Wir sind dankbar, dass die Gespräche, Beratung und Unterstützung von Drs. Michael Andreeff MD, PhD., Und Jared Burks PhD. aus dem MD Anderson Durchflusszytometrie und Cellular Imaging Core Facility. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem National Cancer Institute (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 CA109451 und für FCM unterstützt. ELS wird auch von der Armee Department of Defense (BC083397) unterstützt.

Syngene Murine Knochenmarktransplantation (KMT), wie von institutionellen IACUC Protokolle zugelassen (Hinweis: Der Erfolg dieses Protokoll erfordert den Einsatz aller markierten Zelltyp (en) als Ziel für die multispektrale Analyse und die nachgelagerten Analyse zu erleichtern, kann man die genetische nutzen oder stabilen Zellmarkierung. Wir schlagen vor, dass jede Zelle, Gewebe, Organ-oder-zu-sein kann zu einem Transplantationsmodell und die Transplantation kann so viele einzigartige markierten Populationen wie der Forschung für nützlich erachtet enthalten angewendet werden. Zusätzlich Multi-markierten Zellsystemen , wie sie in transgenen Mäusen gefunden, die Multiple Lineage eingeschränktem fluoreszenzmarkierten-Populationen können zur Transplantation Komplikationen für die Untersuchung von bestimmten pathologischen Zuständen zu beseitigen. <ol><li> Lethally bestrahlen BMT Empfängermäuse mit einer Einzeldosis von 9,5 Gy vier Stunden vor dem Auflösen mit Spender-Knochenmark. (BMT GFP Empfänger sollten 6-10 Wochen alt sein). </li><li> Befeuchten Sie die Maus Fell mit 70% Ethanol vor Clipping-und Schäl es zurück in die Hinterbeine mit sterilen OP-Schere aus. Entfernen Sie das gesamte Bein einschließlich der Beckenkamm am Iliosakralgelenk. Entsorgen Sie den Fuß durch Schneiden knapp über dem Knöchel und dann gründlich alle Muskeln, Bänder und überschüssiges Gewebe aus dem Knochen entfernen. Flush Mark aus der Tibia, fibia und Beckenkamm mit einer 23 G-Nadel mit 2% sterile FBS in PBS (PBS-2). (BMT RFP Geber sollten nach institutionellen Standards geopfert werden.) </li><li> Scheibe und sanft zu vernichten verbleibenden Knochens in Fragmente mit einem Skalpell und einer Pinzette und dann in 50 ml konischen Röhrchen stellen mit 3 ug / ml Collagenase I für 1 h bei 37 ° C bei 300 UpM. </li><li> Krönen Sie das Rohr mit PBS-2 und sammeln Stand in ein frisches Röhrchen und verbinden sich mit Zellen gespült. Spin down bei 250 Upm für 5 min bei 4 ° C </li><li> Die Zellen in PBS-2 und 40 nm Filter, durch Zellfilter. An diesem Punkt können die Zellen markiert werden FLUORESCENt-aktivierte Zellsortierung (FACS), wenn man spezifische Populationen für die BMT manipulieren möchte. </li><li> Resuspendieren 2 x 10 6 Zellen pro 100 &amp;mgr; l PBS pro Maus. Verwenden Sie 29 G-Nadel systemisch in bestrahlte Empfängermäuse zu injizieren GFP durch Schwanz oder retro-orbitalen Venen-Fase-side-up. Spritzen Sie eine Maus mit 100 ul PBS nur als engraftment Kontrolle. Verwenden Sie eine Wärmelampe auf Schiffe vor der Injektion zu weiten und mit einem Schwanzveneninjektion Zurückhaltung bei der Injektion. Haben steriler Gaze Verfügung leichten Druck auf den Schwanz nach Injektion. </li><li> Drei Wochen nach der BMT, sammeln Blut retro-orbital und durch Strömungs Zytometrie analysieren, um das Vorhandensein von GFP zirkulierenden Zellen und das Fehlen von RFP zirkulierenden Zellen bestätigen. Die Steuerung mit der Maus an dieser Stelle gestorben. </li></ol> 