamere in Glycerin gelagert werden, sollten vor der Absorptionsmessungen an die frische Rückfaltungspuffer dialysiert werden und die Verwendung in nukleosomalen Array Rekonstruktionen. </li></ol> 3. Rekonstitution der nukleosomalen Arrays aus DNA und gereinigtes Octamere Begründung: Rekonstitution der nukleosomalen Arrays erfordert, dass Histon-Octamere-und Template-DNA an spezifischen molaren Verhältnissen kombiniert werden. Mischungen von DNA und Histon Octamere in 2 M NaCl sind Schritt in die Puffer abnehmender Ionenstärke dialysiert. Eine allmähliche Änderung niedrigeren Salzbildung gewährleistet eine ordnungsgemäße Nukleosomen. Beziehen nucleosomal Arrays mit dem gewünschten Grad der Sättigung Histonoktamer der Template-DNA erfordert kleinen Test Rekonstruktionen, gefolgt von einem großen Maßstab präparative Rekonstitution. Die durch die Klein Rekonstruktionen definierten geeigneten Bedingungen verwendet, um die Wiederherstellungs führen. <ol><li> Reinige hintereinander wiederholt, wie beschrieben, 4,12 Nukleosomen-Positionierung DNA. Kurz gesagt, die Plasmid-DNA zu isolieren, unter Verwendung eines Qiagen GigaPrep-Kit oder ein ähnliches Produkt. Set-up eines Restriktionsenzyms, um die Template-DNA freizusetzen und verdauen die Plasmid-DNA auf kleinere Größen (≤ 700 bp) zu verdauen. Die Matrizen-DNA kann dann von den kleinen Plasmid DNA Reste mit Größenausschluss-Chromatographie (SEC) gereinigt werden. Ein Schwerkraftsäule mit einer Höhe von etwa 115 cm mit Sephacryl S-1000 Perlen gepackt ist ausreichend für die Reinigung von 601 x 207bp 12mer DNA. </li></ol> Hinweise: Für die Reinigung von Plasmid-DNA bei verringerten Kosten, sondern erhöht effort, kann man alkalische Lyse mit Phenol / Chloroform DNA-Reinigung, um Plasmid-DNA aus E. isolieren verwenden coli 23,24. Strategien zur Trennung von Template-DNA aus Plasmid-DNA kann mit Veränderungen in der DNA-Vorlage Größe variieren. Für SEC ist es wichtig, die Einrichtung der Restriktionsenzym in einer Weise, die den Unterschied in der Größe zwischen der Vorlage und Plasmid-DNA maximiert verdauen. <ol start="2"><li> Bestimmen, welche Molverhältnisse (r), die für Wiederherstellungen verwendet. R ist gleich dem Verhältnis der Mole von Oktamer auf Mole DNA wiederholen. Für einen ersten kleinen Versuche, r-Werte von 0,9, 1, 1,1 und angemessen, wenn die Absicht besteht, gesättigten nukleosomalen Arrays zu erhalten. </li><li> Vorbereitung der kleinen Proben durch Berechnung des Betrags der Oktamer auf etwa 18 ug DNA pro Molverhältnis zu prüfenden hinzuzufügen. Mischen Sie die DNA und Histon Octamere. Die Endkonzentration von NaCl in der Probe sollte ≥ 2 m, und die Endkonzentration von DNA sollten rund 0,3 ug / ul sein. Die endgültige Probe Pufferbedingungen sollten auch 10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA. </li><li> Die Proben sind nun bereit für die Dialyse. Laden Sie die Proben in 12k-14k MWCO Dialyseschlauch. Dialysiere die Proben gegen 2 l Puffer abnehmender Ionenstärke wie folgt. </li></ol> Bauteile in den Puffer: 10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA. Puffer 1 (Add 1 M NaCl, 1 mM DTT) für 5-6 Std. Puffer 2 (Add 0,75 M NaCl, 1 mM DTT) über Nacht. Puffer 3 (Add 2,5 mM NaCl, 1 mM DTT) für 5-6 Std. Buffer 4 (Add 2,5 mM NaCl, 0,1 mM PMSF) über Nacht. <ol start="5"><li> Entfernen Sie die Proben aus dem Dialyseschlauch und fahren Sie Abschnitte 6.4. Wenn die kleinen Proben ergeben die gewünschten Ergebnisse, wiederholen Sie die Schritte in den Abschnitten 6.3 auf der großen Skala. </li></ol> Hinweis: Um Ressourcen zu schonen, sollten kleinere Proben das Mindestvolumen notwendig, für nachgelagerte Screening-Tests genügen haben. Um e habennough Probe für die hier aufgeführten Sedimentationsgeschwindigkeit und AFM-Experimente wurden 50 ul-Proben mit 0,3 mg / ml DNA geeignet sind. Die Größe der in großem Maßstab, sind präparativen Proben abhängig von ihrem Verwendungszweck. Ein Groß Probe sollte in der gleichen Weise wie die kleinen Proben hergestellt werden. 