Die Autoren bedanken sich bei Detlef Schumann, Jennifer Sutton (Thermo Fisher Scientific) und Nathaniel Snyder (University of Pennsylvania) für wertvolle Diskussionen über Massenkalibrierung und Datenverarbeitung bestätigen. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl R00CA168997 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

1. Herstellung von LC-MS-Reagenzien, Einrichtung einer Chromatographie-Methode und Einrichtung von Instrumenten Operating Procedures <ol><li> Herstellung von LC-Lösungsmittel <ol><li> Bereiten 500 ml mobilen Phasen. Eine 20 mM Ammoniumacetat und 15 mM Ammoniumhydroxid in 3% Acetonitril / Wasser, End-pH 9,0; und B ist 100% Acetonitril. </li><li> Lose Kappe der Flasche, legen Sie sie in einem Wasser Ultraschallbad und beschallen für 10 Minuten ohne zusätzliche Heizung. (Dieser Schritt stellt sicher, dass alle Ammoniumsalze vollständig zu lösen, und dass es keine Restluftblasen.) </li><li> Übertragungs 250 ml des Lösungsmittels in einen 250 ml Glasflasche für LC-MS verwenden, und halten den Rest bei 4 ° C </li></ol></li><li> Bereiten Sie die niedrigen Massenbereich Kalibrierungslösung. Es ist wichtig, eine maßgeschneiderte niedrigen Massenbereich Kalibrierung Mischung für Metabolomics-Anwendungen verwenden, um sicherzustellen, dass die genaue Massen werden bei niedrigen Molekulargewichten nachgewiesen. <ol><li> Wiegen 5 mg sowohl sodiähm Fluoracetat und Homovanillinsäure und in 5 ml Wasser auflösen, um eine endgültige Konzentration von 1 mg / ml zu machen. Auflösen Diazinon in Methanol, um eine Endkonzentration von 10 mg / ml zu ergeben. </li><li> Um 1 ml negativen geringe Masse Kalibrierungslösung, mischen Sie 960 ml Thermo negativen Kalibrierungslösung mit 20 ml Natrium fluoroaceate und Homovanillinsäure Lösung. Zu 1 ml positive geringe Masse Kalibrierungslösung zu machen, mischen Sie 990 ml Thermo positive Kalibrierungslösung und 10 ml Diazinon Lösung. (Die geringe Masse Kalibrierungslösung bei 4 ° C gelagert werden und alle 2 Monate frisch zubereitet werden.) </li></ol></li><li> Kalibrierung von QE-MS an einer Low Mass Bereich <ol><li> Bevor niedrigen Massenbereich Kalibrierung, Durchführung einer Standard-Massenkalibrierung (m / z, 150-2,000) in positive und negative Arten auf Basis der Anweisungen des Herstellers. </li><li> Sobald eine regelmäßige Massenkalibrierung spielt um 60 bis 900 m / z in der Bedienkonsole einstellen Scan-Bereichund eine Quelle CID von 25 eV für positiven Modus und 35 eV für Negativmodus angewendet wird. (Dies gibt robuste Signale des Koffein-Fragment-Ion und dem Sulfat-Ion. Die Scan-Bereich hier ist festgelegt, weil die letzte m / z sollte nicht größer als 15x des Ausgangs m / z) </li><li> Sobald die Ionenquelle ist stabil, dann die kundenspezifische Kalibrierung. Anmerkung: Eine stabile Quelle wird als weniger als 10% der Gesamtionenstromverlauf in positiven Modus von weniger als 15% im negativen Modus definiert und. Die kundenspezifischen Eichionen und entsprechenden m / z sind in Tabelle 1 aufgeführt. </li></ol></li><li> Stellen Sie den LC-MS-Instrumentierung für polare Metabolit-Analyse. LC ist mit einem QE-MS für Metabolit Trennung und Detektion gekoppelt. <ol><li> Anlegen der QE-MS mit einem Elektrospray-Ionisation Beheizte Sonde (H-ESI). Stellen Sie die entsprechenden Tuning-Parameter für die Sonde wie aufgelistet: Heizungstemperatur, 120 ° C; Gashülle, 30; Hilfsgas, 10; fegen Gas, 3; Spritzspannung 3,6 kV fürpositiven Modus und 2,5 kV für negativen Modus. Stellen Sie die Kapillare Temperatur bei 320 ° C und S-Linse 55. </li><li> Bauen Sie einen Scan-Methode wie folgt: Voll Scan-Bereich: 60 bis 900 (m / z); Auflösung: 70.000; maximale Einspritzzeit: 200 ms mit typischen Einspritzzeiten um 50 ms; automatische Verstärkungsregelung (AGC): 3.000.000 Ionen. Diese Einstellungen führen zu einem Tastverhältnis von etwa 550 ms durchzuführen Scans in positiven und negativen Modus. </li><li> Stellen Sie die Chromatographie-Verfahren. Beschäftigen ein Amid-Säule (100 x 2,1 mm ID, 3,5 mm) für die Verbindung Trennung bei Raumtemperatur 13,15. Die mobile Phase A ist, wie oben beschrieben, und die mobile Phase B ist Acetonitril. Verwenden Sie einen linearen Gradienten wie folgt: 0 min, 85% B; 1,5 min, 85% B, 5,5 min, 35% B; 10 min, 35% B, 10.5 min 35% B, 14.5 min 35% B, 15 min, 85% B und 20 min, 85% B. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 0,15 ml / min von 0 bis 10 min und 15 bis 20 min und 0,3 ml / min von 10,5 bis 14,5 min. </li></ol></li></ol> 2. Preparation Metabolit von Proben <ol><li> Bereiten Sie eine Extraktionslösungsmittel. Mischen Sie 40 ml Methanol (LC-MS-grade) und 10 ml Wasser (LC-MS-grade) in einem 50-ml-Tube, und halten Sie sie in -80 ° C-Gefrierschrank für mindestens 1 Stunde vor dem Gebrauch. Hinweis: Dieses Verfahren und die Schritte zur Extraktion von biologischem Gewebe und Flüssigkeitsproben modifiziert werden. <ol><li> Kultur Darmkrebs HCT 8 Zellen in drei 10-cm-Schalen oder 6-Well-Platten mit voller Wachstumsmedium RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 100.000 Einheiten / l Penicillin und 100 mg / L Streptomycin. </li><li> Wenn die Zellen 80% Konfluenz erreichen, das Medium schnell zu entfernen und die Schale oder Platte oben auf Trockeneis 13,15. 1 ml Extraktionslösung sofort (80% Methanol / Wasser), und übertragen Sie die Platte an den -80 ° C Gefrierschrank. Für eine 10 cm Schüssel, 3 ml der Extraktionslösung in jede Vertiefung. (Versuchen Sie, das Medium so viel wie möglich, um den Ionenunterdrückungseffekt durch Restsalze aus Medium zu vermeiden entfernen.)</li><li> Lassen Sie die Platte für 15 min. Entfernen Sie es aus der Tiefkühltruhe, und kratzen Zellen in das Lösungsmittel auf Trockeneis. Die Lösung wird in 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen und Zentrifugieren mit der Geschwindigkeit von 20.000 × g bei 4 ° C für 10 min. (Bereiten Zellmetaboliten aus drei verschiedenen Gerichten zu drei Parallelproben zu machen. Zweck des Haltens zwei Röhren ist es, eine als Datensicherung zu haben.) </li><li> Den Überstand in zwei neuen Eppendorf-Röhrchen, und trocknen Sie sie in einer Geschwindigkeit Vakuum. Dies dauert etwa 3-6 Stunden abhängig von der Geschwindigkeit Vakuum verwendet. (Die Proben können auch über Nacht unter Stickstoff getrocknet werden.) </li><li> Nach dem Trocknen die Röhrchen jeder Probe in der -80 ° C-Gefrierschrank. Wenn Sie bereit sind, zu rekonstruieren einer Probe in 20 ml Wasser (LC-MS-grade) und 5 ml injizieren zu LC-QE-MS für die Analyse. </li></ol></li></ol> 3. Aufbau der Probensequenz <ol><li> Nachdem die Kalibrierung ordnungsgemäß ausgeführt wurden, auf der QE-MS, LC-Säule ins Gleichgewicht für 5 min mit 85% A bei einer FlussRate von 0,15 ml / min, die den Ausgangszustand der LC-Gradienten ist. </li><li> Richten Sie die Probensequenz in zufälliger Reihenfolge. Anmerkung: Auf diese Weise verteilt es die durch die LC-MS zu jeder Probe eingeführt Schwankungen und gewährleistet einen genaueren Vergleich zwischen den verschiedenen Proben. Alle 6 Proben, einen Waschdurchlauf, der den gleichen MS-Verfahren teilt, mit Ausnahme der LC-Gradienten von 95% A für 10 min, gefolgt von einer 5 Minuten Äquilibrierung der Säule bei 85% A mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,15 ml / min. Leerproben (100% Wasser) nach jeder Wäsche run um das System Hintergrund bewerten und über die Höhe tragen. </li><li> Speichern Sie die Sequenz, und sobald das LC-Säule zeigt stabile Druck rund 400 psi, starten Sie die Reihenfolge laufen. Wenn es keine anderen Probe nach dieser Reihenfolge ausgeführt werden, dann einen Stoplauf am Ende der Sequenz, die einen Durchfluss von 0 ml / min am Ende des Gradienten hat und &quot;Bereitschaft&quot; nach Beendigung der Folge. </li><li> Re-Run die gleiche Probe eingestellt 12 Stunden nach der Kalibrierung. (Diese is, die Masse Fehler Fluktuation nach der Kalibrierung zu