Finanzielle Unterstützung durch die NIH HL89764, NSF Zuschüsse 0546012, 0730503 und 0725528 zur Verfügung gestellt.

A. Biotinylierung von DNA Plasmid-DNA wurden kovalent mit Guanin-spezifischen Biotin-Markierungen, wie vom Hersteller (Mirus Bio, Madison, WI) beschrieben, aber skaliert auf ~ 1-2 Biotin Etiketten pro DNA haben biotinyliert. Plasmid-DNA (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) wurde in diesem Protokoll bezeichnet. <ol><li> Lösen Sie gewünschte Menge pDNA in TE-Puffer von DNase-frei und RNase-frei (Molekularbiologie-Qualität) Wasser zu einem 1μg/μL DNA-Lösung zu machen. </li><li> Conduct der Kennzeichnung Reaktion unter Verwendung des folgenden Reaktionsmischungen. Fügen Sie die Label IT dauern. </li></ol> Für 100 &amp;mgr; g DNA Reaktion: <table border="1"><tbody><tr><td> DNase-frei und RNase-freies Wasser </td><td> 75 &amp;mgr; l </td></tr><tr><td> 10X Labeling Puffer A </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> 1μg/μL DNA </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Label IT </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 200 ul </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Purify der markierten Probe mit Ethanol oder Isopropanol-Fällung nach Standardprotokollen. </li></ol> Hinweis: Die Gelfiltration auf Spalten zu hohen UV-Absorption oder Fluoreszenz-Hintergrund, die die DNA-Quantifizierung oder Fluoreszenz Charakterisierung beeinträchtigen können. Hinweis: Die Höhe der Biotinylierung kann HABA-Tests ermittelt werden. B. Kennzeichnung der Cy5-kationisches Polymer Chitosan (390 kDa, 83,5% deacetylierte, Vanson, Redmond, WA) wurde als Modell kationischen Polymer in dieser Studie verwendet. Die freie primäre Amine auf das Chitosan Polymerrückgrat wurden mit Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) gekennzeichnet. <ol><li> Zur Erleichterung der vollständigen Konjugation von Cy5-Farbstoff, berechnen die erforderliche Menge von Cy5-NHS, dass das molare Verhältnis von Cy5: 200: primäre Amine 1 ist. </li><li> Der pH-Wert der Chitosan-Lösung (in 25 mM Acetatpuffer) bis ~ 6,5 durch Zugabe von NaOH. Beachten Sie, dass der NHS Reaktion effizienter ist bei basischen pH-Wert, aber die Löslichkeit von Chitosan hier Grenzen der Arbeits-pH-Bereich. </li><li> Unter Rühren langsam das berechnete Menge an Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO), um die Chitosan-Lösung in einem Drop-by-drop Weise. </li><li> Man schüttelt die Mischung im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Zur Reinigung mit 10k MWCO Slide-a-Lyzer (Pierce) für 2 h dialysiert gegen 1% Acetatpuffer bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Ersetzen Puffer und dialysieren weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Ersetzen Puffer und dialysieren über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Shop gereinigtes markiertes Polymer bei -20 ° C. </li></ol> Hinweis: In dieser Studie wurde ein Standard-Kurve wird durch die Messung der Emissionsintensität Cy5-NHS-Ester bei 670 nm hergestellt. Charakterisieren Sie die Kennzeichnung Dichte durch Messung der erhaltenen Emission bei 670 nm aus Cy5-markierte Chitosan in der Standardkurve. Die Absorption kann auch verwendet werden, um die Kennzeichnung Effizienz zu bestimmen, wurde aber hier nicht durchgeführt. C. Herstellung von QD-markierte DNA-und Cy5-Polymer Das Molverhältnis von pDNA zu QD wurde im Überschuß gehalten (pDNA: QD ≈ 1: 2) zum vollständigen Konjugation von QDs zu pDNA zu gewährleisten. Die Zahl der QDs auf jeden pDNA gekennzeichnet durch TEM-Aufnahmen oder andere gleichwertige Einrichtungen geschätzt werden. In unserer Studie ist die Zahl der QDs pro pDNA schätzungsweise ~ 1-3 von TEM und Einzelmolekül-Spektroskopie. 1 Verwenden Millipore Milli-Q Gradient Wasser (&gt; 18,0 MW, 0.2um gefiltert) während der Vorbereitung. <ol><li> Berechnen Sie die erforderliche Menge von Chitosan für 10 ug pDNA nach gewünschten N / P-Verhältnis, das theoretische Verhältnis von protonierten Aminen in der Chitosan-Lösung, um die negativen Phosphate in die DNA-Lösung. </li><li> Add Streptavidin-funktionalisierten 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) in den biotinylierten pDNA Lösung. </li><li> Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 15 min. </li><li> Fügen Sie die QD-markierte DNA in 50 mM Natrium-Sulfat-Lösung auf das Endvolumen 200 ul zu machen. </li><li> Verdünnen Cy5-Chitosan, je nach gewünschter N / P-Verhältnis, mit Milli-Q-Wasser auf das Endvolumen 200 ul zu machen. </li></ol> Hinweis: Halten Sie die Reaktion im Dunkeln, um mögliche Ausbleichen zu verhindern. Wichtig: Seien Sie vorsichtig, um die Qdot 605 ITK ™ Streptavidin-Konjugat (die ITK-Serie), wie Quantenpunkte in diesem Katalog für die Zwecke der FRET ausgelegt sind. Die regelmäßige Qdot Serie konjugiert sind mit einer PEG-Schicht, um die unspezifische Bindung zu verhindern, vor allem für die zelluläre Markierung. Allerdings vergrößert sich diese zusätzliche Beschichtung der Donor-Akzeptor-Abstand, was zu reduced Energieübertragungseffizienz. D. Herstellung der SU-8 Masters Verwendung von Standard-Photolithographie <ol><li> Si-Wafer ist Piranha gereinigt und gebacken