Die Arbeit hier berichtet wird, wurde durch Zuschüsse von der Auburn University und AUDFS USAF CRADA 07-277-60MDG-01 unterstützt. Die in diesem Artikel sind die der Autoren und spiegeln nicht die offizielle Politik oder Position der United States Air Force, Department of Defense, oder die US-Regierung.

1. Einstellen der Stage <ol><li> Erhalten Typstamm S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 und Bacillus subtilis ATCC 6051. Methicillin-resistente Stämme von S. aureus - MRSA1, MRSA 2, 5 MRSA, MRSA 13, 26 MRSA, MRSA 34, 45 MRSA, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Das lytische Phagen 12600. </li><li> Erhalten PBP 2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen. </li><li> Bereiten NZY Medium wie beschrieben 21. </li><li> Erhalten Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Bereiten VE-Wasser als Subphase für Langmuir-Blodgett (LB)-Monoschicht Abscheidung. </li></ol> 2. Bakteriophagen Vermehrung und Titration <ol><li> Inkubieren 5 ml Übernachtkultur von S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 Kolonie bildenden Einheiten (KBE) / ml) mit 500 ul Phagen (3 x 10 9 &lt;/ Sup&gt; PFU / ml) in 500 ml Medium in NZY 2 L Flack auf Schüttler-Inkubator bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Zentrifuge bei 4.424 xg Kultur für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Re zentrifugierten Überstand bei 11.325 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Filter Überstand durch ein 0,22 um Millipore-Filter. </li><li> Das Filtrat bei 75.395 xg für 1,5 Stunden. </li><li> Anschließend das Pellet in 100 ul destilliertem Wasser. </li><li> Bereiten 10fache Verdünnungen von Phagensuspension in NZY Medium. </li><li> Plate 1 ml über Nacht (ON) Kultur von S. aureus ATCC 12600 auf je 2 Platten mit NZY Agar sicherstellen, dass alle Oberfläche bedeckt ist. Entfernen Sie den Überschuss an Kultur und lassen die Oberfläche trocken für 30 min. </li><li> Spot eine Probe (10 ul) geeigneter Phagenverdünnung auf die Oberfläche der Platte und Inkubation bei 37 ° C für 18-24 Std. </li><li> Untersuchen Sie die Bildung von Plaques und die Berechnung der Phagentiter. Bakteriophagen-Titer (T) auf der Grundlage der Anzahl von p geschätztLaques (N) je 10 ul Volumen (V) des Phagen Suspension und der Verdünnungsfaktor (F) gebildet ist. . T = N / (vxf) Beispiel für die Anzahl der Plaques 75 bei der Verdünnung 10 -7 und das Volumen 10 ul (10 x 10 -3 ml), ist der Titer gleich 75 /: Der Titer wurde durch Formel (10 x 10 -3 x 10 -7) = 7,5 x 10 10 Plaque-bildende Einheiten (PFU) pro ml Suspension. </li></ol> 3. Gold-immobilisierten Phagen <ol><li> Saubere goldbeschichteten Quarz Stück (60 mm 2) durch Plasma-Ätzen in Argon für 10 min und dann für 6 Stunden sterilisieren unter UV-Licht in einem sterilen Gehäuse. </li><li> In 50 Mikroliter von 1 x 10 9 PFU / ml Phagensuspension an die Goldoberfläche jedes Stückes in eine sterile Petrischale, und dann Inkubation über Nacht in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen und die restlichen titrieren Phagensuspension. </li><li> Waschen Stücke mit gebundenen Phagen 5 mal mit PBS, um ungebundene entfernenPhagen. </li></ol> 4. Testen von immobilisiertem Phageninfektiosität auf eine trockene Oberfläche <ol><li> Verbreiten Sie eine O / N-Kultur von S. Aureus ATCC 12600 auf eine NZY Agarplatte und trocknen lassen. </li><li> Legen Sie ein Goldstück mit immobilisierten Phagen auf die Platte nach unten. </li><li> Beobachten einer Zone der Lyse nach 12-stündiger Inkubation bei 37 ° C, die angibt Infektiosität. </li><li> Mit Gold bedeckt Stücke ohne Phagen in Kontrollversuche. </li></ol> 5. Prüfung der lytischen Aktivität der freien und gebundenen Phagen in Liquid <ol><li> Hinzufügen eines ON Kultur von S. aureus ATCC 12600 bis 10 ml NZY in jeder von vier 300 ml-Kolben Seitenarm (6 x 10 6 CFU / ml in jeden Kolben). </li><li> Hinzufügen In zwei Kolben 2 x 10 6 PFU / ml des freien Phagen. </li><li> Mit den beiden anderen Kolben als Kontrollen. </li><li> Überwachen Sie den zeitlichen Verlauf der S. aureus Zelllyse für 570 min durch Messung der optischen Dichte (OD 600) bei 30 min-Takt für alle Flaschen.