Wir danken den Ingenieuren und Studenten des Fraunhofer-Zentrums für Fertigungsinnovation. Für die Unterstützung bei der Entwicklung, Bearbeitung und Automatisierung des experimentellen Systems danken wir Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin und Dr. Sudong Shu. Wir danken Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu und Katarzyna Kuliga für die Hilfe beim Testen von experimentellen Protokollen und datenerfassung. Wir würdigen Dr. Anne E. Carpenter und Mark-Anthony Bray von der Imaging Platform am Broad Institute of Harvard und MIT für ihre Hilfe bei der Entwicklung der Bildanalyse-Routine in CellProfiler. Das beschriebene Projekt wurde teilweise durch die Auszeichnungen R21AI079474 und 1R01AI101446 vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of Allergy and Infectious Diseases oder der National Institutes of Health dar. Das Projekt wurde auch vom Fraunhofer USA unterstützt.

1. Erstellen der PDMS-Schicht (Abbildung 1)
<ol><li>PDMS und Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 kräftig mischen. Um Blasen zu entfernen, entgasen Sie das viskose Gemisch in einer Vakuumkammer für 1 Stunde bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Auf einer Skala, gießen Sie das PDMS langsam über die Aluminiumform. Gießen Sie aus der Mitte und halten Sie die Form nivelliert. Achten Sie darauf, die Stifte unbedeckt zu lassen. Hören Sie auf zu gießen, sobald das Zielgewicht erreicht ist. Unsere Form benötigt 4 g PDMS und 0,4 g Aushärtungsreagenz.
</li>
	<li>Die Form in einem Ofen nivellieren und bei 37 °C über Nacht aushärten. Alternative Aushärtungszeiten sind 2 Stunden bei 60 °C oder 1 Stunde bei 90 °C.
</li>
	<li>Sezieren Sie die ausgehärtete PDMS-Schicht entlang der Kante der Form und schälen Sie sie vorsichtig von der Formoberfläche mit einem Paar Zangen ab. Reinigen Sie die Formoberfläche mit 70% Ethanol und einer Q-Spitze.</li>
</ol>2. Montieren Sie die Durchflusszelle gemäß Abbildung 2
Die Standardmontage von PDMS mit Glasschlitten erfolgt durch Sauerstoffplasmabehandlung beider Oberflächen, was eine leckagefreie Verklebung zwischen PDMS und Mikroskopglasschlitten gewährleistet. Im vorgestellten Protokoll würde die Plasmabehandlung die chemische Beschichtung auf dem Glasschlitten zerstören. Daher ist der Schlitten druckversiegelt und nicht mit Plasma behandelt.
<ol><li>Legen Sie das Glasfenster in die Fließzellentasche.</li>
	<li>Legen Sie einen beschichteten Glasschlitten über das Glasfenster in der Tasche der Durchflusszelle mit der aktiven Seite nach oben, und legen Sie die PDMS-Schicht mit Nachteilen darauf. Platzieren Sie den PDMS-Schlitten so, dass die Kanaleingänge an den Durchgangslöchern in der Metallplatte ausgerichtet sind. Drücken Sie die Luft vorsichtig zwischen den Schichten.</li>
	<li>Drehen Sie die PDMS/Glasschiebegruppe so, dass das PDMS auf das Glasfenster zeigt. Überlappen Sie die PDMS-Kanaleingänge mit den Durchgangslöchern in der Metallplatte.</li>
	<li>Legen Sie die Druckplatte oben und ziehen Sie die Schrauben fest.</li>
	<li>Stellen Sie die montierte Durchflusszelle unter das Mikroskop. Stellen Sie die Mikroskopvergrößerung auf 60X ein und richten Sie die Kanalpositionen voraus.</li>
</ol>3. Bereiten Sie Log Phase Bakterien
<ol><li>Tag vor dem Experiment: Impfen Sie 50 ml Mueller Hinton Brühe mit 2% NaCl (MH2) mit einer Bakterienkolonie. Bei 250 Umdrehungen bei 37 °C über Nacht schütteln. Ein oder zwei Bakterienstämme können in einem Experiment für die beschriebene Einrichtung untersucht werden.