beurteilen.) </li></ol> 4. Beitrag Analysis Instrument Reinigung und Wartung <ol><li> Am Ende der Sequenz, Waschen der Säule mit 95% A bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml / min für 2 h und falls erforderlich, umgekehrt die Säule vor dem Waschen. </li><li> Entfernen Sie das LC-Säule und direkt an den LC zu der Ionenquelle von einer Gewerkschaft. Bereiten Sie Reinigungsmittel, Wasser / Methanol / Ameisensäure (v: v: v, 90:10:0.2), setzen MS auf den Standby-Modus, und die Wasch LC-MS-System bei einer Durchflussrate von 0,1 ml / min für 1 h zu entfernen die Restausgefällten Salze oder andere Verunreinigungen. Senken Sie die Durchflussmenge, wenn es zu viel Systemdruck. </li><li> Stellen Sie die Kapillare Temperatur bei 50 ° C, und entfernen Sie die Ionen-Käfig. Sie vorsichtig die Ionen-Sweep-Konus und die Ionentransportrohr nach der Kapillar-Temperatur fällt auf 50 ° C. Verwenden eine grobe Maschen, wie Sandpapier, um Verunreinigungen auf der Oberfläche belassen des Ionensweepkonus entfernen. </li><li> Setzen Sie den IonentransferRohr in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen mit 10 ml 90% Wasser / Methanol mit 0,1% Ameisensäure. Nach der Beschallung der Röhre in einem Wasser Ultraschallbad für 20 min, dekantieren des Lösungsmittels im Inneren, ersetzen Sie es mit 10 ml reinem Methanol und beschallen für weitere 20 min. (Wenn notwendig, kann die Ultraschallbehandlung bei 40 ° C oder eine noch höhere Temperatur, um eine bessere Reinigungsergebnisse zu erzielen geführt werden.) </li></ol> 5. Analyse der LC-MS-Daten <ol><li> Um die Probensequenz reibungslos abläuft, nach Abschluss der ersten beiden Proben in der Reihenfolge, überprüfen Peaks für unbekannte Metaboliten. Verwenden Sie eine CSV-Datei Auflistung Metabolit Namen, neutral chemische Formel und Erkennungsmodus (entweder positiv oder negativ), wie die Eingabedatei und die Ausgabedatei enthält extrahiert Spitzen und Massenfehler in ppm. Wenn der Peakform anormal oder die Massenfehler ausgeschaltet ist um mehr als 5 ppm beträgt, dann wird der Rest der Sequenz angehalten werden muss und Fehlerbehebung getan werden muss. </li><li> Wählen Sie die Methode der &quot;Spitzen Ausrichtungund Rahmen-Extraktion &quot;auf handelsübliche Software. Wählen Sie Rohdaten von LC-MS und gruppieren Sie sie. Pick-Proben in der Mitte der Ablaufreihenfolge wie Chromatographie Referenzprobe für die Spitzen Ausrichtung. Laden Sie einen Rahmen Saatgut einschließlich bekannter Stoffwechselmetabolite für die gezielte Analyse mit Daten gesammelt und der entsprechenden Rahmen Samen. </li><li> Führen Sie die Datenanalyse im positiven und negativen Modus getrennt. Verwenden Sie die Standardeinstellung für andere Parameter. Schalten Sie die Suchfunktion Datenbank und führen Sie den Workflow. Exportieren Sie die bearbeiteten Daten als Excel-Tabelle enthält Peakfläche von jedem Rahmen. Die ersten Sätze von Rahmen entsprechen den Metaboliten in der Zielliste. Anmerkung: Für einen gezielten Stoffwechselanalyse wird die Metaboliten Informationen basierend auf den früheren Studien 13,15 erhalten. </li><li> Für eine ungezielte Metabolitenanalyse, wählen Sie die Methode der &quot;Komponente Extraktion&quot;. Legen Leerproben für die Hintergrund Subtraktion. Stellen Sie Spitzenintensitätsschwelle ein10 t 5, m / z Breite von 10 ppm und das Signal-Rausch-Verhältnis von 3. </li><li> Verwenden menschlichen Metabolom-Datenbank für unbekannte Verbindungen Identifikation. Verwenden Sie einen CV-Filter, um die Komponenten mit großen Lebensläufe im Wiederholungsproben zu entfernen. Manuell durch jede Komponente gehen und diejenigen mit gut definierten Peak oder relativ großen Unterschied in verschiedenen Proben-Typen für Datenbank-Suche. Exportieren von Daten mit Hits in der Datenbank. (Spitzen Ausrichtung könnte umgangen werden, wenn der Spitzen Alignment-Score ist zu niedrig.) </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine Interessenkonflikte.