4. Sedimentationsgeschwindigkeit Analyse der rekonstituierte nukleosomalen Arrays Begründung: Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente im Beckman XL-A / I analytischen Ultrazentrifuge Ausbeute Informationen über die Größe und Form der Moleküle in Lösung. Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente unter Niedrigsalzbedingungen durchgeführt werden, verwendet, um das Ausmaß, in dem die rekonstituierten Arrays mit Nukleosomen gesättigten bestimmen. <ol><li> Die Probe zu verdünnen, um eine Absorption in der Umgebung von 0,5 bei 260 nm mit TEN-Puffer (10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA, 2,5 mM NaCl). Laden 400 ul Probe in eine Zelle mit einem Zweikernsektor, wobei die Probe auf der einen Seite und dem Refece (TEN-Puffer) 25 auf der anderen. Halten Sie die Referenz Meniskus höher als die Probe Meniskus (Hinzufügen von 420 ul Referenzlösung). </li><li> Laden der Zellen in den Rotor, und richten die Zellen richtig mit den Hash-Zeichen auf dem Boden der Zellen und des Rotors 25. Vorsichtig reinigen Sie die Linsen der Zellen unter Verwendung von Druckluft. </li><li> Schalten Sie die Zentrifuge XL-A/XL-I, legen Sie den Rotor und befestigen und sichern Sie die Optik wie in der Anleitung beschrieben. Öffnen Sie die Proteome Lab Software und wählen Sie Datei: Neu. </li><li> Einrichten einer einzigen Scan laufen bei 3.000 Umdrehungen pro Minute und einer Temperatur von 25 ° C Unter Optionen wählen Sie Stop nach dem letzten Scan und Radiallauf Kalibrierung (radiale Kalibrierung ist nicht notwendig, wenn der Rotor war der letzte in der AUC verwendet Rotor). </li><li> Für jede Zelle, die Bezeichnung der Proben, wählen Sie eine Wellenlänge (260 nm), wählen Absorption, und wählen Sie eine Datei speichern Speicherort auf Ihrem Computer. Beginnen Sie die einzelnen Scan laufen. </li><li> Verwenden Sie die einzelnen Scan, um die entsprechende ra bestimmenWahlscanlänge (Abbildung 2A). Verringern der Länge der Zelle, die untersucht werden sollen verringert die Laufzeit. Jedoch sicher sein, um die Probe Meniskus sind und sich das Ende sehr nahe oder an der Unterseite der Zelle. </li></ol> Anmerkung: Einzelscans kann der Messbereich durch Messungen begonnen, kurz bevor die Probenmeniskus (2A) verkürzt werden. Die meisten der während der AUC-Lauf erzeugt Scans sollten Grenze Fraktionen Vergangenheit des Meniskus sowie stabile Plateaus (2B) haben. Schmutzige Gläser auf den AUC-Zellen können Scans mit großen Spitzen erzeugen, können diese Analyse der Daten beeinflussen. Die Ultrascan-Software umfasst ein Handbuch, das eine große Ressource für Informationen über die Analyse von Daten analytische Ultrazentrifugation 26 ist. <ol start="7"><li> Mit der XL-A/XL-I Bedienfeld, geben Sie eine Geschwindigkeit von 0 und Start drücken. Dies wird die Zentrifugenkammer aufgefordert, um ein Vakuum zu ziehen und alleow die Temperatur der Kammer zu äquilibrieren. Warten Sie 1 Stunde, um für Temperaturausgleich vor Beginn einer Lauf zu ermöglichen. </li><li> Verwenden Sie die Software, um den Lauf für die gewünschte Geschwindigkeit und Anzahl der Scans eingestellt. Höhere Geschwindigkeiten erhöhen Auflösung, aber man sollte mindestens 20 Scans (vorzugsweise mehr) zu sammeln, bevor die Probe auf dem Boden der Zelle sedimentiert. Es ist zweckmäßig, die letzten Scans (im Optionsmenü erreicht), um den Fortschritt der Lauf überwachen und auf mögliche Probleme wie undichte Zellen überlagern. Überwachen Sie die ersten paar Scans um den ordnungsgemäßen Betrieb zu gewährleisten. </li></ol> 5. Bearbeiten und Analysieren von Sedimentation Geschwindigkeitsdaten Begründung: Rohmaterial Sedimentationsgeschwindigkeit Daten durch ein Programm, das eine Diffusionskorrigierten Sedimentationskoeffizientenverteilung ergibt analysiert werden. Diese Informationen wiederum gibt den Bruchteil eines rekonstituierten Probe, die einen