</li>
	<li>Vor dem Experiment: Mischen Sie 50 l über Nacht Bakterienkultur in 50 ml MH2-Medien. Schütteln Sie bei 250 Rpm für 3 Stunden bei 37 °C, um sicherzustellen, dass sich die Bakterien in der Log-Phase befinden.</li>
</ol>4. Erwärmen Sie die experimentellen Lösungskomponenten mindestens 10 Minuten, bevor sie benötigt werden
<ol><li>Den Fluoreszenzfarbstoff (5 mM Vorrat) und Lysostaphin (10 g/ml Vorrat) bei Raumtemperatur auftauen.</li>
	<li>Das Oxacillinpulver auf Raumtemperatur erwärmen.</li>
</ol>5. Bereiten und laden Sie die bakterielle Suspension
<ol><li>Nach dem Ende der 3-stündigen Subkultur: Nehmen Sie 10 ml Bakterienkultur und Zentrifuge bei 1.650 x g für 2 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie Bakterien in 1 ml frischen MH2-Medien wieder aus.</li>
	<li>Befestigen Sie eine kurze Schlauchlänge an einer 1 ml Luer-Sperrspritze. Spülen Sie den Spritzenschlauch mit 1 ml Medien. Lassen Sie ein wenig Medien in den Schläuchen, um Luftblasen beim Ziehen in der bakteriellen Suspension zu vermeiden.</li>
	<li>0,7 ml Bakterien Typ 1 in die Spritze geben. Füllen Sie zwei Kanäle der Durchflusszelle mit Bakterien Typ 1. Achten Sie darauf, dass die Flüssigkeit auf der anderen Seite des Kanals nach caerscheint. 150 l. Die Transparenz des Kanals ändert sich, da er mit Bakterien gefüllt ist.
</li>
	<li>Wenn Sie mit mehreren Bakterientypen experimentieren, wiederholen Sie das Belastungsverfahren für Bakterien Typ 2 in die beiden verbleibenden Kanäle der Durchflusszelle.</li>
	<li>Legen Sie die Durchflusszelle 45 min bei 37 °C in den Inkubator, um eine bakterielle Absetzung und Befestigung an der Gleitfläche zu ermöglichen.</li>
</ol>6. Vorbereiten und Laden der experimentellen Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie 140 l 0,5 mM Fluoreszenzfarbstofflösung vor, indem Sie 14 l Fluoreszenzfarbstoff (5 mM) und 126 l MH2-Medien mischen.</li>
	<li>Verdünnen Sie 10 mg Oxacillin in 40 ml MH2-Medien, um eine Endkonzentration von 250 g/ml Oxacillin zu erhalten.</li>
	<li>Bereiten Sie 130 ml Kontrolllösung mit Endkonzentrationen von 0,25 m Fluoreszenzfarbstoff und 0,7 ng/ml Lysostaphin vor. Mischen Sie dazu 65 l Fluoreszenzfarbstoff (0,5 mM), 9,12 l Lysostaphin-Bestand (10 g/ml) und 130 ml MH2-Medien.</li>
	<li>Bereiten Sie 130 ml Antibiotikumlösung mit Endkonzentrationen von 0,25 m Fluoreszenzfarbstoff, 0,7 ng/ml Lysostaphin und 50 g/ml Oxacillin vor. Mischen Sie dazu 65 l Fluoreszenzfarbstoff (0,5 mM), 9,12 l Lysostaphin-Bestand (10 g/ml), 26 ml Oxacillin (250 g/ml) und 104 ml MH2-Medien.</li>
	<li>Füllen Sie zwei 60 ml Spritzen mit Kontrolllösung und zwei 60 ml Spritzen mit Antibiotikum. Bewahren Sie Lösungen in Aluminiumfolie ein, um einen lichtbedingten Abbau der Reagenzien zu vermeiden. Überfüllen Sie die Spritzen, um den Verlust durch Spülung der Schläuche zu berücksichtigen.
