This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).

Alle experimentellen Verfahren werden in Übereinstimmung mit den Tier Richtlinien der University of Alabama in Birmingham durchgeführt. 1. Differenziert hiPSCs in hiPSC-CMs <ol><li> Beschichten der Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit vorgekühlten wachstumsfaktor reduziert gelatinösen Proteingemisch bei 4 ° C über Nacht. Saugen Sie das gallertartig Proteinmischung vor dem Gebrauch. Seed die hiPSCs auf die vorbeschichteten Platten und Kultur der Zellen (1 × 10 5 Zellen pro Vertiefung) bei 5% CO 2 und 37 ° C in mTeSR1 Medium Ergänzung mit 10 uM ROCK - Inhibitor. </li><li> Aktualisieren Sie das Medium täglich, bis die Zellen 90% Konfluenz erreichen; dann, wachstumsfaktor reduziert gelatinösen Proteinmischung zu dem Medium (0,5 mg gelatinösen Proteinmischung pro Platte mit 6 Vertiefungen, 2 ml Medium pro Vertiefung), und die Kultur der Zellen für 5% CO 2 und 37 ° C zwei Tage hinzu. <ol><li> Um das Medium zu ersetzen, saugen sanft das Medium aus der Petrischale über Vakuum mitaus den Zellen zu berühren, und neues Medium mit einer Transferpipette hinzufügen. </li></ol></li><li> Initiieren Differenzierung durch das Medium mit RPMI1640-Medium ersetzt, supplementiert mit Wachstumsfaktor reduzierte gelatinösen Proteingemisch, B27 ohne Insulin und 100 ng / ml Activin A; Kultur die Zellen bei 5% CO 2 und 37 ° C für 24 Std. </li><li> Ersetzen des Mediums mit RPMI1640-Medium, das ohne Insulin mit B27 ergänzt wurde, 10 ng / ml bone morphogenic protein 4 (BMP-4) und 10 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF); Kultur die Zellen bei 5% CO 2 und 37 ° C für 96 Stunden. </li><li> Ersetzen Sie das Medium mit RPMI1640 - Medium mit B27 ergänzt und weiter Kultur der Zellen bei 5% CO 2 und 37 ° C; erfrischen alle 3 Tage das Medium. </li><li> Beobachten Cluster von Zellen unter dem Mikroskop ~ 3 Tage nach Beginn der Differenzierung zieht. Sammeln Sie die Cluster ~ 7 Tage nach der ersten Kontraktionen und waschen Sie sie in Hanks Balanced Salt Solution Beobachtung. <ol><li> Distanzieren der geclusterten-Zellen in der Platte, indem sie in Hanks-Puffer Inkubation für 10 min bei 37 ° C, die 100 U / ml Kollagenase IV unter leichtem Schütteln; Dann wird für 5 min 0,25% Trypsin in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzuzufügen. </li><li> Neutralisieren der Enzymlösung mit 10% fötalem Rinderserum in RPMI / B27-Medium und dann Resuspendieren der Zellen in RPMI / B27 Medium. </li><li> Zähle die Anzahl der Zellen durch Hämocytometer. Kultur die Zellen auf 10 cm - Schalen bei 5% CO 2 und 37 ° C für mindestens 3 Stunden, die die nicht-Kardiomyozyten - Zellen an die Oberfläche der Kulturschale anhaften können. </li></ol></li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension, die die hiPSC-CMs enthält, und halten Sie die Zellen (etwa 1 x 10 6 Zellen pro 10 cm Schale) , indem sie auf einer gallertartigen Proteinmischung -beschichteten Oberfläche kultiviert werden . </li></ol> 2. Differenziert hiPSCs in hiPSC-ECs <ol><li> Distanzieren die hiPSC Bevölkerung in einzelne Zellen durch Inkubation them mit Mittel bei 5% CO 2 und 37 ° C für 5 min chelatisierenden. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit frischem mTeSR1 Medium. </li><li> Spin down die Zellen bei 200 xg für 5 min. Resuspendieren der Zellen in mTeSR1 Medium, das mit 10 &amp; mgr; M ROCK-Inhibitor. Bestimmen Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer. </li><li> In 250 ul 20 NIH-Einheiten / ml Thrombin-Lösung auf eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. </li><li> 1 x 10 6 hiPSCs bis 250 &amp; mgr; l einer 12,5 mg / ml Fibrinogen - Lösung. Und fügen Sie die 250 ul zellhaltigen Fibrinogenlösung auf die Thrombin-geladen gut. Beachten Sie die Mischung verfestigen, um ein hiPSC haltigen Fibrin Gerüst innerhalb min zu bilden. </li><li> Übertragen die verfestigten, zellhaltigen Gerüste in die Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit den Deckglaspinzetten und Differenzierung einzuleiten durch Kultivieren der Gerüste in 2 ml EBM2 Medium, ergänzt mit 2% B27 ohne Insulin, Activin-A (50 ng / ml) und BMP-4 (25 ng / ml) für 24 h bei 5% CO <sub&gt; 2 und 37 ° C. <ol><li> Ersetzen Sie das Medium vorsichtig das alte Medium über Vakuum saugt, ohne die Zellen zu berühren. Hinzufügen neuer EBM2 Medium, supplementiert mit B27 ohne Insulin, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF, 50 ng / ml), Erythropoietin (EPO, 100 ng / ml) und transformierender Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1, 10 ng / ml), und die Kultur, die Gerüste bei 5% CO 2 und 37 ° C für 48 Stunden. </li><li> Aktualisieren Sie die mittlere und Kultur die Gerüste bei 5% CO 2 und 37 ° C für weitere 48 h; Dann lassen Sie die Zellen aus dem Gerüst durch Zugabe von 200 U Kollagenase IV (100 U / ml) zum Medium. </li><li> Spin down die Zellen, nachdem sie freigegeben werden. Ersetzen Sie das Medium mit 2 ml EGM2-MV-Medium mit 2% der B27 ergänzt, VEGF-A (50 ng / ml) und SB-431542 (10 &amp; mgr; M); aktualisieren alle zwei Tage das Medium. </li><li> Etwa 10 Tage später (dh auf ~ 14. Tag nach der Differenzierung initiiert wurde), distanzieren die Zellen mit 100 U / ml Kollagenase IV, isolieren hiPS-ECs aus der Population von differenzierten Zellen über Durchflusszytometrie analysiert für die Expression von EC-spezifischen Markerproteine (zB CD31, CD144) 3. </li><li> Erweitern Sie den isolierten hiPSC-ECs über ein etabliertes Protokoll 3. </li></ol></li></ol> 3. Differenziert hiPSCs in hiPSC-SMCs <ol><li> Samen der hiPSCs auf Platten, die die Zellen in mTeSR1 Medium bei 5% CO 2 und 37 ° C, mit täglicher Mediumwechsel, bis zur Konfluenz (~ 2 Tage) mit gelatinösen Proteingemisch, und die Kultur beschichtet wurden. </li><li> Initiieren Differenzierung in mesodermalen Abstammungslinien-Zellen durch Kultivieren der Zellen mit CHIR99021 (5 uM) und BMP-4 (10 ng / ml) in RPMI1640-Medium und 2% B27 plus Insulin für 3 Tage. </li><li> HiPSC-SMCs mit überwiegend synthetischen Phänotyp zu erzeugen: <ol><li> Kultur der Zellen mit VEGF-A (25 ng / ml), Fibroblasten-Wachstumsfaktor-β (FGFβ, 5 ng / ml) in RPMI1640 me<html> dium und 2% B27 minus Insulins bei 5% CO 2 und 37 ° C für 4 Tage. </li><li> Kultur der Zellen in VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) in RPMI1640 - Medium und 2% B27 plus Insulin bei 5% CO 2 und 37 ° C für 2 Tage. </li><li> Kultur der Zellen in platelet-derived growth factor β (PDGFβ, 10 ng / ml), TGF &amp; bgr; (3 ng / ml) in RPMI - 1640 und 2% B27 plus Insulin bei 5% CO 2 und 37 ° C für 4 Tage. </li></ol></li><li> HiPSC-SMCs mit überwiegend Kontraktions Phänotyp zu erzeugen: <ol><li> Kultur die Zellen für 4 Tage mit VEGF-A (25 ng / ml) und FGFβ (5 ng / ml) in RPMI-1640 und 2% B27 minus Insulin. </li><li> Kultur die Zellen für 7 Tage mit PDGFβ (5 ng / ml) und TGF &amp; bgr; (2,5 ng / ml) in RPMI-1640 und 2% B27 plus Insulin. </li></ol></li><li> Reinige den endgültigen hiPSC-SMC-Populationen, indem die Zellen in Lactat-Kultivierung (4 mM) RPMI1640 Stoffwechselmedium für ~ 6 Tage enthält. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. Erstellen der IGF-enthaltenden Microspheres <ol><li> Olivenöl erhitzen auf 45 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Wärme 5 ml 10% igen Gelatinelösung auf 50 ° C. </li><li> Fügen Sie die Gelatine zu dem Olivenöl, rühren, und dann schnell abkühlen bis 5 ° C durch das Eis in das Wasserbad Zugabe. </li><li> Fünfundzwanzig Minuten später hinzuzufügen gekühlt (4 ° C) Aceton zu dem Olivenöl Mikrokügelchens Bildung zu induzieren. </li><li> Man hält die Temperatur bei 5 ° C für 1 Stunde; Dann sammeln Sie die Microspheres, sie 5-mal mit vorgekühltem Aceton waschen das Olivenöl, und lassen Sie sie an der Luft trocknen bei 4 ° C zu entfernen. </li><li> Resuspendieren der Mikrokügelchen in einer Lösung aus 70% Ethanol und 0,25% Glutaraldehyd über Nacht bei 4 ° C eine Vernetzung zu induzieren, und dann die Mischung mit 100 mM Glycin zu neutralisieren. </li><li> Last IGF in die Mikrokügelchen durch Mischen von 5 mg Mikrosphären mit 15 &amp; mgr; l destilliertem H 2 O , enthaltend 5 &amp; mgr; g IGF und 0,1% Rinderserumalbumin für 30 min. </li></ol> 5. Erstellen der Patch über der Stelle der Verletzung und die Injektion der Zellen <ol><li> Hängen Sie den hiPSC abgeleiteten CMs (2 Millionen), SMCs (1 Million) und ECs (1 Million) zusammen in 1 ml Minimum Essential Medium (MEM). </li><li> Suspend 5 mg Mikrokügelchen in 1 ml Fibrinogen-Lösung (25 mg / ml). </li><li> Füllen einer Spritze mit der zellhaltigen Lösung, eine andere Spritze mit der Fibrinogen / Mikrokügelchen - Lösung und eine dritte Spritze mit 1 ml Thrombinlösung (80 NIH Einheiten / ml, ergänzt mit 2 &amp; mgr; l 400 mM CaCl 2 und 200 mM ε-Aminocapronsäure Acid). </li><li> Chirurgisch Myokardinfarkt bei Schweinen Herz über Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie induzieren , wie vor 2 beschrieben. HINWEIS: Kurz gesagt, weibliche Yorkshire Schweine (~ 13 kg, 45 Tage alt) mit intramuskuläre Injektion von Telazol / Xylazin sediert sind (4,4 mg / kg) und unter Vollnarkose mit Isofluran (0,5-5%) intubiert. A 4 th intercostal Thorakotomie Koronararterie vorderen absteigenden ausgeführt und links ausgesetzt ist. Die Koronararterie wird durch eine Ligatur für 60 min okkludiert und dann wird die Ligatur entfernt. Sofortige elektrische Defibrillation wird im Fall von ventrikulärer Fibrillation durchgeführt. </li><li> Positionieren Sie einen sterilen Kunststoffring (~ 2,5 cm) auf dem Epikard des Infarktregion Schweineherzen, und dann zu injizieren gleichzeitig die Mikrokügelchen / Fibrinogen und Thrombin-Lösungen in den Ring. </li><li> Lassen Sie die Mischung (~ 30 sec) zu verfestigen, und dann legen Sie die Nadel der zellhaltigen Spritze durch die verfestigte Mischung in das Infarkt Myokard und injizieren die Zellen. Schließen Sie die Muskelschichten, Unterhautgewebe, und der Brustwand mit 3-0 oder 2-0 Monocryl Naht je nach Tiergröße. Buprenorphin 0,01-0,02 mg / kg intramuskulär alle 8 Stunden verwendet werden, um Schmerzen für die ersten 3 Tage nach der Operation zu steuern. </li><li> Bewerten Sie die Herzfunktion eines Herz mittels magnetischer Resonanzimaging (MRI) vor dem chirurgischen Eingriff, einer Woche und vier Wochen nach der chirurgischen Prozedur 2, 3, 4. Nach dem abschließenden MRT - Studien, opfern , um das Tier und verarbeiten ihre Herzen für die Histologie und molekulare Analyse 2, 3, 4. </li></ol>