bestimmten Sättigungspegel enthält, z. B. </em&gt; bei Verwendung eines 12-mer-DNA-Matrize wird es möglich sein, den Bruchteil des rekonstituierten Arrays 10, 11 und 12 Nukleosomen / DNA hat bestimmen. <ol><li> Verwenden Sie AUC Datenanalyse-Software wie Ultrascan, um die Daten 26 bearbeiten. Bearbeitung von Scan-Daten müssen für jede Zelle durchgeführt werden und erzeugt eine Datenmenge für eine nachfolgende Analyse. Ordnungsgemäßen Bearbeitung von Abtastungen beinhaltet die Definition der Probe Meniskus, wodurch die Daten in eine Region von Interesse, und Definieren Basis sowie Plateaubereiche (Fig. 2). Unerwünschte Scans können auch aus den Daten an dieser Stelle gesetzt entfernt werden. Jedoch, da es möglich ist, unerwünschte Scans während der Analyse zu entfernen, empfiehlt es sich, daß alle Abtastungen an dieser Stelle gehalten werden. </li><li> Wir empfehlen dringend, dass die verbesserte van Holde-Weischet-Methode verwendet, um die Daten zu analysieren 27 werden. Dieses Analyseverfahren korrigiert für die Effekte der Diffusion im Laufe des Versuchs und liefert die integrale Verteilung der Sedimentationskoeffizienten. InsbesondereDie erhöhte van Holde-Weischet Verfahren (wie in Ultra implementiert) für die Aufnahme des Scans, die stabile Plateaus fehlt, oder die Randfraktionen, die den Meniskus in der Analyse 28 nicht gelöscht sind, enthalten kann. </li><li> Bestimmung der Verteilung der Sedimentation Koeffizienten für die zusammengebauten Anordnungen. Repräsentative Ergebnisse für 601-12 (207bp, 12-mer) nukleosomalen Anordnungen in Fig. 3 gezeigt. </li><li> Wenn eine der kleinen Proben enthält Arrays mit dem gewünschten Bereich von Sedimentationskoeffizienten, wiederholen Sie den Vorgang mit einer erhöhten Skala beginnend mit Abschnitt 3. Wenn keine der kleinen Proben hat eine angemessene Verteilung der Sedimentationskoeffizienten dann mit einem neuen R-Bereich ab Punkt 3 wiederholen Sie die kleinen Tests. </li></ol> 6. Visualisierung nukleosomalen Arrays Mit Atomic Force Microscopy (AFM) Begründung: AFM ermöglicht die Visualisierung der Sättigungsgrad von nucleosomal-Arrays. Diese Technik ergänzt Sedimentationsgeschwindigkeit von AUC und Restriktionsverdau als Qualitätskontrolltest. <ol><li> Mit oben beschriebenen Methoden erhalten eine gut gesättigt Nukleosomen-Array (5A). </li><li> Bereiten APTES behandelten Glimmer Folien, indem ~ 30 ul 1:1000 Verdünnung der kommerziellen (Sigma-Aldrich (3-Aminopropyl) triethoxysilan A3648-100 ml) in 0,22 um filtriert Nanopure-Wasser für 30 min. </li><li> Nach 30 min spülen Sie die APTES mit gefiltertem Wasser und trocknen Sie sie sanft in einem Stickstoffstrom. </li><li> Legen Sie entsprechend verdünnten Probe Nukleosomen Array (~ 1,5 ng / ul) auf der Folie, und bei Raumtemperatur 15 Minuten abgedeckt. </li><li> Spülen Sie probieren mit gefilterten Probenpuffer, trocken wie zuvor, und statt Schlitten auf der Bühne des AFM (in diesem Fall ein Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope). </li><li> Starten Sie durch Abbildung 2 x 2 um Scans mit 512 Bildzeilen. Zähle die Anzahl der Nukleosomen auf Ebene der sa ermittelnturation (5B). </li><li> Idealerweise sollten Sie Bildbereiche auf dem Objektträger mit gut getrennt Nukleosomen-Arrays. </li><li> Für Bilder mit höherer Auflösung kann ein 500 x 500 nm-Scan erhalten werden (Abbildung 5C). </li><li> Bilder können abgeflacht und mit der MFP-3D-Software zur Verfügung gestellt von Asylum analysiert. </li><li> Jedes Bild kann in vier Quadranten unterteilt und in digital gezoomt, um eine bessere Sicht auf gut getrennten Arrays und mehrere Freihandlinien können durch die Arrays und Höhenprofile erstellt werden für die Nukleosomen (5C, rechte Tafel-Höhe Spur erhalten erhalten und 5D). </li><li> Mehrere solcher Bilder für jedes Array-Typ, die mehrere Hunderte von Nukleosomen analysiert werden. Höhenprofile werden erfasst, kategorisiert und in MS Excel aufgetragen. </li></ol>