</li>
	<li>Entfernen Sie Luftblasen aus den Spritzen durch Streichen. Mit der experimentellen Lösung an der Spitze anbringen und füllen.</li>
	<li>Spritzen auf die Pumpe montieren. Legen Sie die Spritze zuerst mit dem kleinsten Volumen, dann verriegeln Sie die Kolbenposition. Passen Sie den Rest der Spritzen auf die Pumpe und drücken Sie ihre Kolben nach Bedarf.</li>
	<li>Stellen Sie die Pumpendrehzahl auf 1 ml/min und das Pumpenvolumen auf 60 ml ein. Machen Sie eine Spülung mit der Pumpe, bis ein stetiger Flüssigkeitsstrom von allen Spritzen aus gesehen wird.</li>
</ol>7. Richten Sie die Durchflusszelle unter dem Mikroskop ein
<ol><li>Entfernen Sie die Durchflusszelle aus der Zentrifuge und montieren Sie sie auf die Mikroskopstufe (Abbildung 3).</li>
	<li>Verbinden Sie Ein-/Ausgangsschläuche mit jedem der Durchflusszellenkanäle (ein Eingang/ein Ausgang pro Kanal). Das Sammeln der Leistung in vier verschiedene Behälter ermöglicht die Messung einzelner Kanalausgangsvolumina.</li>
</ol>8. Führen Sie das 60-Minuten-Experiment
<ol><li>Überprüfen Sie die vorausgerichteten Positionen aus Schritt 2.5. Wenn das Mikroskop-Sichtfeld nicht auf den Kanal zentriert ist und/oder nicht fokussiert ist, passen Sie die Einstellungen an und speichern Sie die neuen Positionen. Eine präzise Fokussierung ist aufgrund der hohen Dichte der belasteten Bakterien vor dem Durchflussstart möglicherweise nicht möglich.
</li>
	<li>Stellen Sie die Phasenkontrasterfassungszeit auf 10 msec und die Fluoreszenzerfassungszeit auf 1.600 msec ein.</li>
	<li>Erhalten Sie Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder für jede Position, bevor Sie den Durchfluss einieren. Dies gibt eine qualitative Schätzung der geladenen Bakteriendichte.
</li>
	<li>Starten Sie den Flüssigkeitsfluss und überprüfen Sie sofort, ob das Mikroskop auf die Unterseite der Kanäle fokussiert ist.</li>
	<li>Nehmen Sie Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder der Zielbereiche innerhalb der ersten Minute des Durchflusses.</li>
	<li>Erfassen Sie Bilder alle 2 min nach dem ersten Satz von Bildern, bis 60 min des Durchflusses aufgetreten ist. Bei Bedarf neu fokussieren.</li>
</ol>9. Desinfizieren Sie die Durchflusszelle
<ol><li>Machen Sie eine 10% Bleichlösung in einem Becher (100 ml). 4 x 20 ml Spritzen mit 10 ml der Mischung füllen. Die Spritzen abblasen und an der Durchflusszelle befestigen. Es dauert 1-2 min, bis die Kanäle von Bakterien frei sind.
</li>
	<li>Stellen Sie die Pumpendrehzahl auf 1 ml/min und das Pumpenvolumen auf 3 ml ein. Laufen Sie für 3 min.</li>
	<li>4 x 60 ml Spritzen mit 60 ml DI-Wasser füllen. Die Spritzen abblasen und an der Durchflusszelle befestigen.</li>
	<li>Stellen Sie die Pumpendrehzahl auf 1 ml/min und das Pumpenvolumen auf 30 ml ein. Laufen Sie für 30 min.</li>
	<li>Überwachen Sie die Kanalreinigung unter dem Mikroskop.</li>
	<li>Zerlegen Sie die Durchflusszelle. Entsorgen Sie die verwendete Epoxidfolie. Die Durchflusszellenkomponenten 20 min in DI-Wasser einweichen. Lufttrocken.</li>
</ol>10. Analysieren von Bildern und Generieren von Daten
<ol><li>Zählen Sie die Anzahl der Bakterien in jedem Bild. Die Open-Access-Software CellProfiler wird verwendet, um Batch-Bildverarbeitung16durchzuführen. Eine Übersicht auf hoher Ebene der CellProfiler-Routine ist in Tabelle 1zusammengefasst. Die Anzahl der Bakterien, die im Phasenkontrastbild (Np) vorhanden sind, gibt die Gesamtzahl der Bakterien an. Die Anzahl der im Fluoreszenzbild (Nf) sichtbaren Bakterien gibt die Anzahl der abgestorbenen Bakterien an.