</li><li> Nehmen Sie eine abschließende Messung nach 24 Stunden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.5, sondern verwenden Sie Goldstücke mit gebundenen Phagen anstelle des freien Phagen und Goldstücke ohne Phagen in Kontrolle Kolben. </li></ol> 6. Der Verlust der gebundenen Phagen während der Inkubation <ol><li> In 50 ul 1 x 10 9 PFU / ml Phagen auf der Oberfläche von sterilen Goldstück in einer Petrischale, die in einer feuchten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur gelegt wird. </li><li> Entfernen Sie die Suspension mit ungebundenen Phagen aus der Goldoberfläche und Titer. </li><li> Waschen Sie das Goldstück mit gebundenen Phagen 5 mal mit PBS und in 1 ml NZY Lösung in 15 ml Tube im Shaker-Inkubator bei 37 ° C für 8 Stunden. </li><li> Bestimmen Sie den Titer der abgelösten Phagen wie in 2 beschrieben. </li></ol> 7. Phagen Spheroids Vorbereitung <ol><li> Die Kombination 400 ul stock Phagen 12600 Suspension (10 11 PFU / ml) mit einem gleichen Volumen Chloroform spektrophotometrische Grad in 1 ml Fläschchenbei Raumtemperatur. </li><li> Vortexen die Phagen-Chloroform Suspension 5-6 mal (5 Sekunden-Intervallen) über eine Minute Dauer. </li><li> Erlaubt die Suspension für 30 sec stabilisieren und dann Pipettieren der oberen Phase, die Sphäroide off wurde Monolayer pipettiert. </li><li> Nehmen Sie ein paar Mikroliter der Sphäroide Suspension für die Übertragung und der Rasterelektronenmikroskopie. </li><li> Verwenden Sie einen verbleibenden Sphäroid Aufhängung für Biosensor Fertigung. </li></ol> 8. Biosensor Vorbereitung <ol><li> Saubere QCM-D-Sensoren durch Plasma-Ätzen in Argon für 10 min PDC-32G Harrick Plasma cleaner. </li><li> Spülen Sensor mit Hexan keine organischen Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> Vorbereiten und reinigen einen Trog des Films Gleichgewicht wie in 22 beschrieben. </li><li> Füllen LB Trog mit einer Subphase Lösung und reinigen Sie ihn mit einem Trog Barriere und stabilisieren die Mulde bei 20 ± 0,1 ° C </li><li> Verbreiten Sie 300 ul Aliquot des Phagen 12600 in wässrigen Susauf (10 11 PFU / ml) auf LB Subphase. </li><li> Bereiten Phagen Monoschicht auf LB Subphase Lösung, indem 300 ul Aliquots des Phagen 12600 wässrigen Suspension (10 11 PFU / ml) abzulaufen eine geneigte benetzbaren Glasstab, der teilweise in die Subphase 22,23 eingetaucht ist. </li><li> Stabilisieren Sie die vorbereiteten Monoschicht für 10 min und dann komprimieren mit einer Geschwindigkeit von 30 mm / min (45 cm 2 / min), bis ein konstanter Druck 19 N / m erreicht wird. </li><li> Führen einer vertikalen Schichtabscheidung auf senkrecht positioniert QCM-D-Sensor mit einer Geschwindigkeit von 4,5 mm / min durch aufeinanderfolgendes Eintauchen Sensor in die und aus der Monoschicht siebenmal. Elektronenmikroskopie abgeschieden Phagen Monoschichten vor der Exposition gegenüber bakteriellen Proben zeigten, daß die Schichten kontinuierliche, homogene und einheitliche (Daten nicht gezeigt) waren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,8 mit einem Phagen Sphäroid Suspension in 3 hergestellt wird. </li><li> Verwenden hergestellt Phagen Biosensoren für die MRSA-Erkennung, ElektronenMikroskopie und Ellipsometrie. </li></ol> 9. Biosensor Testing, Diskriminierung von Methicillin-resistenten Staphylococcus Bakterien und Sensitive <ol><li> In diesem Protokoll werden Biosensoren mit unmodifizierten und modifizierten Phagen und Phagen-Kügelchen hergestellt. Quarzkristall-Mikrowaage mit vier Sensor Strömungskammern