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Metabolite Profiling in Zellen mit diesem Protokoll sind: 1) die Steuerung des Wachstumsmediums und sorgfältige Entnahme der Zellen; 2) Einstellen des LC-Verfahren auf Basis von MS-Methode Einrichtung, um sicherzustellen, gibt es genug (in der Regel mindestens 10) Datenpunkte über einen Peak für die Quantifizierung; 3) macht einen geringen Masse Kalibrierung, bevor Sie Proben; 4) Einspritzen nicht mehr als 5 ml Retentionszeit zu vermeiden und Schaltspitzenverbreiterung ...

Metabolomics, definiert als ein Experiment, das mehrere Metabolite gleichzeitig misst, hat eine Fläche von großem Interesse. Metabolomics bietet eine direkte Auslesen der molekularen Physiologie und hat Einblicke in Entwicklung und Krankheit wie Krebs 4.1 zur Verfügung gestellt. Kernspinresonanz (NMR) und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) gehören zu den am häufigsten verwendeten Instrumente 5-9. NMR, vor allem für Fluss Experimente seit schweres Isotop markierten Verbindungen, wie 13 C-markierten Metaboliten verwendet wurde, sind NMR-aktiven 10,11. Diese Strategie erfordert jedoch relativ hohe Probenreinheit und großen Probenmenge, die ihre Anwendungen in der Metabolomics begrenzt. Inzwischen Daten aus NMR gesammelt braucht intensive Analyse und Zuordnung der komplexen Verbindung NMR-Spektren ist schwierig. GC-MS wurde weithin für Polar-und Lipidstoffwechselstudien verwendet, aber es erfordert flüchtigen Compounds und daher oft Derivatisierung von Metaboliten, die manchmal mit komplexen Chemie, die zeitaufwendig sein kann und führt experimentelle Rauschen. Flüssigkeitschromatographie (LC), um Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie verwendet den ersten Quadrupol zum Auswählen der intakten Elternionen, die dann in der zweiten Quadrupol fragmentiert werden, während der dritte Quadrupol wird verwendet, um charakteristische Fragmente oder Folgeionen zu wählen. Diese Methode, die den Übergang von der Mutterionen zu bestimmten Tochterionen erfasst wird multiple reaction monitoring (MRM) bezeichnet. MRM ist eine sehr empfindlich, spezifisch und robuste Methode sowohl für Kleinmolekül-und Protein-Quantifizierung 12-15,21. Allerdings MRM hat seine Grenzen. Um eine hohe Spezifität zu erreichen ein MRM-Methode muss für jeden Metaboliten gebaut werden. Dieses Verfahren besteht aus der Identifizierung eines spezifischen Fragments und entsprechend optimierten Kollisionsenergie, die vor der Kenntnis der prope erfordertrties der Metaboliten von Interesse, wie die chemischen Strukturinformation. Daher, mit einigen Ausnahmen, die die neutralen Verlust von gemeinsamen Fragmenten, ist es nicht möglich, unbekannte Metaboliten mit dieser Methode zu identifizieren. In den letzten Jahren haben die hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) Instrumente veröffentlicht worden, wie der LTQ-Orbitrap und Exactive Serie, die QuanTof und TripleTOF 5600 16-18,22. HRMS kann eine Masse bereitzustellen Verhältnis (m / z) von intakten Ionen innerhalb eines Fehlers von einigen ppm berechnen. Daher kann eine HRMS Instrument der Erfassung aller Vorläuferionen (dh Scan-Modus) betrieben direkte Strukturinformation von der exakten Masse und der daraus resultierenden elementaren Zusammensetzung des Analyten zu erhalten, und diese Informationen können verwendet werden, um potentiellen Metaboliten zu identifizieren. In der Tat können alle Informationen über eine Verbindung mit einer exakten Masse erhalten werden, bis auf die Ebene der strukturellen Isomere. Auch eine VollScan-Methode erfordert keine Vorkenntnisse von Metaboliten und nicht Methodenoptimierung erfordern. Darüber hinaus, da alle Ionen mit m / z in den Scan-Bereich fallen, kann analysiert werden, hat HRMS eine nahezu unbegrenzte Kapazität in Bezug auf die Anzahl der Metaboliten, die in einem einzigen Lauf quantifiziert kann im Vergleich zu der MRM-Methode werden. HRMS ist auch vergleichbar mit einem Triple-Quadrupol-MRM in der quantitativen Kapazität aufgrund der kurzen Arbeitszyklus, was zu einer vergleichbaren Anzahl von Datenpunkten, die in einem Voll MS erhalten werden, können zu scannen. Daher stellt HRMS einen alternativen Ansatz für die quantitative Metabolomics. Vor kurzem hat eine verbesserte Version des HRMS bezeichnet Q-Exactive Massenspektrometrie (QE-MS) können unter dem Wechsel zwischen positiven und negativen Arten mit ausreichend schnellen Zykluszeiten in einer einzigen Methode, die den Erfassungsbereich 19 erweitert betrieben werden. Hier beschreiben wir unsere Metabolomics-Strategie mit der QE-MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
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a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