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	<li>Luger, K., Mader, A., Richmond, R., Crystal Sargent, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution.">structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 7, (1997).</li><li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dynamics+of+the+chromatin+fiber+in+solution:+determinants,+mechanisms,+and+functions.">Conformational dynamics of the chromatin fiber in solution: determinants, mechanisms, and functions.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 361-392 (2002).</li><li>McBryant, S., Adams, V., Hansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+architectural+proteins.">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li><li>Hansen, J. C., Ausio, J., Stanik, V. H., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+reconstituted+oligonucleosomes,+evidence+for+salt-dependent+folding+in+the+absence+of+histone+H1.">Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt-dependent folding in the absence of histone H1.</a> Biochemistry. 28 (23), 9129-9136 (1989).</li><li>Szerlong, H. J., Prenni, J. E., Nyborg, J. K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activator-dependent+p300+acetylation+of+chromatin+in+vitro:+enhancement+of+transcription+by+disruption+of+repressive+nucleosome-nucleosome+interactions.">Activator-dependent p300 acetylation of chromatin in vitro: enhancement of transcription by disruption of repressive nucleosome-nucleosome interactions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (42), 31954-31964 (2010).</li><li>Cirillo, L. A., Lin, F. R., Cuesta, I., Friedman, D., Jarnik, M., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+of+compacted+chromatin+by+early+developmental+transcription+factors+HNF3+(FoxA)+and+GATA-4.">Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4.</a> Molecular Cell. 9 (2), 279-289 (2002).</li><li>Nguyen, C., Gonzales, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=chromatin+structure+associated+with+methylation-induced+gene+silencing+in+cancer+cells:+correlation+of+accessibility,+methylation,+MeCP2+binding+and+acetylation.">chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation.</a> Nucleic Acids Research. 29 (22), 4598-4606 (2001).</li><li>Cuesta, I., Zaret, K. S., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+forkhead+factor+FoxE1+binds+to+the+thyroperoxidase+promoter+during+thyroid+cell+differentiation+and+modifies+compacted+chromatin+structure.">The forkhead factor FoxE1 binds to the thyroperoxidase promoter during thyroid cell differentiation and modifies compacted chromatin structure.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (20), 7302-7314 (2007).</li><li>Simpson, R. T., Stafford, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+a+phased+nucleosome+core+particle.">Structural features of a phased nucleosome core particle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 80 (1), 51-55 (1983).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Lowary, P., Widlund, H., Cao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+and+free+energies+of+selected+natural+and+non-natural+nucleosome+positioning+DNA+sequences.">Sequence motifs and free energies of selected natural and non-natural nucleosome positioning DNA sequences.</a> Journal of Molecular Biology. 288, 213-229 (1999).</li><li>Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Core+Histone+N-terminal+Tail+Domains+Function+Independently+and+Additively+during+Salt-dependent+Oligomerization+of+Nucleosomal+Arrays+*.">The Core Histone N-terminal Tail Domains Function Independently and Additively during Salt-dependent Oligomerization of Nucleosomal Arrays *.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 33701-33706 (2005).</li><li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution.">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 119 (4), 1-16 (1999).</li><li>McBryant, S. J., Klonoski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+histone+H4+N-terminal+domain+function+during+nucleosomal+array+oligomerization:+roles+of+amino+acid+sequence,+domain+length,+and+charge+density.">Determinants of histone H4 N-terminal domain function during nucleosomal array oligomerization: roles of amino acid sequence, domain length, and charge density.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (25), 16716-16722 (2009).</li><li>Ma Shogren-Knaak, ., Fry, C. J., Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+native+peptide+ligation+strategy+for+deciphering+nucleosomal+histone+modifications.">A native peptide ligation strategy for deciphering nucleosomal histone modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15744-158 (2003).</li><li>Lu, X., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+H3K79+dimethylation+and+H4K20+trimethylation+on+nucleosome+and+chromatin+structure.">The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (10), 1122-1124 (2008).</li><li>Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+Ultracentrifugation+for+the+Analysis+of+Chromatin+Structure.">Analytical Ultracentrifugation for the Analysis of Chromatin Structure.</a> Biophysical Chemistry. 86 (2-3), 141-153 (2000).</li><li>Hansen, J., Kreider, J., Demeler, B., Fletcher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+and+agarose+gel+electrophoresis+as+tools+for+studying+chromatin+folding+in+solution.">Analytical ultracentrifugation and agarose gel electrophoresis as tools for studying chromatin folding in solution.</a> Methods. 12 (1), 62-72 (1997).</li><li>Montel, F., Menoni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+individual+nucleosomes+controls+the+chromatin+condensation+pathway:+direct+atomic+force+microscopy+visualization+of+variant+chromatin.">The dynamics of individual nucleosomes controls the chromatin condensation pathway: direct atomic force microscopy visualization of variant chromatin.</a> Biophysical Journal. 97 (2), 544-5453 (2009).</li><li>Muthurajan, U. M., McBryant, S. J., Lu, X., Hansen, J. C., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+region+of+macroH2A+promotes+self-association+of+nucleosomal+arrays.">The linker region of macroH2A promotes self-association of nucleosomal arrays.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (27), 23852-23864 (2011).</li><li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+nucleosomes+revealed+by+time-lapse+atomic+force+microscopy.">Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy.</a> Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).</li><li>Lohr, D., Bash, R., Wang, H., Yodh, J., Lindsay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+atomic+force+microscopy+to+study+chromatin+structure+and+nucleosome+remodeling.">Using atomic force microscopy to study chromatin structure and nucleosome remodeling.</a> Methods (San Diego, Calif). 41 (3), 333-341 (2007).</li><li>Dyer, P. N., Edayathumangalam, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+nucleosome+core+particles+from+recombinant+histones+and+DNA.">Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA.</a> Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+loading,+and+alignment+of+an+analytical+ultracentrifuge+sample+cell.">Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell.</a> J. Vis. Exp. (33), e1530 (2009).</li><li>Demeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UltraScan:+a+comprehensive+data+analysis+software+package+for+analytical+ultracentrifugation+experiments.">UltraScan: a comprehensive data analysis software package for analytical ultracentrifugation experiments.</a> Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques. , 210-230 (2005).</li><li>Holde, K. V., Weischet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boundary+analysis+of+sedimentation+velocity+experiments+with+monodisperse+and+paucidisperse+solutes.">Boundary analysis of sedimentation velocity experiments with monodisperse and paucidisperse solutes.</a> Biopolymers. 17 (6), 1387-1403 (1978).</li><li>Demeler, B., van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sedimentation+velocity+analysis+of+highly+heterogeneous+systems.">Sedimentation velocity analysis of highly heterogeneous systems.</a> Analytical Biochemistry. 335, 279-288 (2004).</li><li>Hansen, J., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+structural+properties+of+subsaturated+chromatin+arrays.">Assembly and structural properties of subsaturated chromatin arrays.</a> Journal of Biological Chemistry. 8, 5840-5848 (1993).</li><li>Routh, A., Sandin, S., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+repeat+length+and+linker+histone+stoichiometry+determine+chromatin+fiber+structure.">Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 105 (26), 8872-8877 (2008).</li><li>Zhou, J., Fan, J. Y., Rangasamy, D., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleosome+surface+regulates+chromatin+compaction+and+couples+it+with+transcriptional+repression.">The nucleosome surface regulates chromatin compaction and couples it with transcriptional repression.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (11), 1070-1076 (2007).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleosome+arrays+reveal+the+two-start+organization+of+the+chromatin+fiber.">Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber.</a> Science (New York, N.Y.). 306 (5701), 1571-1573 (2004).</li><li>Correll, S. J., Schubert, M. H., Grigoryev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Short+nucleosome+repeats+impose+rotational+modulations+on+chromatin+fibre+folding.">a Short nucleosome repeats impose rotational modulations on chromatin fibre folding.</a> The EMBO Journal. 31 (10), 2416-2426 (2012).</li><li>Mcbryant, S. J., Krause, C., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Silent+Information+Regulator+3+Protein+,+SIR3p+,+Binds+to+Chromatin+Fibers+and+Assembles+a+Hypercondensed+Chromatin+Architecture+in+the+Presence+of+Salt.">The Silent Information Regulator 3 Protein , SIR3p , Binds to Chromatin Fibers and Assembles a Hypercondensed Chromatin Architecture in the Presence of Salt.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (11), 3563-3572 (2008).</li><li>Schalch, T., Duda, S., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structure+of+a+tetranucleosome+and+its+implications+for+the+chromatin+fibre.">X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre.</a> Nature. 436 (7047), 138-1341 (2005).</li><li>Fan, J. Y., Gordon, F., Luger, K., Hansen, J. C., Tremethick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+histone+variant+H2A.Z+regulates+the+equilibrium+between+different+chromatin+conformational+states.">The essential histone variant H2A.Z regulates the equilibrium between different chromatin conformational states.</a> Nature Structural Biology. 9 (3), 172-176 (2002).</li><li>Carruthers, L. M., Bednar, J., Woodcock, C. L., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linker+histones+stabilize+the+intrinsic+salt-dependent+folding+of+nucleosomal+arrays:+mechanistic+ramifications+for+higher-order+chromatin+folding.">Linker histones stabilize the intrinsic salt-dependent folding of nucleosomal arrays: mechanistic ramifications for higher-order chromatin folding.</a> Biochemistry. 37 (42), 14776-14787 (1998).</li><li>Huynh, V. A. T., Robinson, P. J. J., Rhodes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+In+Vitro+Reconstitution+of+a+Defined+&amp;#34;30+nm&amp;#34;+Chromatin+Fibre+Containing+Stoichiometric+Amounts+of+the+Linker+Histone.">A Method for the In Vitro Reconstitution of a Defined &amp;#34;30 nm&amp;#34; Chromatin Fibre Containing Stoichiometric Amounts of the Linker Histone.</a> Journal of Molecular Biology. 345 (5), 957-968 (2005).</li><li>Dorigo, B., Schalch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+fiber+folding:+requirement+for+the+histone+H4+N-terminal+tail.">Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail.</a> J. Mol. Biol. 2836 (03), 85-96 (2003).</li><li>Qian, R. L., Liu, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+chromatin+folding+patterns+in+chicken+erythrocytes+by+atomic+force+microscopy+(AFM.">Visualization of chromatin folding patterns in chicken erythrocytes by atomic force microscopy (AFM.</a> Cell Research. 7 (2), 143-150 (1997).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Modell nukleosomalen Arrays sind ein sehr nützliches Werkzeug für die in vitro Untersuchung von Chromatin-Struktur und Funktion. Beispielsweise haben sie häufig verwendet, um den Mechanismus der Chromatinfaser Kondensation in Lösung 30-34 untersuchen, und machte es möglich, eine Röntgenstruktur eines tetranucleosome 35 erhalten. Vor kurzem haben sie nützlich bei der Entschlüsselung die strukturellen Auswirkungen der spezifischen Kern Histon-Varianten, Mutanten und posttranslational...