dient zur Überwachung Bindung von Bakterien an die Phagen auf QCM Sensoroberfläche immobilisiert. PBP 2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen werden verwendet, um zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Alle Messungen werden in der Flow-Modus (50 ml / min) bei 5 MHz durchgeführt. </li><li> Stellen Sie eine Basislinie Resonanzfrequenz der QCM Sensor in Wasser (~ 30 min). </li><li> Zeichnen einer Suspension lebender Methicillin sensitive Staphylococcus Bakterienzellen in Wasser (10 9 CFU / ml) durch die Testzelle. </li><li> Kontinuierliche Überwachung Änderungen in der Resonanzfrequenz und Sensoren Energiedissipation zum ersten Oberton, using der Q-Soft Software. </li><li> Wenn die Änderungen in der Resonanzfrequenz Sensoren und Dissipation Sättigung erreicht, fügen Sie die Aussetzung der PBP-Antikörper, konjugiert Latexkügelchen (6,77 x10 10 Perlen / ml) auf die Strömung während der kontinuierlichen Überwachung von Frequenz und Verlustleistung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 9,2-9,5 für Methicillin-resistenten Staphylococcus Bakterienzellen (MRSA). </li><li> Definieren Sie einen Frequenzwechsel durch die Masse Änderung durch Bakterien-Bindung durch die Sauerbrey-Gleichung Af = 24,25-Dm xn / C, wobei C die Masse Empfindlichkeit konstant (C = 17,7 ng x cm -2 x Hz -1 bei 5 MHz ) m Masse und n die Anzahl Oberton (n = 1). </li><li> Definieren einer Energiedissipation Änderung (Δ D) von der Aufnahme der exponentiellen Abklingen der Schwingung (Frequenz und Amplitude dämpft, welche erlaubt die Quantifizierung der Energie abgeführt und während einer Periode der Oszillation gespeichert,E abgeführt und E jeweils gespeichert: Δ D = E abgeführt / 2 πE gespeichert. Δ D ist in Verlustleistung Einheiten (DU), eine DU = 10 -6 relative Einheiten) gemessen. </li></ol>

<ol>
	<li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+using+lytic+phage+probes.">Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).</li><li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+methicillin+resistant+and+sensitive+strains+of+Staphylococcus+aureus+using+tandem+measurements.">Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements.</a> J. Microbiol. Methods. 90, 182-191 (2012).</li><li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., Long, R., Olsen, E., Neely, W., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Langmuir+monolayers+and+Langmuir-Blodgett+films.">Phage Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films.</a> Colloids and Surfaces, B: Biointerfaces. 82, 182-189 (2011).</li><li>Barie, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-resistant+gram-positive+cocci:+implications+for+surgical+practice.">Antibiotic-resistant gram-positive cocci: implications for surgical practice.</a> World. J. Surg. 22, 118-126 (1998).</li><li>Byun, D. E., Kim, S. H., Shin, J. H., Suh, S. P., Ryang, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+epidemiologic+analysis+of+Staphylococcus+aureus+isolated+from+clinical+specimens.">Molecular epidemiologic analysis of Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens.</a> J. Korean Med. Sci. 12, 190-198 (1997).</li><li>Duan, L., Lei, H., Huang, E., Yi, G., Fan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+of+Staphylococcus+aureus+from+lower+respiratory+tract.">Drug resistance of Staphylococcus aureus from lower respiratory tract.</a> Zhonghua Yiyuanganranxue Zazhi. 21, 1667-1668 (2011).</li><li>Giamarellou, H., Papapetropoulou, M., Daikos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methicillin+resistant'+Staphylococcus+aureus+infections+during+1978-79:+clinical+and+bacteriologic+observations.">Methicillin resistant' Staphylococcus aureus infections during 1978-79: clinical and bacteriologic observations.</a> J. Antimicrob. Chemother. 7, 649-655 (1981).