</li>
	<li>Berechnen Sie den normalisierten Prozentsatz des bakteriellen Zelltodes als Funktion der Zeit.<ol>
<li>Importieren Sie Nf und Np für einzelne Bilder in die Datenanalysesoftware.</li>
		<li>Berechnen Sie den Anteil der abgestorbenen Bakterien in jedem Kanal zu einem bestimmten Zeitpunkt, der durch den Bruch (Nf / Np) bei t = T gegeben wird.</li>
		<li>Subtrahieren Sie den Anteil der toten Bakterien, die zu Beginn des Experiments vorhanden waren (t = 1 min) sowohl für die Kontrolle als auch für die experimentellen Kanäle.</li>
		<li>Subtrahieren Sie den Anteil der toten Bakterien, die im Steuerkanal vorhanden sind, von dem, der im experimentellen Kanal zu jedem Zeitpunkt vorhanden ist, mit der folgenden Gleichung: <img alt="Data Analysis Equation" fo:content-width="6in" height="217" src="/files/ftp_upload/50828/Data_analysis_equation.png" width="620">
</li>
		 <li>Graph DPNorm vs. t für den Verlauf des Experiments. Beachten Sie, dass eine Stichprobe mit einem Zelltodprozentsatz von mehr als 1 % als anfällig gilt, während weniger als 0,5 % des Todes auf Resistenz hindeuten. Prozentsätze, die zwischen diesen beiden Cut-offs liegen, gelten als unbestimmt, und die Probe muss erneut getestet werden.
</li>
		<li>Verwenden Sie eine Kalkulationstabelle, um Ergebnisse aus verschiedenen Experimenten zusammenzufassen und zu analysieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+systems+for+pathogen+sensing:+a+review.">Microfluidic systems for pathogen sensing: a review.</a> Sensors. 9, 4804-4823 (2009).</li><li>Yager, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+diagnostic+technologies+for+global+public+health.">Microfluidic diagnostic technologies for global public health.</a> Nature. 442, 412-418 (2006).</li><li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics.">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+toxicological+complexity+by+multi-dimensional+screenings+in+microsegmented+flow:+modulation+of+antibiotic+interference+by+nanoparticles.">Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles.</a> Lab Chip. 12, 474-484 (2012).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+susceptibility+testing+using+high+surface-to-volume+ratio+microchannels.">Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels.</a> Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).</li><li>Churski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+of+antibiotic+toxicity+in+an+automated+microdroplet+system.">Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system.</a> Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).</li><li>Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).</li><li>Kim, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+monitoring+of+antibiotic+susceptibility+of+bacterial+biofilms+in+a+microfluidic+device.">In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).</li><li>Peitz, I., van Leeuwen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+bacteria+growth+monitoring+by+automated+DEP-facilitated+image+analysis.">Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis.</a> Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).</li><li>Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+rapid,+stress-induced+antibiotic+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus.">A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).</li><li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+viability+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+SYTOX+green+nucleic+acid+stain.">Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).</li><li>Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+digestion+by+lysostaphin.">Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin.</a> J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).</li><li>Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+envelope+stress+response+in+Gram-positive+bacteria.">Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).</li><li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+wall+as+target+for+attack:+past,+present,+and+future+research.">Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research.</a> Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+from+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: from targets to networks.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+of+cellular+death+induced+by+bactericidal+antibiotics.">A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics.</a> Cell. 130, 797-810 (2007).</li></ol>

Die mikrofluidische Methode ist patentangemeldet: Sauer-Budge A, Sharon A, Kalaschnikow M, Wirz H, Erfinder; Verfahren und Vorrichtung zum schnellen Nachweis von bakteriellen Antibiotikaresistenz/Anfälligkeit Patent PCT/US10/33523.

Das vorgestellte Protokoll wurde in einer Reihe von Experimenten mit methicillin-sensitiven und methicillin-resistenten Staphylococcus aureus Stämmen10validiert und optimiert. Daher sollte dieses Protokoll ohne Änderung direkt auf andere Stämme von S. aureus und anderen Antibiotika mit Wirkmechanismen anwendbar sein, die die bakterielle Zellwandbiosynthese beeinflussen. Andere Bakterientypen als S. aureus können eine Variation der Spannungsparameter erfordern: lösliche (enzymati...

Der Anstieg der bakteriellen Resistenz verstärkt die Notwendigkeit für schnelle Phänotyp-basierte Antibiotika-Anfälligkeitstests, um unsere Medikamente der letzten Instanz zu schützen. Standard-Empfindlichkeitstests basieren auf bakteriellen Wachstumshemmungen in Gegenwart von Antibiotika, die mehrere (8-24) Stunden dauern. Wir haben einen neuartigen Antibiotika-Anfälligkeitstest auf einer mikrofluidischen Plattform entwickelt, der auf der Stressaktivierung biosynthetischer Wege beruht, um die Wirkung von Antibiotika zu beschleunigen.
