Dies sind umfassende Protokolleinrichtungen, rohe Steigerungen der Erzeugung und die Verwendung von patientenspezifischen Kulturen aus peripheren mononukleären Blutzellen. Diese Taktik ist reproduzierbar und leicht zu befolgen, besonders für Anfänger. Und benötigen Sie keine spezielle Fachkompetenz in Stammzellballaden oder Herz-Kreislauf-Medizin.
Unser Protokoll kann verwendet werden, um patientenspezifische Kardiomyozyten aus einer einzigen Blutentnahme zu generieren, die zur Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und zum Testen der Herztoxizität neuartiger Medikamente verwendet werden können. Dieses Protokoll erfordert ein langes Engagement für die Aufrechterhaltung der Stammzellreprogrammierung und die gerichtete Differenzierung. Sie schätzen Ihre Bemühungen jedoch sehr.
Wenn Sie sehen, wie Kardiomyozyten in der Schale geschlagen werden. Wenn die menschlichen iPSC-Kolonien eine Konfluenz von über 90% erreichen, spülen Sie jede Vertiefung mit drei Millilitern DPBS aus, bevor Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,5 Millimol EDTA in DPBS pro Vertiefung bei 37 Grad Celsius behandeln. Nach fünf bis acht Minuten fügen Sie jedem Bohrloch einen Milliliter iPSC-Passaging-Medium hinzu und entfernen die Zellen manuell.
Übertragen Sie 600 bis 900 Mikroliter der Zellen auf einzelne Brunnen haben eine Basalmembran beschichtete sechs Well-Platten für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Anschließend erfrischen Sie die Kulturen mit zwei Millilitern komplettem E8-Medium täglich für drei bis vier Tage. Wenn die Kultur die Konfluenz erreicht hat, ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium, zwei pro Vertiefung.
Ersetzen Sie am zweiten Tag die Überstände durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium eins. Ersetzen Sie am dritten Tag die Überstände durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium drei. Am fünften Tag.
Ersetzen Sie den Überstand durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium eins. Ersetzen Sie am siebten bis 10. Tag den Überstand durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium vier. An den Tagen 11 und 13.
Wenn kontrahierende Zellen beobachtet werden, ersetzen Sie den Überstand durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium fünf. An den Tagen 15, 17, 19 und 21. Ersetzen Sie den Überstand durch zwei Milliliter Kardiomyozyten-Differenzierungsmedium vier.
Nach der Präkultur mit vollständigem Blutmedium pro sieben Tage werden PBMCs groß mit sichtbaren Kernen und Zytoplasma, was darauf hindeutet, dass sie für die Transfektion mit Sendai-Virus-Reprogrammierungsfaktoren bereit sind. Bei der Einführung in das komplette E8-Medium. Die vollständig umprogrammierten Zellen werden sich anheften und beginnen, Kolonien zu bilden.
Nach vier bis fünf Passagen bilden sich aus den reprogrammierten Zellen hochreine iPSC-Kolonien, wobei nur sehr wenige differenzierte Zellen beobachtet werden. In diesem Stadium sind die meisten Zellen OCT4- und NANOG-positiv, was auf ihre Pluripotenie hinweist. Schlagende Kardiomyozyten werden normalerweise nach 12 Tagen der Differenzierung beobachtet.
Nach Glukosemangel und Neuplattierung zeigen iPSC-Kardiomyozyten spontane Schläge und eine ausgerichtete Sarkomerstruktur mit interkalierter kardialer Troponin-T- und Alpha-Actinin-Expression. Die Kolonien behalten ihre Reinheit, wie ihr Troponin T-Ausdruck beweist. Obwohl iPSC-Kardiomyozyten im Vergleich zu erwachsenen Kardiomyozyten relativ unreif sind.
Sie demonstrieren ventrikuläre und atriale Aktionspotentiale, gemessen durch Großhandelspflaster, Klemme. Ventrikuläre Kardiomyozyten exprimieren Myosin-Leichtkette zwei, während atrielle iPSC-Kardiomyozyten durch NR2F2-Expression gekennzeichnet sind. Die Wnt-Aktivierung stimuliert die Zellteilung und fördert die Expression von Zellzyklusregulatoren.
Interessanterweise induziert die Wnt-Aktivierung auch die robuste Proliferation von frühen iPSC-Kardiomyozyten für zwei Passagen im Vergleich zu Kontrollen, obwohl diese proliferative Fähigkeit im Laufe der Zeit abnimmt. Stellen Sie sicher, dass die PBMS mit dem klaren Kern- und Zytoplasma vergrößert werden, bevor die iPSC-Reprogrammierungsvektoren eingeführt werden, da der Zustand der PBMs für die iPSC-Reprogrammierung entscheidend ist. Patientenspezifische Kardiomyozyten sind wertvoll für die Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen in vitro und für die Bereitstellung einer Tonne Spenderzellen für die kardiale Stammzelltherapie.