</li><li>Knopf, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infections+caused+by+multiresistant+pathogens.+Clinical+management+exemplified+by+multiresistant+Staphylococcus+aureus.">Nosocomial infections caused by multiresistant pathogens. Clinical management exemplified by multiresistant Staphylococcus aureus.</a> Urologe A. 36, 248-254 (1997).</li><li>Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+differential+inoculum+disk+diffusion+method+and+Vitek+GPS-SA+card+for+detection+of+oxacillin-resistant+staphylococci.">Evaluation of differential inoculum disk diffusion method and Vitek GPS-SA card for detection of oxacillin-resistant staphylococci.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 433-436 (1994).</li><li>Struelens, M. J., Nonhoff, C., Van, D. A., Philippe Mertens, R., Serruys, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rapid+ATB+Staph+for+5-hour+antimicrobial+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus.">Evaluation of rapid ATB Staph for 5-hour antimicrobial susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2395-2399 (1995).</li><li>Woods, G. L., LaTemple, D., Cruz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+MicroScan+rapid+gram-positive+panels+for+detection+of+oxacillin-resistant+staphylococci.">Evaluation of MicroScan rapid gram-positive panels for detection of oxacillin-resistant staphylococci.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 1058-1059 (1994).</li><li>Knapp, C. C., Ludwig, M. D., Washington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+BBL+crystal+MRSA+ID+system.">Evaluation of BBL crystal MRSA ID system.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 2588-2589 (1994).</li><li>Qadri, S. M., Ueno, Y., Imambaccus, H., Almodovar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+by+Crystal+MRSA+ID+System.">Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by Crystal MRSA ID System.</a> J. Clin. Microbiol. 32, 1830-1832 (1994).</li><li>Zambardi, G., Fleurette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+multicentre+evaluation+of+a+commercial+system+for+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">European multicentre evaluation of a commercial system for identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15, 747-749 (1996).</li><li>Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methicillin+resistance+in+staphylococci:+molecular+and+biochemical+basis+and+clinical+implications.">Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications.</a> Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).</li><li>Brown, D. F. J., Edwards, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+laboratory+diagnosis+and+susceptibility+testing+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+(MRSA).">Guidelines for the laboratory diagnosis and susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).</a> J. Antimicrob. Chemother. 56, 1000-1018 (2005).</li><li>Gerberding, J. L., Miick, C., Liu, H. H., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+conventional+susceptibility+tests+with+direct+detection+of+penicillin-binding+protein+2a+in+borderline+oxacillin-resistant+strains+of+Staphylococcus+aureus.">Comparison of conventional susceptibility tests with direct detection of penicillin-binding protein 2a in borderline oxacillin-resistant strains of Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents &amp; Chemotherapy. 35, 2574-2579 (1991).</li><li>Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., Simonian, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lytic+phage+as+a+specific+and+selective+probe+for+detection+of+Staphylococcus+aureus-A+surface+plasmon+resonance+spectroscopic+study.">Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus-A surface plasmon resonance spectroscopic study.