Antibiotika-Empfindlichkeitstests im mikrofluidischen Maßstab tragen den Vorteil einer effektiven Probenverwendung, da sie eine geringe Anzahl von Bakterien erfordern. Zusätzlich können mikrofluidische Geräte multiplexiert werden, um mehrere Proben unter mehreren Bedingungen zu testen1,2. Kürzlich wurde eine Reihe von mikrofluidischen Methoden für Antibiotika-Anfälligkeitstests berichtet3-9. Bei diesen Methoden werden Bakterien innerhalb von Nano- und Picolitertröpfchen3,7, im vollen Volumen des mikrofluidischen Kanals4-6,8oder als einzelne Bakterien elektrisch lokalisiert auf der unteren Oberfläche desKanals 9. Obwohl diese Tests in mikrofluidischen Kanälen durchgeführt werden, überwachen sie alle das mikrobielle Wachstum in Gegenwart und Fehlen von Antibiotika, die traditionellen Methoden ähneln. Wachstumsmessungen werden über optische Dichte, pH-empfindliche Farbstoffe oder helle Feld-/Phasenkontrast- oder Fluoreszenzbilder durchgeführt. Obwohl einige dieser Tests schneller als herkömmliche Methoden sind, erkennen sie jeweils passiv Antibiotikaresistenzen. Mit anderen Worten, diese Methoden erfordern immer noch den Benutzer auf bakterielles Wachstum als das endgültige Auslesen warten.
Im Gegensatz dazu haben wir eine Methode entwickelt, die eine Kombination aus Scher- und enzymatischem Stress verwendet, um antibiotikaempfindliche biochemische Wege zu aktivieren10. Die Ausfechtung der gestressten Bakterien mit diesen Antibiotika schafft einen schnelleren Anfälligkeitstest. Bakterien, die gegen das Antibiotikum resistent sind, sind in der Lage, den stressigen Bedingungen zu widerstehen. Anfällige Bakterien hingegen werden durch die kombinierten Spannungen schnell abgetötet. Der Prozentsatz des Zelltodes nach einer Stunde, gemessen durch Mikroskopie mit einem fluoreszierenden Totzellfleck, definiert den Phänotyp der Bakterien (resistent vs. anfällig).
Für eine erfolgreiche Umsetzung unserer Methode müssen Bakterien auf der untersten Oberfläche des mikrofluidischen Kanals immobilisiert werden. Auf diese Weise können Bakterien verschiedenen Belastungen ausgesetzt und gleichzeitig unter dem Mikroskop in einer einzigen Ebene abgebildet werden. Zur Immobilisierung von Bakterien wird ein beschichteter Mikroskopglasschlitten eingesetzt. Der Schlitten wird vom Hersteller mit Epoxidgruppen für unspezifische Proteinbindung vorbeschichtet. Die unspezifische Bindung dieser Epoxide an bakterielle Oberflächenproteine bindet die Bakterien kovalent an die Gleitoberfläche.
Stämme werden unter identischen Bedingungen (Scherung + enzymatische Belastung) in Abwesenheit (Kontrolle) und Vorhandensein (Experiment) von Antibiotikum getestet. Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopbilder jedes Kanals werden automatisch alle zwei Minuten für eine Stunde aufgenommen. Resistenzbezeichnungen werden dann durch Vergleich des Prozentsatzes der abgestorbenen Bakterien im Versuchskanal mit denen im Kontrollkanal gemacht. Nach einer Stunde gilt eine Stichprobe mit einem Zelltodprozentsatz von mehr als 1 % als anfällig, während weniger als 0,5 % des Todes auf Resistenz hindeuten. Prozentsätze, die zwischen diesen beiden Cut-offs liegen, gelten als unbestimmt, und die Probe muss erneut getestet werden.
Mikrofluidische Kanäle sind in PDMS definiert, das ein Material der Wahl für mikrofluidische Geräteist 11. PDMS ist optisch transparent in einer Vielzahl von Wellenlängen, biokompatibel, inert, gasdurchlässig und hat eine geringe Durchlässigkeit gegenüber Flüssigkeiten; daher ist es gut für diese Experimente geeignet.