2. Tumor Engraftment Nach Institutional IACUC Richtlinien <ol><li> Wachsen ID8 Eierstock murine Tumorzellen in vitro vor der in vivo-Injektion (1 x 10 6 cEllen pro Maus). Tag der Injektion, trypsinize Zellen, Waschen mit PBS und Resuspendieren in PBS mit 1 × 10 6 Zellen pro 100 &amp;mgr; l. </li><li> Inject Tumorzellen in intaperitoneal Hohlraum der Maus, sollte Nadelkegel-side-up sein. Sterilisieren Injektion Anblick mit 70% Ethanol. Spritzen Sie in der unteren linken oder rechten unteren Quadranten des Bauches (Schädel und der unteren Reihe von Bauch Brustwarzen der weiblichen Maus etwas medial), vermeiden, dass die Organe. Rain Maus durch Greifen durch das Genick und Halten der Schwanz mit dem kleinen Finger oder Ringfinger. Mäuse mit Isofluran anästhesiert für dieses Verfahren ist. </li><li> Opfere die Mäuse, wenn Anzeichen von Tumor Transplantation, wie leichte Blähungen, sind offensichtlich. Dies wird auftreten, über 4-12 Wochen. </li><li> Verbrauch Tumoren von IP Höhle. Tumoren innerhalb des Hohlraums wie weiße Knötchen auf und um die Oberfläche der Organe aussehen. Mit einem Skalpell, entfernen Sie die Tumoren und legen in einem Rohr / Glas 10% Formalin für 24 h Fixierung. Die histologische pWiedergutmachung kann die Pathologie / Histologie Kern ausgelagert werden, wenn Reagenzien und Materialien sind nicht für Paraffineinbettung und Rutsche Vorbereitung zur Verfügung stehen. Gewebe in Abschnitt 8.5 um Scheiben auf Glasobjektträger für nachfolgende Färbeverfahren. </li></ol> 3. Multiparameter-Immunfluoreszenzfärbung <ol><li> Bereiten Einzelfarbsteuerung Folien für jeden Fluoreszenzsonde im Experiment eingesetzt. In diesem Szenario werden vier Farben verwendet. Daher vier Objektträger für jede einzelne Farbe als auch eine Folie für die Hintergrundgeräusche Kontrolle und schließlich eine Folie für die volle Kombination Färbung. (Total Dias = 6) Alle Folien nebeneinander verarbeitet werden, in identischer Weise auf experimentelle Variation zu minimieren. </li><li> Backen Paraffinschnitte bei 56 ° C für 1 Stunde. </li><li> Waschen Folien 3x 10 min in Xylol. </li><li> 100% Ethanol waschen 2x 5 min. </li><li> Waschen 1x 3 min 95% Ethanol </li><li> Waschen Sie 1x 2 min90% Ethanol. </li><li> Waschen Sie 1x 2 min70% Ethanol. </li><li&gt; Wash 1x 2 min in Wasser. Langsam tauchen die Färbung Zahnstange in und aus dem Wasser 10x. </li><li> Während des letzten Wasch Serie, Pre-Kochen Natriumcitrat-Puffer für 2 min (Mikrowelle auf hoch). (Kann mit dem Tris-EDTA-Puffer je nach den verwendeten Antikörpern ersetzen) </li><li> Kochen Sie die Objektträger für 20 min in Natriumcitrat-Puffer (Mikrowelle auf 10% der Leistung oder im Schnellkochtopf). Wenn der Puffer kocht, schalten Mikrowelle und lassen Sie sich. </li><li> Von der Wärmequelle entfernen und lassen Sie die Objektträger für 30 Minuten ruhen in der Natrium-Citrat-Puffer abkühlen. </li><li> Spülen Sie die Folien in Wasser für 5 min. </li><li> Mark um Tumorschnitte mit Pap-Pen und legte 2% BSA / 1% FBS Maleinsäure Blocking-Puffer für 1 Stunde. Bereiten Sie die Folien einzeln als sie nicht austrocknen bei diesem Schritt lassen. </li><li> Bereiten primären Antikörpern bei optimale Verdünnung in Blockierungspuffer. (Wenn die Antikörper in Gebrauch sind verschiedene Arten (oder IgG-Kette Variation ex: IgG1 IgG2a vs der gleichen Spezies) können sie in Kombination verwendet werden, wie iningle Inkubationszeit. Wenn