Metabolite Profiling hat sich in der Studie der Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit ein wertvolles Gut. Allerdings haben aktuelle Plattformen verschiedene limitierende Faktoren, wie arbeitsintensive Probenvorbereitungen, niedrige Nachweisgrenzen, langsamen Scan-Geschwindigkeiten, intensive Methodenoptimierung für jeden Metaboliten, und die Unfähigkeit, sowohl positiv messen und negativ geladenen Ionen in einzelnen Experimenten. Daher könnte ein Roman Metabolomics-Protokoll Metabolomics-Studien voranzubringen. Amid-Basis hydrophilen Chromatographie ermöglicht polare Metabolitenanalyse ohne chemische Derivatisierung. Hochauflösende MS mit der Q-Exactive (QE-MS) hat Ionenoptik verbessert, erhöhte Scan-Geschwindigkeiten (256 ms bei einer Auflösung von 70.000), und hat die Fähigkeit der Durchführung von positiven / negativen Schalt. Mit einem kalten Methanol-Extraktionsstrategie und Koppeln eines Amid-Säule mit QE-MS ermöglicht robuste Detektion von 168 gezielte polaren Metaboliten und Tausende von zusätzlichen Funktionen gleichzeitig. Dateine Verarbeitung wird mit im Handel erhältlichen Software in sehr effizienter Weise durchgeführt, und unbekannte Funktionen aus den Massenspektren extrahiert können in Datenbanken abgefragt werden.