Eukaryotischen Genomen existieren nicht als nackte DNA, sondern verdichtet und durch gebundene Proteine ​​organisiert. Diese Komplexe von DNA und Protein Chromatin. Die Grundstruktureinheit des Chromatins ist das Nukleosom. Ein Nukleosom umfasst Histonoktamer und 146 Basenpaare der DNA um die Histon-Oktamer gewickelt etwa 1,6 mal 1. Die Histonoktamer wird von jedem der Core-Histone H2A, H2B, H3, H4 und zwei Kopien zusammen. Kern Histon Octamere, die wiederholt entlang eines DNA-Moleküls angeordnet sind nukleosomalen Arrays bezeichnet. Die erweiterte Struktur nukleosomalen Arrays hat als die 10 nm-Faser oder den &quot;Perlen auf einer Schnur&quot;-Struktur bezeichnet worden ist und in vitro unter Niedrigsalzbedingungen 2 vorhanden. Die 10-nm-Faser ist in der Lage Kondensation in Strukturen höherer Ordnung durch intra-Array Verdichtung und / oder Inter-Array Oligomerisierung 2. Diese Strukturen höherer Ordnung in Gegenwart von Salzen induziert werden,oder durch die Bindung von Proteinen an Chromatin Architektur nukleosomalen Array 3,4 beeinflusst werden. Levels Verdichtung des Chromatins sind invers mit Transkriptionsrate in vivo 5,6 korreliert. Neue Forschung unterstreicht die Bedeutung der strukturellen Organisation der Genome in Prozesse wie Differenzierung, die Entwicklung von Krebs, und andere 7,8. Der Einsatz von Arrays nukleosomalen Chromatin Struktur und Funktion zu untersuchen hat sich weit verbreitet. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Montage von nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Histone und Nukleosomen Positionierung DNA. Mit Hilfe rekombinanter DNA mit Tandem-Wiederholungen von Nukleosomen-Positionierung Sequenzen ermöglicht die Wiederherstellung des Arrays, die regelmäßig angeordneten Nukleosomen enthalten. Zwei der populäreren Positionierung Sequenzen sind die 5S-rRNA-Gen-Sequenz und die &quot;601&quot;-Sequenz 9,10. Die 601-Sequenz wurde aus SELEX-Experimenten und mor abgeleitete-Positionen stark Nukleosomen als die 5S-Sequenz 11. Folglich ist die Linker-DNA Länge der Arrays 601 homogener. Tandemwiederholungen Nukleosom Positionierung DNA durch Gelfiltration 4,12 erhalten. Rekombinante Histone werden von E. gereinigt coli unter denaturierenden Bedingungen 13. Die Verwendung von rekombinanten Histone erlaubt es, sorgfältig zu steuern, die Histon-Zusammensetzung der nukleosomalen Arrays. Zum Beispiel, Kern-Histone tragen spezifische Mutationen 14 oder post-translationale Modifikationen 15,16 für Wildtyp-Core-Histone ersetzt werden. Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente überwachen die Geschwindigkeit der Sedimentation von Makromolekülen in Lösung unter einer angelegten Zentrifugalkraft 17. Dies liefert Informationen über die Größe und Form von Makromolekülen in einer Probe. Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente sind daher ein geeignetes Instrument für die Untersuchung Lösung Zustandsänderungen in ChromatinfaserStruktur aufgrund Chromatin-Kondensation 18. Wichtig ist es zunächst erforderlich, Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente als Qualitätskontrollschritt in nukleosomalen Array Rekonstitution zu verwenden. Wenn DNA und Nukleosomen sind nicht in der richtigen molaren Verhältnis kombiniert, können die Arrays unter-oder übergesättigten mit Core-Histone werden. Somit werden die Informationen aus der Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente gewonnen wird verwendet, um sicherzustellen, dass die DNA richtig mit Nukleosomen gesättigt. Es ist wichtig, alternative Methoden anzuwenden, um die Sättigung der DNA mit Nukleosomen zu schätzen, vor allem, wenn die Arbeit mit einem zuvor nicht charakterisierten DNA-Vorlage. Deshalb beschreiben wir auch ein Verfahren zur Analyse von nukleosomalen Arrays mit Rasterkraftmikroskopie (AFM). AFM ist eine leistungsfähige Technik, die ermöglicht die Visualisierung der Wirkungen einer Anzahl von Parametern, wie der Pegel der Sättigung Wirkung der Anwesenheit von Histon-Varianten oder die Auswirkungen von MgCl 2 19,20. AFM hat auch Anwendungened, um Nukleosomen Dynamik Studie mit Zeitraffer-Imaging-21. In vitro zusammen nukleosomalen 12-mer-Arrays sind besonders geeignet, um AFM-Untersuchungen, weil sie in der richtigen Größenbereich für AFM 22 gehören. In der vorliegenden Studie haben wir von AFM nukleosomalen Arrays als Qualitätskontrolle als auch als Mittel zur Bekräftigung die Daten von AUC (&quot;Sehen ist Glauben&quot;) eingesetzt. Neben einfachen Visualisierung ermöglicht AFM-Messung der Höhenprofile von Proben als eine zusätzliche Metrik.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>A3648-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>21-152-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiLoad Superdex 200 16/60 Column</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-1069-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>VS2031</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>08-667A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfine</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-0476-01 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XL-A/I Analytical Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning dna