Antikörper-Spezies überschneiden, dann Inkubationen müssen nacheinander durchgeführt, um Antikörper-Kreuzreaktion zu minimieren.) </li><li> An dieser Stelle verlassen zwei Folien mit Sperr nur Puffer. Diese beiden Folien werden als ungefärbte Kontrolle und Kernfärbung Kontrolle dienen. Die anderen Einzelfarbsteuerung mit einzelnen primären Antikörpern inkubiert werden. Nur die Analyseschlitten wird eine Kombination von primären Antikörpern. </li><li> Folien mit primären Antikörper inkubieren in einer Feuchtekammer-Box auf langsam rotierenden Schüttler bei 4 ° C über Nacht (~ 16-20 h) (Hinweis: bei der Arbeit mit 4 + Fluorophore, sequentielle Färbung oder direkte Konjugation kann notwendig sein, Antikörper-Kreuzreaktion zu minimieren . Unter diesen Bedingungen zu wiederholen, bis alle Schritte 1,16-1,21 Antikörper werden auf die Folien aufgebracht.) </li><li> Waschen Sie Folien für 10 min in PBST (2x) sanft auf Schüttler </li><li> Während Wasch wird, bereiten AlexaFluor 488, 594 und 647 Sekundärantikörper für einen endgültigen Verdünnungvon 1:1000 in Blockierungspuffer. (Stellen Sie sicher, dass diese Antikörper und Verdünnungen werden bei 4 ° C und im Dunkeln zu allen Zeiten gehalten, um die Fluoreszenz über Chargen und im Laufe der Zeit zu bewahren.) </li><li> Auf den einzelnen Farbkontrollobjektträger, legen Einzel AlexaFluor Verdünnungen Anpassung der Spezies des primären Antikörpers eingesetzt. Alle Sekundärantikörper wird auf der Analyse Folie platziert werden. Die ungefärbten und die Kern gebeizt Steuerschieber mit Blocking-Puffer in diesem Schritt bleiben. </li><li> Inkubation in einer feuchten Kammer-Box (mit Aluminiumfolie abgedeckt, um Lichteinfall zu vermeiden) auf langsam rotierenden Schüttler bei RT für 2 Stunden. </li><li> Waschen Sie Folien für 5 min in PBST (2x) sanft auf Shaker. Deckel mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen. </li><li> Hinzufügen DAPI (1:10.000) 1 min an das DAPI-only Schieber und dem Analyseschlittens. Deckel mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen. Die anderen Folien können in den Waschbehälter fallen gelassen werden. </li><li> Waschen Sie die zwei DAPI-inkubiertFolien in einem separaten Behälter für die ersten 5 min waschen, um nicht mit der DAPI-Färbung verunreinigen die anderen Folien. Für den zweiten 5 min waschen, können die Folien in PBST kombiniert werden (alle Wäschen sollte auf einem Schüttler durchgeführt werden). Deckel mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen. </li><li> Kurz Dip Slides in Wasser vor cover-Rutschen (1,5 Dicke mit wässrigen Medien Montage, um die Fluoreszenz zu erhalten) </li><li> Trocknen lassen 3 Stunden in Dunkelheit bei RT. </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit Nagelhärter. (Verwenden Sie keine Nagellack als das Aceton kann das Fluoreszenzsignal zu stillen). </li><li> Analysieren Sie Folien sofort oder lagern bei 4 ° C für eine spätere Analyse. </li></ol> 4. Multispektrale Bildgebung <ol><li> Sammeln multispektrale Bilder unter Verwendung einer Nuance EX-Kamera (mit einem Flüssigkristall abstimmbaren Filter) auf einer Olympus X-63 aufrechten Mikroskop mit Nuance-Software für die Datenerfassung. </li><li> Sammeln Sie Bilder mit einem Öl-Objektiv, um die Auflösung zu erhöhen. </li><li> Initial Set-up umfasst die Einstellung der spektralen Bereich für jedes Fluorophor im Einsatz. <ol class="lalpha"><li> Für 4-Farben: <ol