Die Genauigkeit der Metabolomics-Daten hängt stark von der LC-MS-Gerät QE-Leistung. Zu beurteilen, ob das Gerät in einem guten Zustand betrieben wird, und ob die angewendete Methode ist die richtige, sind verschiedene bekannte Metaboliten LC-Peaks von der Gesamt Ionenchromatographie (TIC) extrahiert, wie in Fig. 1 gezeigt. Polaren Metaboliten, einschließlich Aminosäuren, Glykolyse Zwischen , TCA Zwischenprodukte, Nukleotide, Vitamine, ATP, NADP + und so weiter haben gute Retention auf di...

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A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite Profiling hat sich in der Studie der Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit ein wertvolles Gut. Verwendung normaler-Phasen-Flüssigkeits-Chromatographie, um hochauflösende Massenspektrometrie mit Polaritätsumschaltung und eine schnelle Arbeitszyklus gekoppelt ist, beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Stoffwechselpolar Zusammensetzung von biologischem Material mit hoher Empfindlichkeit, Genauigkeit und Auflösung.

Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

a-strategy-for-sensitive-large-scale-quantitative-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Aufrufe.  Cornell University.  Metabolite Profiling hat sich in der Studie der Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit ein wertvolles Gut. Verwendung normaler-Phasen-Flüssigkeits-Chromatographie, um hochauflösende Massenspektrometrie mit Polaritätsumschaltung und eine schnelle Arbeitszyklus gekoppelt ist, beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Stoffwechselpolar Zusammensetzung von biologischem Material mit hoher Empfindlichkeit, Genauigkeit und Auflösung. 

Serie: A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Forschung

Biologie

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Batch Immunfärbung für Large-Scale Protein-Nachweis im Whole Affenhirn

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafisch-Based In-vivo- Small Molecule-Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium-Assay für Groß SNP Genotypisierung Anwendungen

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Ein halbautomatisches ChIP-Seq-Verfahren für groß angelegte epigenetische Studien

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. Exosomes for clinical application require large-scale production. To this aim, human synovial fluid MSCs (hSF-MSCs) were grown on microcarrier beads, and then cultured in a dynamic three-dimension (3D) culture system. Through utilizing 3D dynamic culture, this protocol successfully obtained large-scale exosomes from SF-MSC culture supernatants. Exosomes were harvested by ultracentrifugation and verified by a transmission electron microscope, nanoparticle transmission assay, and western blotting. Also, the microbiological safety of exosomes was detected. Results of exosome detection suggest that this approach can produce a large number of good manufacturing practices (GMP)-grade exosomes. These exosomes could be utilized in exosome biology research and clinical osteoarthritis treatment.

Here, we present a protocol to produce a large number of GMP-grade exosomes from synovial fluid mesenchymal stem cells using a 3D bioreactor.

Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale quantitative phenotypic measurements from cells. This approach has proved powerful for deepening our understanding of a wide range of both fundamental and applied events in cell biology. To date, the majority of applications for this technology have relied on the use of cells grown in monolayers, although it is increasingly realized that such models do not recapitulate many of the interactions and processes that occur in tissues. As such, there has been an emergence in the development and use of 3-dimensional (3D) cell assemblies, such as spheroids and organoids. Although these 3D models are particularly powerful in the context of cancer biology and drug delivery studies, their production and analysis in a reproducible manner suitable for HCS and HCA present a number of challenges. The protocol detailed here describes a method for the generation of multicellular tumor spheroids (MCTS), and demonstrates that it can be applied to three different cell lines in a manner that is compatible with HCS and HCA. The method facilitates the production of several hundred spheroids per well, providing the specific advantage that when used in a screening regime, data can be obtained from several hundred structures per well, all treated in an identical manner. Examples are also provided, which detail how to process the spheroids for high-resolution fluorescence imaging and how HCA can extract quantitative features at both the spheroid level as well as from individual cells within each spheroid. This protocol could easily be applied to answer a wide range of important questions in cell biology.

This protocol details a method for the production of three different types of spheroids in a manner that makes them suitable for large-scale high-content screening and analysis. In addition, examples are presented showing how they can be analyzed at spheroid and individual cell levels.