bei 200 ° C für 5 min. </li><li> Für die ausgewiesenen Meister Dicke von 25 um, Spin Mantel der negativen Photoresist (SU-8 2025 Microchem, Newton, MA) auf Si-Wafer bei 2000 rpm für 30 sek. </li><li> Softbake der Wafer auf einer Heizplatte mit einer Rampe von 65 ° C / h bis 95 ° C. </li><li> Expose mit UV-Licht (365nm) für 250mJ/cm 2 durch eine Maske Film (CAD / Art Services, Bandon, OR) mit dem Design von Mikrokanälen. </li><li> Post-Exposure Bake der Wafer auf einer Heizplatte mit einer Rampe von 65 ° C / h bis 95 ° C. </li><li> Entwickeln Sie die Wafer mit SU-8 Fotolack-Entwickler. </li><li> Die strukturierten Wafer ist hart auf einer Heizplatte mit einer Rampe von 65 ° C gebacken / h bis 200 ° C. Pflegen Sie die Wafer bei 200 ° C für mindestens 5 Stunden, dann allmählich kühler der Wafer auf Raumtemperatur. </li></ol> Wichtig: Schrittweise Rampe während des SU-8 Master Backprozess ist notwendig, da sonst die SU-8-Struktur kann aus dem Silizium-Wafer oder Risse an löste die SU-8-Struktur kann durch Stress-release induziert werden. E. Replica Molding von PDMS von den Meistern und Bonding, um das Deckglas <ol><li> Die SU-8-Master ist in eine Abwägung Boot gelegt. </li><li> Mix Silikon-Elastomer und Härter (Poly (dimethylsiloxan), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) in einem 10: 1-Verhältnis. </li><li> Gießen Sie die PDMS-Mischung auf die SU-8-Master und lassen Sie das Gewicht von Boot in einem Vakuum-Exsikkator, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Cure die PDMS bei 65 ° C für 1-2 Stunden. </li><li> Schälen Sie die PDMS Streifen aus dem Si Master-Form. </li><li> Punch-Kanal Ein-und Auslässe der fluidischen Gerät. </li><li> Reinigen Sie die PDMS-Streifen und Deckglas mit Ethanol und anschließend an der Luft trocknen. </li><li> Behandeln Sie den gereinigten PDMS-Streifen und Deckglas mit Sauerstoff-Plasma (20W für 1min). </li><li> Unmittelbar Bindung der PDMS-Streifen mit Deckglas. </li><li> Lassen Sie die verklebten Mikrofluidik-Chip in den Ofen bei 95 ° C über Nacht. </li></ol> Wichtig: Plasma-Behandlung und Übernachtung Backen sind unerlässlich, um verbesserte Haftfestigkeit. F. Überwachung der Bildung von DNA Nanokomplexen In der Mikrofluidikvorrichtung <ol><li> Füllen Sie den mikrofluidischen Kanal mit Wasser (um sicherzustellen, gibt es keine Blasen innerhalb der mikrofluidischen Kanal), vor dem Laden der Reagenzien reibungslosen Ablauf während des Experiments zu gewährleisten. </li><li> Laden Sie die QD-markierte DNA-und Cy5-markierte Chitosan-Lösungen in zwei einzelnen Glasspritzen, durch den Schlauch in das Video beschrieben. </li><li> Schließen Sie den Schlauch mit den beiden Eingängen der mikrofluidischen Bauteilen. Seien Sie vorsichtig, nicht, um die Luft während des Prozesses vorstellen. Stellen Sie den Durchfluss bei 20nL/min (PHD-2000 Spritzenpumpe Holliston, MA), unter Laminar-Flow-Bedingungen. </li><li> Überprüfen Sie die Mikrokanäle unter dem Mikroskop. </li><li> Wenn die Strömung stabil (~ 15 bis 20 Minuten), FRET QD-vermittelte sollte in der Mitte des Kanals beobachtet werden. </li><li> Nehmen Fluoreszenz Bilder (gekühlte CCD, Qimaging, BC, Canada) an verschiedenen Orten entlang des Kanals. </li><li> Analysieren Sie die Fluoreszenzbilder mit ImageJ und OriginLab. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. QD-FRET bietet ein empfindlicher Indikator für das Auftreten von DNA Nanokomplexen self-assembly <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Quantum dot-vermittelte Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (QD-FRET) kann ein quantitativer und hochempfindlicher Angabe Polyplex Stabilität in entweder extra-oder intrazellulären Umgebungen zu schaffen, der für eine eindeutige Erkennung des Beginns der Wechselwirkungen zwischen DNA und das Gen Träger. Die FRET-Paar, 605QD und Cy5, wurde basierend auf der Maximierung spektrale Überlappung zwischen den Donor-und Akzeptor und zur Minimierung potentieller cross-talk gewählt. Für dieses Paar ist der Förster Distanz 69.4Å. 3 </li><li> Self-Assembly der QD-FRET DNA Nanokomplexen. Anionische Plasmid-DNA (pDNA) und dem kationischen Gen Träger wurden mit QD (Energie-Donor) und Cy5 (Energie-Akzeptor) markiert jeweils. QD-FRET Nanokomplexen wurden durch elektrostatische Komplexkoazervation gebildet. Nach Anregung bei 488 nm, angegeben QD-FRET-vermittelte Cy5-Emission Bildung einer kompakten und intakte nanocomplex. Die Verweilzeit (t R) kann je nach der Entfernung (x), welche, von wo aus die beiden Ströme, um die Position der Reaktion untersucht, und die mittlere Strömungsgeschwindigkeit (v) treffen Maßnahmen berechnet werden. Aufgrund der Beschaffenheit der laminaren Strömung, Vermischung erfolgt nur an der Schnittstelle (Mitte jedes Bild), die eine genaue Berechnung der Stofftransport in Abhängigkeit von t R. Zeitliche Auflösung kann durch Variation der applie eingestellt werdend Flussraten. (Inset) FRET-vermittelten Signaltransduktion wurde sofort an der Schnittstelle, wenn die beiden Ströme trafen beobachtet, was darauf hinweist, dass die Bindung war schnell, innerhalb von wenigen Millisekunden nach dem angewandten Flussraten. Maßstab: 100 um. </li></ol>