class="lroman"><li> DAPI: 420-480nm </li><li> AF488: 490-580nm </li><li> AF594: 590-640nm </li><li> AF647: 650-720nm </li></ol></li></ol></li><li> Nehmen ein Anfangsbild der Analyseschlittens, um die richtigen Belichtungszeiten für jeden der Spektralbereiche erhalten. </li><li> Erstellen &quot;Spektrenbibliothek&quot;, dass die Software verwenden, um zu identifizieren und trennen das Signal-zu-Rausch-Verhältnis der Fluorophore voneinander und Hintergrundsignal. (Anmerkung: 3 = 4 Fluorophore Steuerschieber; Fluorophore 5 = 6 Kontrollobjektträger: Jeder muss seine eigene Fluorochrom einfarbig Steuerschieber, um eine Spektrenbibliothek mit geeigneter Wellenlänge Kurven versammeln, um korrekte Analyse des Datensatzes Beispiel zu gewährleisten.). <ol><li> Bild zunächst den ungefärbten Rutsche. Diese Folie wird innerhalb der spektralen Bibliotheken bezeichnet werdeny als Hintergrund.&gt; </li><li> Bild der DAPI-nur Sekunden gleiten. Diese Folie wird verwendet, um die DAPI-gefärbten Zellkernen mit dem &quot;zeichnen&quot; Werkzeug zu bezeichnen und wird innerhalb der spektralen Bibliothek DAPI gespeichert werden.&gt; </li><li> Bild der AF488 nur schieben Drittel. Diese Folie wird verwendet, um die AF488-gefärbten Regionen mit dem &quot;zeichnen&quot; Werkzeug zu bezeichnen und wird innerhalb der spektralen Bibliothek als AF488 gespeichert werden.&gt; </li><li> Bild der AF594-only vierten gleiten. Diese Folie wird verwendet, um die AF594-gefärbten Regionen mit dem &quot;zeichnen&quot; Werkzeug zu bezeichnen und wird innerhalb der spektralen Bibliothek als AF594 gespeichert werden.&gt; </li><li> Bild der AF647-only fünften gleiten. Diese Folie wird verwendet, um die AF647-gefärbten Regionen mit dem &quot;zeichnen&quot; Werkzeug zu bezeichnen und wird innerhalb der spektralen Bibliothek als AF647 gespeichert werden.&gt; </li><li> Nach der Sammlung der einzelnen spektralen Komponenten,speichern Sie die Spektrenbibliothek und das Protokoll.&gt; </li></ol></li><li> Sobald die Spektrenbibliothek abgeschlossen ist, finden Bereiche von Interesse auf der Analyse Folie auf dem Mikroskop und sammeln / Bilder zu speichern.&gt; </li></ol> 5. Quantitative Analyse der multispektrale Bilder <ol><li> Importieren Sie eine repräsentative Auswahl von Bildern mit Nuance erworben InForm Software. </li><li> Öffnen Sie die gespeicherte Spektrenbibliothek durch das Programm geleitet </li><li> Identifizieren Gewebebereiche von Interesse analysiert werden. (ZB Tumorgewebe im Vergleich zu Fettgewebe). </li><li> Identifizieren einzelner Zellen auf Basis von DAPI-Fleck. Zytoplasma wird automatisch auf Grundlage der Form des Kerns bestimmt werden. </li><li> Suchen Sie sich die Fluoreszenzintensität Auslesen der Wahl für jeder Leuchtstoffparameter (z. B. Mittelwert, Standardabweichung) </li><li> Batch die aufgenommenen Bilder und lassen Sie die Software-Prozess unter Verwendung des vorgeschlagenen Algorithmus. </li><li> Wenn die Bildverarbeitung abgeschlossen ist, verschmelzendie Ergebnis-Dateien. </li><li> Öffnen Sie die Ergebnisse in Excel (oder einem anderen Analysesoftware-Paket) und zeichnen zwei Fluoreszenzintensitäten gegeneinander auf XY-Achse. Jeder Fluoreszenzintensität pro Zelle angegeben. Die Doppel-positiven Zellen wird in der oberen rechten Quadranten erscheinen. Der Benutzer muss die Grundlinie Fluoreszenzintensitäten zu definieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