Mechanische/Scherspannung entsteht durch den Fluss von Raumtemperaturmedien über die immobilisierten Bakterien. (Hinweis: Eine Erwärmung der Medien auf 37 °C hat keine signifikanten Auswirkungen auf das Assay-Ergebnis.) Automatisierte Spritzenpumpen zwingen Medien (mit totem Zellfleck +/- Antibiotikum sowie optionalen enzymatischen Stressoren) durch die mikrofluidischen Kanäle (200 x 400 m) bei einer Durchflussrate von 1 ml/min, um 6,25 kPa Scherkraft oder eine Scherrate von 6.000 sec-1zu geben. Diese Rate entspricht oder übertrifft zuvor untersuchte Scherspannungen auf Staphylokokken.
Das Enzym, Lysostaphin, wurde für Vorversuche ausgewählt, weil es direkte Schäden an der Staphylococcus-Zellwand verursacht. Die Konzentration von Lysostaphin (0,7 ng/ml) reichte aus, um bakterielle Zellwandschäden zu verursachen, aber nicht ausreichend, um im Zeitrahmen des Experiments einen bakteriellen Zelltod ohne Antibiotikum zu verursachen. Lysostaphin ist nicht für die korrekte Bezeichnung der bakteriellen Anfälligkeit erforderlich, aber es erhöht das Ergebnis, was zu einem erhöhten Zelltod in anfälligen Stämmen führt. Im Gegensatz dazu ist Scherspannung entscheidend für die Assay-Funktion. Wenn Methicillin-empfindliche Staphylococcus aureus-Stämme ohne Durchfluss mit Lysostaphin und Oxacillin behandelt werden, wird im Laufe des Experiments kein Zelltod aufgezeichnet.
Die Zelllebensfähigkeit wird mit einem fluoreszierenden toten Zellfleck12überwacht. Die Auswahl des Farbstoffs beruhte auf seiner Fähigkeit, nur geschädigte Zellen selektiv zu färben, seine Nichttoxizität gegenüber lebenden Zellen und seine niedrige Hintergrundfluoreszenz, die seine direkte Zugabe zu den Zellmedien ohne zusätzliche Schritte ermöglichte. Die Auswahl einer fluoreszierenden Farbstoffkonzentration von 0,25 m sollte während einer Expositionszeit von 1,6 Sek. gegenüber Fluoreszenzerregungslicht akzeptable Signalwerte erreichen.
Das Beta-Lactam, Oxacillin, wurde in unseren Vorstudien verwendet. Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) Arten sind resistent gegen Oxacillin und zeigen keinen nennenswerten Zelltod im Zeitrahmen des Experiments. In den Vorstudien wurde die Konzentration von 50 g/ml ermittelt. Niedrigere Konzentrationen von Antibiotika ergaben eine geringere Trennung zwischen resistenten und anfälligen Stämmen, während höhere Konzentrationen keinen nennenswerten Unterschied in den experimentellen Ergebnissen verursachten.
Wir haben bereits über die erfolgreiche Entwicklung eines Tests berichtet, der mechanische und enzymatische Spannungen kombiniert, die die bakterielle Zellwand13 direkt mit einem Antibiotikum beeinflussen, das die Zellwandbiosynthese hemmt14,15. Diese Proof-of-Prinzip-Experimente wurden auf einer Gruppe von MRSA und Methicillin-sensitiven S. aureus (MSSA) durchgeführt. Bei der Auswahl der richtigen experimentellen Parameter sollte unsere Methode jedoch auf mehrere Bakterienarten und mehrere Klassen von Antibiotika anwendbar sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">SYTOX Green</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Invitrogen Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S7020</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Dead cell fluorescence stain</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">A9418-5G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Sodium Acetate</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S8750-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td dir="LTR" height="98" style="height:98px;width:195px;">Lysostaphin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Cell Sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">CRL309A</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 &#181;g/ml &#160;lysostaphin for storage&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Oxacillin salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">28221-1G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Mueller Hinton Broth</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">DF0757-17-6</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrixh</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S3014-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">1 ml, Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">14-823-2F</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">2 oz, Luer-lock syringe</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">309653 - 60 mL</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Overfill to ~65 ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Cambridge Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">9349</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">60X, Fluorescence/Phase contrast objective</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Olympus Corp.