<ol>
	<li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET.">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li><li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET.">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li><li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor.">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<ul><li> Die Bedeutung unserer Arbeit: <ol><li> Dies ist der erste Versuch, polymeren DNA nanocomplex self-assembly-Kinetik in Echtzeit (Millisekunden-Auflösung) durch QD-FRET Antworten Monitor in einem einfachen Mikrofluidik-Chip. </li><li> QD-vermittelte FRET bietet eine hoch empfindliche und quantitative Angabe der Beginn der molekularen Wechselwirkungen und in der self-assembly-Prozess, während Mikrofluidik bietet eine gut kontrollierte Mikroumgebung räumlichen Analyse der Prozess während der DNA-Synthese nanocomplex. </li><li> Die Integration von Mikrofluidik und Nanophotonik schlägt einen neuen und interessanten Ansatz, um jede Art von Komplexierung Reaktionen zu untersuchen. </li><li> Die daraus resultierende QD-FRET polymeren DNA Nanokomplexen konnte leicht für die Errichtung Struktur-Funktions-Beziehungen angewendet werden. 1,2 </li></ol></li></ul>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SU-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroChem</td>
<td>SU-8 2025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDMS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasmid DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clontech</td>
<td>pEGFP-C1</td>
<td>4.9 kb, MW = 3.3 x 106</td>
</tr>
<tr>
<td>LabelIT Biotin Labeling Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mirus Bio LLC</td>
<td>MIR 3400</td>
<td>Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work.</td>
</tr>
<tr>
<td>Streptavidin 605QD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Qdot&reg; 605 ITK&trade; Streptavidin Conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5-NHS Ester</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham Biosciences</td>
<td>PA15101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chitosan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vanson</td>
<td>390 kDa </td>
<td>83.5% deacetylated</td>
</tr>
<tr>
<td>Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545C</td>
<td>No. 1; Size: 40 x 22mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Gastight Glass Syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>TLL series</td>
<td>50&mu;L to 500&mu;L depending on sample volume</td>
</tr>
<tr>
<td>Tygon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SmallParts</td>
<td>0.02 ID, 100ft</td>
<td>Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft</td>
</tr>
<tr>
<td>Connector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SmallParts</td>
<td>HTX-23R</td>
<td>Customized in length of 0.750"</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qimaging</td>
<td>Intensified Retiga Cooled</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>BX-51</td>
<td>100W mercury arc lamp</td>
</tr>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>v1.36b</td>
<td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td>
</tr>
<tr>
<td>Origin Pro8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OriginLab</td>
<td>Student Version</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>475AF40</td>
<td>Excitation filter in both channels</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>595AF60</td>
<td>Emission filter in 605QD channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>670DF40</td>
<td>Emission filter in QD-FRET channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>500 DRLP</td>
<td>Long pass dichroic in 605QD channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope Filter sets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega Optical</td>
<td>595DRLP</td>
<td>Long pass dichroic in QD-FRET channel</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combining qd-fret and microfluidics to monitor dna nanocomplex self-assembly in real-time