FCM, CMB und ELS haben keine Konflikte und nichts zu offenbaren.

Hier beschreiben wir die Anwendung der multispektralen Bildgebung beschreiben wir, wie multispektrale MIMicc-Abfrage der Multiplex-Zellmassen, die Knochenmark Stromazellen Komponenten der Tumor-Mikroumgebung zu analysieren, aber diese Methode und Konzept kann auf die Entschlüsselung anderen zellulären Elemente, die eine komplexe Komposition angewendet werden Gewebe, wie sie bei Wundheilungsreaktionen oder während eines regenerierbaren Gewebes gesehen. In diesen Experimenten verwenden wir transgene Mäuse fluoreszenz ...

Das Verständnis der Gewebeentwicklung und Reparatur ist wichtig, um die Aufklärung beteiligten zellulären Komponenten in der Wundheilung, 2,3 regenerativen Medizin, Entwicklungsbiologie und Tumorbiologie. Unter Umständen, der Reparatur, zahlreiche Zelltypen zu infiltrieren das umgebende Mikromilieu in Vaskularisation, ECM-Ablagerung, Proliferation und Umstrukturierung des Gewebes zu unterstützen. Zellulären Faktoren und Phänotypen kann basierend auf Multi Multiplex-Marker, die die Lokalisierung identifizieren, Differenzierungsstatus und die Interaktion zwischen Zellkomponenten innerhalb des untersuchten Mikro identifiziert werden. Hier beschreiben wir die Tumorentwicklung als prototypisches Beispiel für diese multicolor-vielzelligen Transplantationsmodell gefolgt von multispektrale Bildgebung und Entmischung Methodik. Tumorprogression ist ein mehrstufiger Prozess, der von mehreren erworbenen Fähigkeiten, die verbesserte Proliferation, eine umfassen markiertntiapoptotic, invasive und angiogenen Eigenschaften. 4 Tumorentwicklung wird durch nicht-neoplastischen Zellen, die in der Umgebung eingestellt werden, um Wachstumsfaktoren, strukturellen Matrix, Gefäßnetze und Immunmodulation bereitzustellen erleichtert. 1,5,6 Diese Mikrohabitat besteht aus Zellen, abgeleitet von lokalen, benachbarten Geweben wie Fettgewebe und Blutgefäße und entfernten Quellen wie Knochenmark gewonnenen Zellen ein. Das Ausmaß der nicht-neoplastischen Zelle Aufnahme hängt von der Nachfrage aus dem Tumor, die oft mit der Bühne / Grad des Tumors entspricht. Um die Rolle der Tumormikroumgebung zu verstehen, muß man den Ursprung und das Differenzierungspotential der nicht-neoplastischen Zellpopulationen verstanden. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um bei der Interpretation der Tumorprogression durch die Visualisierung der beiden Knochenmark abgeleiteten Zellkomponenten zu unterstützen und die lokale Gewebe derivED-Zellen. Mit Hilfe fluoreszierenden Reporter-Gen-exprimierenden transgenen Mäusen transplantiert wir GFP (grün-fluoreszierenden Proteins) Knochenmark in einem letal bestrahlten RFP (rot-fluoreszierende Protein) Maus. Nach der erfolgreichen Knochenmark Transplantation wird eine syngene Tumorzelllinie orthotop injiziert und für 4-8 Wochen einprägen. Die daraus resultierende Tumor aus der Maus herausgeschnitten und für Immunfluoreszenz-(IF)-Färbung, die Stroma-Komponenten visualisieren verarbeitet. Multiplex-IF-Marker ist eine häufig verwendete Technik, die signifikante Optimierung 7-9 beinhaltet, jedoch unter Verwendung eines multispektrale Bild / Entmischung Plattform verbessert das Potential für fluoreszierende Markerkombinationen, die spektrale Überlappung aufweisen. Hier stellen wir eine Technik, die wir nennen MIMicc-Abfrage von multispek Multiplexed Zellzusammensetzungen zu färben und zu analysieren, bis zu acht Marker innerhalb eines Tumors Abschnitt auf einer einzelnen Folie, um die zelluläre Herkunft, Zelldifferenzierung st analysierenATUS und Zell-Zell-Wechselwirkungen von Komponenten innerhalb der Tumormikroumgebung. Dieses vereinfachte Beispiel hat das Potential auf, um fünf, sechs oder mehr Markern unter Verwendung von Antikörpern oder intrazelluläre Fluoreszenz Promotor getriebene Expression. Tabelle 1 zeigt potentielle Fluoreszenzantikörperfärbung Kombinationen mit geeigneten Arten berücksichtigt analysieren erweitert werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