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 948-955 (2007).</li><li>Popham, D. L., Young, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+penicillin-binding+proteins+in+bacterial+cell+morphogenesis.">Role of penicillin-binding proteins in bacterial cell morphogenesis.</a> Current Opinion in Microbiology. 6, 594-599 (2003).</li><li>Wei, Y., Havasy, T., McPherson, D. C., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+shape+determination+by+the+Bacillus+subtilis+class+B+penicillin-binding+proteins+encoded+by+pbpA+and+pbpH.">Rod shape determination by the Bacillus subtilis class B penicillin-binding proteins encoded by pbpA and pbpH.</a> J. Bacteriol. 185, 4717-4726 (2003).</li><li>Grieco, S. H. H., Lee, S., Dunbar, W. S., MacGillivray, R. T. A., Curtis, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+filamentous+phage+yield+during+computer-controlled+fermentation.">Maximizing filamentous phage yield during computer-controlled fermentation.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 32, 773-779 (2009).</li><li>Olsen, E. V., Pathirana, S. T., Samoylov, A. M., Barbaree, J. M., Chin, B. A., Neely, W. C., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+selective+biosensor+for+Salmonella+and+its+detection+in+the+environment.">Specific and selective biosensor for Salmonella and its detection in the environment.</a> J. Microbiol. Methods. 53, 273-285 (2003).</li><li>Pathirana, S. T., Barbaree, J., Chin, B. A., Hartell, M. G., Neely, W. C., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+biosensor+for+Salmonella.">Rapid and sensitive biosensor for Salmonella.</a> Biosens. Bioelectron. 15, 135-141 (2000).</li><li>Sauerbrey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+quartz+oscillators+for+weighing+thin+layers+and+for+microweighing.">The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for microweighing.</a> Z. Phys. 155, 206-222 (1959).</li><li>Hook, F., Rodahl, M., Brzezinski, P., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+Dissipation+Kinetics+for+Protein+and+Antibody-Antigen+Adsorption+under+Shear+Oscillation+on+a+Quartz+Crystal+Microbalance.">Energy Dissipation Kinetics for Protein and Antibody-Antigen Adsorption under Shear Oscillation on a Quartz Crystal Microbalance.</a> Langmuir. 14, 729-734 (1998).</li><li>Griffith, J., Manning, M., Dunn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+bacteriophage+contract+into+hollow+spherical+particles+upon+exposure+to+a+chloroform-water+interface.">Filamentous bacteriophage contract into hollow spherical particles upon exposure to a chloroform-water interface.</a> Cell. 23, 747-753 (1981).</li><li>Hosseinidoust, Z., Van de Ven, T. G. M., Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Capture+Efficiency+and+Antimicrobial+Activity+of+Phage-Functionalized+Model+Surfaces.">Bacterial Capture Efficiency and Antimicrobial Activity of Phage-Functionalized Model Surfaces.</a> Langmuir. 27, 5472-5480 (2011).</li><li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent'+Reporter+Phage+for+the+Detection+of+Category+A+Bacterial+Pathogens.">Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens.</a> J. Vis. Exp. (53), e2740 (2011).</li><li>Voinova, M. V., Jonson, M., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missing+mass"+effect+in+biosensor's+QCM+applications.">Missing mass" effect in biosensor's QCM applications.</a> Biosens. Bioelectron. 17, 835-841 (2002).</li><li>Gervals, L., Gel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+biotinylated+bacteriophages+on+biosensor+surfaces.">Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces.</a> Sensors and Actuators. 125, 615-621 (2007).</li><li>Nanduri, V., Sorokulova, I. B., Samoylov, A. M., Simonian, A. L., Petrenko, V. A., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+as+a+molecular+recognition+element+in+biosensors+immobilized+by+physical+adsorption.">Phage as a molecular recognition element in biosensors immobilized by physical adsorption.