Advances in Genomik weiterhin die Entwicklung von Therapeutika, die Pathogenese auf zellulärer und molekularer Ebene Ziel-Kraftstoff. In der Regel funktionale innerhalb der Zelle, benötigen Nukleinsäure-basierten Therapeutika eine effiziente intrazelluläre Delivery-System. Ein weit verbreiteter Ansatz besteht darin, komplexe DNA mit einem Gen Träger Nanokomplexen über elektrostatische Selbstorganisation bilden, erleichtert die zelluläre Aufnahme von DNA und schützt es vor dem Abbau. Die Herausforderung liegt darin das rationale Design von effizienten Gen-Trägern, da vorzeitige Dissoziation oder übermäßig stabile Bindung würde sich nachteilig auf die zelluläre Aufnahme und therapeutische Wirksamkeit. Nanokomplexen durch Masse mischen synthetisiert zeigte ein breites Spektrum von intrazellulären Auspacken und Menschenhandel Verhalten, das der Heterogenität in Größe und Stabilität der Nanokomplexen zugeschrieben wurde. Solche Heterogenität erschwert die genaue Beurteilung der self-assembly Kinetik und fügt zu der Schwierigkeit bei der Korrelation von ihren physikalischen Eigenschaften Transfektionseffizienz oder Bioaktivitäten. Wir präsentieren ein neuartiges Konvergenz der Nanophotonik (dh QD-FRET) und Mikrofluidik, um die Echtzeit-Kinetik der nanocomplex self-assembly unter Laminar Flow zu charakterisieren. QD-FRET bietet einen hochempfindlichen Hinweis auf das Auftreten von molekularen Wechselwirkungen und quantitative Messung während der Synthese, während Mikrofluidik bietet eine gut kontrollierte Mikroumgebung räumlich analysieren den Prozess mit hoher zeitlicher Auflösung (~ Millisekunden). Für das Modellsystem der polymeren Nanokomplexen, wurden zwei unterschiedliche Phasen in den Self-Assembly-Prozess durch diese analytische Plattform erfasst. Die kinetische Aspekt der Selbstorganisation auf der Mikroebene erhalten würden als besonders wertvoll für Mikroreaktor-basierte Reaktionen, die für viele Mikro-und Nano-Anwendungen sind. Ferner kann Nanokomplexen durch richtige Gestaltung der microfludic Geräte angepasst werden, und die daraus resultierenden QD-FRET polymeren DNA Nanokomplexen leicht könnte für die Errichtung Struktur-Funktions-Beziehungen angewendet werden.