<ol>
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Verbesserte Ausbeute / Reinheit von hiPSC-CMs Herkömmliche Protokolle für die oft menschliche Stammzellen in CMs Differenzierung durch eine geringe Ausbeute und Reinheit begrenzt; zum Beispiel erhalten nur 35-66% der hESC-CMs über Percoll Trennung und Herzkörperbildung langsam Myosin schwere Kette oder cTnT 6 ausgedrückt. Die Reinheit von differenzierten hiPSC-CM - Populationen im wesentlichen durch die Auswahl für die Expression eines Reportergens erhöht werden, ...

Menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) gehören zu den vielversprechendsten Mittel für die regenerative Zelltherapie, weil sie in eine potenziell unbegrenzte Reichweite und Menge der Zellen unterschieden werden können, die durch den Patienten Immunsystem abgestoßen werden nicht. Aber ihre Fähigkeit zur Selbstreplikation und die Differenzierung kann auch zur Tumorbildung führen und folglich müssen hiPSCs vollständig in spezifische Zelltypen zu differenzieren, wie Kardiomyozyten (CMs), Endothelzellen (ECs) und glatten Muskelzellen (SMCs ), vor der Verabreichung. Eine der einfachsten und häufigsten Methoden der Zell Verabreichung direkte intramyokardiale Injektion, aber die Anzahl der transplantierten Zellen, die von der nativen Herzmuskelgewebe transplantiert werden, ist außerordentlich gering. Ein Großteil dieser Abrieb kann auf die zytotoxische Umgebung des ischämischen Gewebes zugeschrieben werden; Wenn jedoch murinen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) wurden direkt in das Myokard von unversehrten Herzen injiziert, only ~ 40% der 5 Millionen Zellen wurden für 3-5 h 1, behielt geliefert , die ein wesentlicher Teil der verabreichten Zellen legt nahe , dass die Applikationsstelle verlassen, vielleicht , weil sie durch die hohen Drücke durch die Nadelbahn herausgedrückt erzeugt während Myokardkontraktion. Hier stellen wir neuartige und wesentlich effizientere Methoden zur Erzeugung hiPSC abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) 2, Endothelzellen (hiPSC-ECs) 3 und glatten Muskelzellen (SMCs) 4. Bemerkenswert ist , ist dies hiPSC-SMC - Protokoll die ersten , die breite Palette von morphologischen und funktionellen Eigenschaften in somatischen SMCs 5 beobachtet zu imitieren , indem die Zellen in Richtung einer überwiegend synthetische oder Kontraktions SMC - Phänotyp zu lenken. Wir stellen auch ein Verfahren zur Zellabgabe, die durch die Schaffung eines Cytokin-enthaltenden Fibrin p die Transplantationsrate von injizierten Zellen verbessertAtch auf die Injektionsstelle. Der Patch erscheint beide Zellretention zu verbessern, indem der Nadelbahn Abdichten der Zellen aus dem Verlassen des Myokards, und das Überleben der Zelle, durch die Freigabe insulin-like growth factor (IGF) über einen Zeitraum von mindestens drei Tage zu verhindern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="562">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Protocol 1</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Growth-factor-reduced matrigel</td>
			<td>Corning lifescience</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27 supplement, serum free</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI1640</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11875-119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Activin A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>338-AC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BMP-4</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>314-BP-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>232-FA-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase IV</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0217889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:163px;">Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14175079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-well plate</td>
			<td>Corning Lifescience</td>
			<td>356721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10cm dish</td>
			<td>Corning Lifescience</td>
			<td>354732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protocol 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Versene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibrinogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8630-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thrombin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7009-1KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EMB2 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VEGF</td>
			<td>ProSpec-Tany</td>
			<td>CYT-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EPO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHC9431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TGF-&#223;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-21C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGM2-MV medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SB-431542</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD31</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>BDB555445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD144</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eppendorff Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protocol 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CHIR99021</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td>720542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDGF-&#223;</td>
			<td>Prospec</td>
			<td>CYT-501-10ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protocol 4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Olive oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>291-G1-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15561020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heating plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP88850200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protocol 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"><img alt="ezh" src="/files/ftp_upload/55142/ezh.jpg" />-aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MEM medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anesthesia ventilator</td>
			<td>Datex-Ohmeda</td>
			<td>47810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anesthesia ventilator</td>
			<td>Ohio Medical</td>
			<td>V5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Defibrillator</td>
			<td>Physiol Control</td>
			<td>LIFEPAK 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5T MRI</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>Signa Horizon LX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7T MRI</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10018532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)</td>
			<td>Berlex</td>
			<td>50419-188-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-0 silk suture</td>
			<td>Ethilon</td>
			<td>685H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-0 silk suture</td>
			<td>Ethilon</td>
			<td>622H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3-0 monofilament suture</td>
			<td>Ethilon</td>
			<td>627H</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pluripotent stem cell derived cardiac cells for myocardial repair

Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) müssen vollständig in spezifische Zelltypen vor der Verabreichung unterschieden werden, aber herkömmliche Protokolle für hiPSCs in Kardiomyozyten (hiPSC-CMs), Endothelzellen (hiPSC-ECs) und glatten Muskelzellen (SMCs) Differenzieren sind oft begrenzt durch geringe Ausbeute, Reinheit und / oder schlechter phänotypische Stabilität. Hier stellen wir neue Protokolle zum Erzeugen hiPSC-CMs, -ECs und -SMCs, die wesentlich effizienter als herkömmliche Verfahren sind, sowie ein Verfahren zum Kombinieren von Zellinjektion mit einem Cytokin Haltiges Pflaster über der Verabreichungsstelle geschaffen. aus dem Myokard gequetscht, und das Überleben der Zelle, durch die Freigabe insulin-like growth factor (IGF) über einen längeren Zeitraum der Patch verbessert sowohl die Beibehaltung der injizierten Zellen, indem die Nadelbahn Abdichten der Zellen aus zu verhindern. In einem Schweinemodell der myokardialen Ischämie-Reperfusionsverletzung, war die Rate der Verpflanzung mehr als das Zweifache größer, wenn dieZellen wurden mit dem Zytokin Haltiges Pflaster zu den Zellen ohne Patch vergleicht verabreicht und die Behandlung sowohl mit den Zellen und dem Patch, aber nicht mit den Allein-Zellen wurde mit signifikanten Verbesserungen in der Herzfunktion und die Infarktgröße zugeordnet ist.

Charakterisierung von Differentiated hiPSC-CMs, -ECs und -SMCs Die differentielle Kapazität von hiPSCs 2 wurden ausgewertet, 3, 4. Durchflusszytometrie analysiert des kardialen Troponin T (cTnT) Ausdruck deuten darauf hin , dass die Reinheit des endgültigen hiPSC-CM Bevölkerung 90% überschreiten kann (Abbildung 1A, <...

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Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Wir präsentieren drei neue und effizientere Protokolle für den menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kardiomyozyten, Endothelzellen differenzieren und glatten Muskelzellen und eine Fördermethode, die das Einwachsen von transplantierten Zellen verbessert durch Zellinjektion mit Patch-vermittelten Cytokin-Lieferung zu kombinieren.

Pluripotente Stammzellen Herzzellen für Myocardial Repair Abgeleitet

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

pluripotent-stem-cell-derived-cardiac-cells-for-myocardial-repair

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham.  Wir präsentieren drei neue und effizientere Protokolle für den menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kardiomyozyten, Endothelzellen differenzieren und glatten Muskelzellen und eine Fördermethode, die das Einwachsen von transplantierten Zellen verbessert durch Zellinjektion mit Patch-vermittelten Cytokin-Lieferung zu kombinieren. 

Serie: Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, they lack hormone responsiveness and the overall procedure is cost-intensive. &#8220;Biological pacemakers&#8221; generated from PSCs may become an alternative, yet the typical content of pacemaker cells in Embryoid Bodies (EBs) is extremely low. The described protocol combines &#8220;forward programming&#8221; of murine PSCs via the sinus node inducer TBX3 with Myh6-promoter based antibiotic selection. This yields cardiomyocyte aggregates consistent of &#62;80% physiologically functional pacemaker cells. These &#8220;induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) are spontaneously contracting at yet unreached frequencies (400-500 bpm) corresponding to nodal cells isolated from mouse hearts and are able to pace murine myocardium ex vivo. Using the described protocol highly pure sinus nodal single cells can be generated which e.g. can be used for in vitro drug testing. Furthermore, the iSABs generated according to this protocol may become a crucial step towards heart tissue engineering.

This protocol describes how to produce functional sinus nodal tissue from murine pluripotent stem cells (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression plus cardiac Myosin-heavy-chain (Myh6) promoter antibiotic selection leads to highly pure pacemaker cell aggregates. These &#8220;Induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) contain over 80% pacemaker cells, show highly increased beating rates and are able to pace myocardium ex vivo.

Generierung von murinen Herzschrittmacher Zellaggregate Basierend auf ES-Zell-Programmierung in Kombination mit Myh6-Promoter-Auswahl

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Chondrogene Pelletbildung aus Cord Blut-induzierten induzierten pluripotenten Stammzellen

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

Eine familiäre Hypercholesterinämie menschlichen Leber chimärer Maus-Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...