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 986-992 (2007).</li><li>Sorokulova, I., Watt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+biopolymer+for+preservation+of+microorganisms+during+sampling+and+storage.">Natural biopolymer for preservation of microorganisms during sampling and storage.</a> J. Microbiol. Methods. 88, 140-146 (2012).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Plating+Methods.">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Es ist bekannt, dass Phagen als Biosensor Sonden für bakterielle Erreger 28 verwendet werden. Es wird in dieser Arbeit gezeigt, dass Phagen zusammen mit PBP 2a Antikörper genutzt werden, um das alte Problem zu lösen: schnelle Diskriminierung antibiotikaresistenten und empfindliche Stämme. Es wurde gefunden, jedoch diese normale unveränderte Staphylokokken Phagen nicht geeignet sind für Bakterien Detektion mit QCM Geräte, obwohl sie Bakterien binden. Die Phagen-Schwanz ist s...

Methicillin-resistente Stämme von Staphylococcus aureus haben als ein Faktor in wesentlichen Infektionen und nosokomiale Ausbrüche 4-8 vorgeschlagen worden. Gemeinsame Wege der Anerkennung von Methicillin-Resistenz, wie die Scheibe Diffusion Oxacillin Agar Probeaufnahmen oder Bouillonmikrodilutions auf maßgeschneiderte Kulturbedingungen verlassen, um den Ausdruck des Widerstands zu verbessern. Änderungen umfassen die Verwendung von Oxacillin, Inkubation bei 30 oder 35 ° C statt 37 ° C, und die Aufnahme von NaCl zu dem Wachstumsmedium. Weiterhin für korrekte Erkennung durch diese Art von Techniken, eine lange Inkubationszeit von 24 h statt 16 bis 18 h erforderlich. Schnelle Techniken mit entsprechenden (&gt; 96%) Empfindlichkeit für die Identifizierung von Methicillin-Resistenz sind automatisierte microdilution Techniken wie die Vitek GPS-SA-Karte, die Rapid-ATB Staph-System und Rapid Microscan Systemsteuerung System, Ergebnisse zu produzieren nach 3-11 h 9-11. The Crystal MRSA ID-System ist ein schnelles Verfahren auf Anerkennung des Wachstums von S. basierend aureus in Gegenwart von 2% NaCl und 4 mg Oxacillin pro Liter mit einem Sauerstoff-sensitive Fluoreszenz-Sensor. Beansprucht Empfindlichkeiten im Bereich zwischen 91 bis 100% nach 4 h Inkubation 12-14. Diese phänotypische Methoden sind in ihrer Genauigkeit durch die Auswirkungen der herrschenden Stämme, die heterogene Widerstand auszudrücken begrenzt. Daher ist die beste weithin akzeptierte Verfahren für die Anerkennung von Methicillin-Resistenz PCR oder DNA-Hybridisierung des mecA Gens 15. Allerdings erfordert diese Technik gereinigt DNA und ist äußerst empfindlich gegenüber verschiedenen Beimischungen (Verunreinigungen), die Zelltrümmer 16 umfassen. Darüber hinaus müssen diese Verfahren eine lange Zeit durchzuführen. Strategien, um die Anerkennung des mecA Genprodukt Protein PBP 2a, könnte genutzt werden, um den Widerstand zu bestimmen und kann zuverlässiger im Vergleich zu Standard-Test-Techniken 17. Staphylococcus aureus-Stämme, einschließlich solche, die Methicillin-Resistenz 1,2,18 verwendet werden. In dieser Arbeit haben wir vorgeschlagen, eine neue Technik in der spezifischen Erkennung und Erkennung von MRSA, wie die Anerkennung von Bakterien zusammen mit Konformation von MRSA in Echtzeit. Für diesen speziellen Zweck ein S. aureus Bakteriophagen mit einem breiten Wirtsspektrum (einschließlich MRSA) mit einem monoklonalen Antikörper gegen Protein kombiniert (PBP 2a) verwendet wurden. PBP 2a eine Zellwandprotein und ist die Ursache von antibiotischen Widerstand von MRSA. Allerdings PBP 2a Antikörper ist nicht spezifisch für S. aureus seit einigen anderen Bakterien Antibiotika-bindende Proteine ​​mit Sequenzähnlichkeit zu PBP 2a 19,20. Folglich