Kern Histon Octamere, die wiederholt entlang eines DNA-Moleküls angeordnet sind nukleosomalen Arrays bezeichnet. Nukleosomalen Arrays werden in einem von zwei Wegen erreicht: Reinigung von in vivo-Quellen oder in vitro Rekonstitution von rekombinantem Core-Histone und tandemartig wiederholten DNA Nukleosom Positionierung. Das letztere Verfahren hat den Vorteil, dass für die Montage von einer in der Zusammensetzung einheitlich und genau positioniert nukleosomalen Array. Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente in der analytischen Ultrazentrifuge Ausbeute Informationen über die Größe und Form von Makromolekülen durch die Analyse der Geschwindigkeit, mit der sie durch Lösung unter Zentrifugalkraft migrieren. Diese Technik, die zusammen mit der Rasterkraftmikroskopie kann zur Qualitätskontrolle verwendet werden, so dass der Großteil der DNA-Templates werden mit Nukleosomen nach Rekonstitution gesättigt. Hier beschreiben wir die erforderlichen Milligramm-Mengen der Länge und der Zusammensetzung zu rekonstituieren d Protokolleefined nukleosomalen Arrays für biochemische und biophysikalische Untersuchungen der Chromatin-Struktur und Funktion.

Um das Protokoll zu veranschaulichen wir rekonstituiert nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Xenopus Histone und DNA, die aus 12 207 bp Tandem-Wiederholungen der Folge 601 Positionierung (601 207 x 12). Wir haben zuerst zusammengebaut nativen Octamere aus lyophilisierten Histone und reinigte die Octamere durch FPLC mit einem S200-Säule (Abbildung 1A) dann. Größere Komplexe eluieren früher aus der Säule S200. Histone eluieren in der Regel in dieser Reihenfolge: nicht-spezifisch...