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Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Wir präsentieren ein neuartiges und leistungsfähige Integration der Nanophotonik (QD-FRET) und Mikrofluidik, um die Bildung von Polyelektrolyt Polyplexe, die voraussichtlich zu einer besseren Kontrolle und die Synthese von einheitlichen und anpassbare Polyplexe für zukünftige Nukleinsäure-basierten Therapeutika bieten ist zu untersuchen.

Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

combining-qd-fret-microfluidics-to-monitor-dna-nanocomplex-self

Research

JoVE Journal

Biology

11.0K Aufrufe.  Johns Hopkins University. Wir präsentieren ein neuartiges und leistungsfähige Integration der Nanophotonik (QD-FRET) und Mikrofluidik, um die Bildung von Polyelektrolyt Polyplexe, die voraussichtlich zu einer besseren Kontrolle und die Synthese von einheitlichen und anpassbare Polyplexe für zukünftige Nukleinsäure-basierten Therapeutika bieten ist zu untersuchen.

Serie: Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

Chemotaktische Reaktion der marinen Mikroorganismen zu Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Forschung

Biologie

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Studium der bakteriellen Chemotaxis Mit Mikrofluidik - Interview

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

Anwenden von Mikrofluidik zur Elektrophysiologie

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Erkennung und Charakterisierung der Protein-Selbstmontage in Vivo durch Durchflusszytometrie

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. Upon wounding of a leaf, an increase in cytosolic calcium ion concentration (Ca2+ signal) occurs at the wound site. This signal is rapidly transmitted to undamaged leaves, where defense responses are activated. Our recent research revealed that glutamate leaking from the wounded cells of the leaf into the apoplast around them serves as a wound signal. This glutamate activates glutamate receptor-like Ca2+ permeable channels, which then leads to long-distance Ca2+ signal propagation throughout the plant. The spatial and temporal characteristics of these events can be captured with real-time imaging of living plants expressing genetically encoded fluorescent biosensors. Here we introduce a plant-wide, real-time imaging method to monitor the dynamics of both the Ca2+ signals and changes in apoplastic glutamate that occur in response to wounding. This approach uses a wide-field fluorescence microscope and transgenic Arabidopsis plants expressing Green Fluorescent Protein (GFP)-based Ca2+ and glutamate biosensors. In addition, we present methodology to easily elicit wound-induced, glutamate-triggered rapid and long-distance Ca2+ signal propagation. This protocol can also be applied to studies on other plant stresses to help investigate how plant systemic signaling might be involved in their signaling and response networks.

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Extracellular glutamate-triggered systemic calcium signaling is critical for the induction of plant defense responses to mechanical wounding and herbivore attack in plants. This article describes a method to visualize the spatial and temporal dynamics of both these factors using Arabidopsis thaliana plants expressing calcium- and glutamate-sensitive fluorescent biosensors.

Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...