in dieser Arbeit, S. aureus Bakteriophagen und Antikörper gegen PBP 2a Protein verwendet wurden. Um einen Biosensor zu entwickeln spezielltisch erkennen und zu identifizieren MRSA Ein Gerät mit einem zwei Schritten genutzt wurde. Der erste Schritt verwendet ein S. aureus Bakteriophagen Monoschicht als Sensor-Sonde, während der zweite Schritt PBP 2a spezifischen Antikörpern verwendet. Daher Schritt wird man erkennen, S. aureus Bakterien, als der andere empfindlich gegen das Antibiotikum-Bindungsprotein. Wenn Signale von zwei Schritten erhalten positiv sind, gibt es den spezifischen Nachweis von MRSA.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) </td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P4417 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>spectrophotometric-grade chloroform </td>
			<td>Sigma-Aldrich, 
				St. Louis, MO </td>
			<td>154733 </td>
			<td>(99.8% A.C.S.) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hexane-Anhydrous </td>
			<td>Sigma-Aldrich, 
				St. Louis, MO</td>
			<td>29609-0</td>
			<td>(95%)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethyl Alcohol </td>
			<td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT </td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>190 Proof</td>
		 </tr>	
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBP 2a antibody conjugated latex beads</td>
			<td>Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>The MRSA-Screen test</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from </td>
			<td>American Type Culture Collection (Manassas, VA);</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 </td>
			<td>The culture collection of Auburn University, Auburn, AL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K
				Ultra Centrifuge</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>KSV 2200 LB film balance</td>
			<td>KSV Chemicals, Finland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Light microscope optical system </td>
			<td>CitoViva Technology Inc., Auburn, AL </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>QCM-D</td>
			<td>Q-Sense AB, V&auml;stra Fr&ouml;lunda, Sweden </td>
			<td>E4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scanning electron microscope (SEM)</td>
			<td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td>
			<td>JEOL-7000F SEM </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmitting electron microscopy (TEM)</td>
			<td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td>
			<td>JEOL, JEM 2010 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stericup, Presterilized</td>
			<td>Millipore Corporation, Billerica, MA</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>0.22 &mu;m, GP Express PLUS membrane</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bio-Assay dish</td>
			<td>NUNC A/S, Denmark</td>
			<td>240835</td>
			<td>Dimensions(mm), 245 x 245 x 25</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson, Pipetman, France</td>
			<td>P100, P200, P1000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>C24 Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, CT</td>
			<td>Classic C24</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gold-coated quartz pieces</td>
			<td>Auburn University, AL</td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Brand, USA</td>
			<td>0875713</td>
			<td>100 mmX15 mm </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SterilGard III Advance</td>
			<td>The Baker Company, ME</td>
			<td>SG403</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Culture Growing Flasks</td>
			<td>Corning Incorporated, NY</td>
			<td>4995</td>
			<td>PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optical Spectrometer</td>
			<td>Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.</td>