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Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Es wird ein Verfahren für die Wiederherstellung von Modell nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Histone und hintereinander wiederholt Nukleosomen-Positionierung DNA vorgestellt. Wir beschreiben auch, wie Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente in der analytischen Ultrazentrifuge, und Rasterkraftmikroskopie (AFM) werden verwendet, um das Ausmaß der nukleosomalen Array Sättigung nach Rekonstitution zu überwachen.

Versammlung der nukleosomalen Arrays von rekombinantem Core-Histone und DNA Nucleosome Positioning

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

assembly-nucleosomal-arrays-from-recombinant-core-histones-nucleosome

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22.4K Aufrufe.  Colorado State University.  Es wird ein Verfahren für die Wiederherstellung von Modell nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Histone und hintereinander wiederholt Nukleosomen-Positionierung DNA vorgestellt. Wir beschreiben auch, wie Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente in der analytischen Ultrazentrifuge, und Rasterkraftmikroskopie (AFM) werden verwendet, um das Ausmaß der nukleosomalen Array Sättigung nach Rekonstitution zu überwachen. 

Serie: Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Forschung

Biologie

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically functional inside the cell, nucleic acid-based therapeutics require an efficient intracellular delivery system. One widely adopted approach is to complex DNA with a gene carrier to form nanocomplexes via electrostatic self-assembly, facilitating cellular uptake of DNA while protecting it against degradation. The challenge lies in the rational design of efficient gene carriers, since premature dissociation or overly stable binding would be detrimental to the cellular uptake and therapeutic efficacy. Nanocomplexes synthesized by bulk mixing showed a diverse range of intracellular unpacking and trafficking behavior, which was attributed to the heterogeneity in size and stability of nanocomplexes. Such heterogeneity hinders the accurate assessment of the self-assembly kinetics and adds to the difficulty in correlating their physical properties to transfection efficiencies or bioactivities. We present a novel convergence of nanophotonics (i.e. QD-FRET) and microfluidics to characterize the real-time kinetics of the nanocomplex self-assembly under laminar flow. QD-FRET provides a highly sensitive indication of the onset of molecular interactions and quantitative measure throughout the synthesis process, whereas microfluidics offers a well-controlled microenvironment to spatially analyze the process with high temporal resolution (~milliseconds). For the model system of polymeric nanocomplexes, two distinct stages in the self-assembly process were captured by this analytic platform. The kinetic aspect of the self-assembly process obtained at the microscale would be particularly valuable for microreactor-based reactions which are relevant to many micro- and nano-scale applications. Further, nanocomplexes may be customized through proper design of microfludic devices, and the resulting QD-FRET polymeric DNA nanocomplexes could be readily applied for establishing structure-function relationships. 

We present a novel and powerful integration of nanophotonics (QD-FRET) and microfluidics to investigate the formation of polyelectrolyte polyplexes, which is expected to provide better control and synthesis of uniform and customizable polyplexes for future nucleic acid-based therapeutics.

Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Montage-, Lade-und Alignment einer analytischen Ultrazentrifuge Messkammerdirektanschluss

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Design und die Verwendung Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Reduzierte Gravitationsbereich Hardware Demonstrationen eines Prototyps Miniaturisierte Durchflusszytometer und Companion Microfluidic Mischtechnik

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...