Mit dem Wunsch, die Beiträge von mehreren Zellelemente auf die Entwicklung eines komplexen Gewebe zu verstehen, wie die zahlreichen Zelltypen, die bei der Regeneration von Gewebe, Tumorbildung oder Vaskulogenese zu beteiligen, entwickelten wir ein mehrfarbiges Zelltransplantationsmodell der Tumorentwicklung in welche Zellpopulationen stammen aus verschiedenen fluoreszierend gefärbten Reportergen-Mäusen transplantiert und, gepfropft oder in und um einen Tumor zu entwickeln injiziert. Diese farbigen Zellen werden dann rekrutiert und in den Tumor Stroma eingearbeitet. Um die quantitative Erfassung Knochenmark Tumor Stroma-Zellen transplantiert wir GFP-exprimierenden transgenen ganze Knochenmark in letal bestrahlten Mäusen RFP exprimieren wie IACUC genehmigt. 0ovarian Tumoren, die orthotop in die transplantierten Mäusen injiziert wurden, wurden 6-8 Wochen nach der Transplantation entnommen und für die Knochenmark-Marker der Herkunft (GFP) sowie Antikörper-Markierungen, um Tumor-assoziierte erkennen analysiertStroma mit multispektrale Imaging-Techniken. Wir haben dann eine Methodik angepasst nennen wir MIMicc-Multispektrale Abfrage der Multiplex-Zellmassen mit multispektralen Entmischung fluoroprobes quantitativ zu beurteilen, welche Zelle kam, von dem ausgehend Populationen (basierend auf Original-Reportergens Etiketten), und unsere Fähigkeit, entmischen 4, 5 beschriftet , 6 oder mehr Spektren pro Folie steigt, haben wir zusätzliche Immunhistochemie mit Zelllinien oder Differenzierung, um eine höhere Präzision assoziiert aufgenommen. Den Einsatz von Software zu co-lokalisiert Multiplex-Fluoreszenzsignale, Tumor-Stroma-Bevölkerung verfolgt, aufgezählt und auf der Grundlage Marker Färbung charakterisiert werden zu erkennen. 1

Mit einem multispektrale Imaging-Technik, um Tumore in unserem BMT transgenen Mausmodell eingepflanzt zu analysieren, können wir Stromatumoren Komponenten, die von Knochenmark Herkunft zu erkennen. Die Anfangs BMT wurde 3 Wochen nach der Transplantation mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 1) bestätigt. Orthotop injiziert unmarkierten Eierstock-Tumoren nach Transplantation BMT Bestätigungen wurden herausgeschnitten und Formalin fixiert 6 Wochen nach der ersten Tumorinjektion. Paraffin eingebettete...

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Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

quantitative-multispectral-analysis-following-fluorescent-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.3K Aufrufe.  MD Anderson Cancer Center.  Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln. 

Serie: Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Quantitative Visualisierung und Erkennung von Hautkrebs mit Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Forschung

Medizin

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Murine Heterotope Heart Transplant-Technik

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-Elektroden-Array Recordings of Human Epileptische Postoperative Rindengewebe

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique using the donor aorta to form the arterial anastomosis instead of the renal artery was developed and reported in 1993 by Kalina and Mottram 2 with a further advancement coming from the same laboratory in 1999 3. While one can become proficient in this model, a search of the literature reveals that many labs still experience a high proportion of graft loss due to arterial thrombosis. We describe here a technique that was devised in our laboratory that vastly reduces the arterial thrombus reported by others 4,5. This is achieved by forming a heel-and-toe cuff of the donor infra-renal aorta that facilitates a larger anastomosis and straighter blood flow into the kidney.

The goal of this manuscript is to describe the steps required to perform a kidney transplant in a mouse, paying particular attention to the details of the arterial anastomosis.

Murine Nierentransplantations Technik

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Vein Interposition Modell: ein geeignetes Modell zur Untersuchung Bypass Graft Durchgängigkeit

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine balloon denudation model, which is comparable with established vessel injury models in large animals. The aorta denudation model with balloon catheters mimics the clinical setting and leads to comparable pathobiological and physiological changes. Briefly, after performing a horizontal incision in the aorta abdominalis, a balloon catheter will be inserted into the vessel, inflated, and introduced retrogradely. Inflation of the balloon will lead to intima injury and overdistension of the vessel. After removing the catheter, the aortic incision will be closed with single stiches. The model shown in this article is reproducible, easy to perform, and can be established quickly and reliably. It is especially suitable for evaluating expensive experimental therapeutic agents, which can be applied in an economical fashion. By using different knockout-mouse strains, the impact of different genes on MH development can be assessed.

This article demonstrates a murine model to study the development of myointimal hyperplasia (MH) after aortic balloon injury.

Ballon-basierte Verletzungen induzieren Myointimal Hyperplasie in der Bauchschlagader Maus

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...