			<td>4001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, USA</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Millipore water purification system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Direct-Q</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Ellipsometer</td>
			<td>Accurion, USA</td>
			<td>nanofilm_ep3se
			</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software </td>
			<td>Q-Sense AB, Sweden</td>
			<td>QSoft, QTools</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

biosensor for detection of antibiotic resistant staphylococcus bacteria

Eine konstruktiv transformiert lytischen Bakteriophagen mit einem breiten Wirtsbereich von Staphylococcus aureus und Penicillin-Bindungsprotein (PBP 2a)-Antikörper, konjugiert Latex-Kügelchen wurden verwendet, um einen Biosensor zur Diskriminierung von Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindlich (MSSA) S ausgelegt zu erstellen . aureus Arten 1,2. Die lytische Phagen in Phagen Sphäroide wurde durch Kontakt mit Wasser-Chloroform-Schnittstelle umgewandelt. Phagen Sphäroid Monoschichten haben auf einem Biosensor Oberfläche wurde durch Langmuir-Blodgett (LB)-Technik 3 bewegt. Die angelegten Biosensoren nach einem Quarzkristall mit Dissipationsmessung Verfolgung (QCM-D), um Bakterien-Phagen-Wechselwirkungen auswerten untersucht. Bakterien-Sphäroid Wechselwirkungen zu reduzierten Resonanzfrequenz und einem Anstieg in Dissipationsenergie sowohl für MRSA und MSSA Stämmen führte. Nach der bakteriellen Bindung haben diese Sensoren wurde weiter auf die Penicillin-bindende Protein Antikörper Latexperle ausgesetzts. Sensoren mit MRSA untersucht reagierte auf 2a Antikörper Perlen PBP, obwohl Sensoren mit MSSA inspiziert gab keine Antwort. Diese experimentelle Unterscheidung bestimmt eine eindeutige Unterscheidung zwischen Methicillin-resistenten und sensiblen S. aureus-Stämme. Ebenso gebundenen und ungebundenen Bakteriophagen unterdrücken das Wachstum von Bakterien auf Oberflächen und in Wasser-Suspensionen. Sobald lytischen Phagen in Sphäroide geändert werden, behalten sie ihre starke lytische Aktivität und zeigen eine hohe bakterielle Capture-Funktion. Die Phagen und Phagen Sphäroide können für die Prüfung und Sterilisation von Antibiotika-resistenten Mikroorganismen verwendet werden. Andere Anwendungen können die Verwendung in Bakteriophagen-Therapie und antimikrobielle Oberflächen.

Die Phagen zeigte lytische Aktivität gegen alle getesteten Stämme von S. aureus, einschließlich MRSA-Stämme, wie die Phagen-Spot-Test angegeben. Plaque Größen Regel reichten von 5 bis 15 mm. Wurde keine Aktivität gegen andere Test-Kulturen (Tabelle 1). Ein normales Wachstum von S. aureus ATCC 12600 in NZY Mediums auf Schüttler-Inkubator bei 37 ° C ist in Abbildung 1A (eine Kurve durch leere Kreise gekennzeichnet) gezeigt. Die Anzah...

Watch this Scientific Journal Video about Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria at JoVE.com

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Lytic Phagen Biosensoren und Antikörper Perlen sind in der Lage, zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Die Phagen wurden durch ein Langmuir-Blodgett-Technik auf einer Oberfläche einer Quarzkristall-Mikrowaage Sensor immobilisiert und arbeitete als breites Staphylococcus Sonden. Antikörper erkennen Perlen MRSA.

Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

biosensor-for-detection-antibiotic-resistant-staphylococcus

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.9K Aufrufe.  Auburn University. Lytic Phagen Biosensoren und Antikörper Perlen sind in der Lage, zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Die Phagen wurden durch ein Langmuir-Blodgett-Technik auf einer Oberfläche einer Quarzkristall-Mikrowaage Sensor immobilisiert und arbeitete als breites Staphylococcus Sonden. Antikörper erkennen Perlen MRSA.