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Retiga 12-bit monochrome CCD camera</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">QImaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">RET-4000R-F-M-12-C&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope automation</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Shutters phase contrast/fluorescence</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H204/H202</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">X/Y Stage&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H107AENN</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Focus motor</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H122</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Joystick for XYZ control</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">CS152EF</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Proscan Controller</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H3-XY2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Image Acquisition Software</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Flow Cell Assembly and PDMS</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Flow Cell</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1044</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">Glass window</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1054</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:269px;">Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Edmund Optics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">NT48-543</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Sealing plate</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1045</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Epoxide glass slide</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Arrayit Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">SuperEpoxy 2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td dir="LTR" height="45" style="height:45px;width:329px;">PDMS master</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">PDMS slide design</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Tubing</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-644-03</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-657</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-255</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-259</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Fits Luer-lock adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">1520G</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-658</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stress-induced antibiotic susceptibility testing on a chip

Wir haben eine schnelle mikrofluidische Methode für Antibiotika-Empfindlichkeitstests in einer stressbasierten Umgebung entwickelt. Flüssigkeit wird mit hohen Geschwindigkeiten über Bakterien geleitet, die auf dem Boden eines mikrofluidischen Kanals immobilisiert werden. In Gegenwart von Stress und Antibiotika sterben anfällige Bakterienstämme schnell ab. Resistente Bakterien überleben diese belastenden Bedingungen jedoch. Die Hypothese hinter dieser Methode ist neu: Die Stressaktivierung biochemischer Wege, die Ziele von Antibiotika sind, kann Antibiotika-Empfindlichkeitstests beschleunigen. Im Vergleich zu Standard-Antibiotika-Empfindlichkeitstestmethoden wird der ratenbegrenzende Schritt - das Bakterienwachstum - bei der Anwendung von Antibiotika weggelassen. Die technische Umsetzung der Methode erfolgt in einer Kombination aus Standardtechniken und innovativen Ansätzen. Zu den Standardbestandteilen der Methode gehören bakterielle Kulturprotokolle, die Definition mikrofluidischer Kanäle in Polydimethylsiloxan (PDMS), die Überwachung der Zelllebensfähigkeit mit Fluoreszenz und die Batch-Bildverarbeitung für die Bakterienzählung. Innovative Teile der Methode sind in der Verwendung von Kulturmedienfluss für die mechanische Belastung Anwendung, Verwendung von Enzymen zu beschädigen, aber nicht töten die Bakterien, und die Verwendung von Mikroarray Substrate für die bakterielle Befestigung. Die entwickelte Plattform kann in der Entwicklung und Erprobung von antibiotika- und nichtantibiotikant verwandten Arzneimitteln eingesetzt werden. Im Vergleich zu den Standard-Bakteriensuspensionsexperimenten kann die Wirkung des Medikaments über kontrollierte Zeiträume wiederholt ein- und ausgeschaltet werden. Eine wiederholte Beobachtung der gleichen Bakterienpopulation ist im Laufe desselben Experiments möglich.

Die in Abbildung 4 dargestellten Daten zeigen die Reaktion eines anfälligen Staphylococcus aureus-Stamms im Laufe der Zeit in einem antibiotikahaltigen mikrofluidischen Kanal. Phasenkontrastbilder, die in 1 min und am Ende des 1-Stunden-Experiments aufgenommen wurden, sind in den Abbildungen 4A und Bdargestellt. Die analysierten 1-Stunden-Daten sind in Abbildung 4C mit den rot hervorgehobenen Bakterien (5.828 insgesamt) dargestellt. E...

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Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Wir haben eine mikrofluidische Plattform für schnelle Antibiotika-Empfindlichkeitstests entwickelt. Flüssigkeit wird mit hohen Geschwindigkeiten über Bakterien geleitet, die auf dem Boden eines mikrofluidischen Kanals immobilisiert werden. In Gegenwart von Stress und Antibiotika sterben anfällige Bakterienstämme schnell ab. Resistente Bakterien können diese belastenden Bedingungen jedoch überleben.

Stressinduzierte Antibiotika-Anfälligkeitstests auf einem Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

stress-induced-antibiotic-susceptibility-testing-on-a-chip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.3K Aufrufe.  Fraunhofer USA Center for Manufacturing Innovation. Wir haben eine mikrofluidische Plattform für schnelle Antibiotika-Empfindlichkeitstests entwickelt. Flüssigkeit wird mit hohen Geschwindigkeiten über Bakterien geleitet, die auf dem Boden eines mikrofluidischen Kanals immobilisiert werden. In Gegenwart von Stress und Antibiotika sterben anfällige Bakterienstämme schnell ab. Resistente Bakterien können diese belastenden Bedingungen jedoch überleben.

Serie: Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

Ohne Linsen auskommt, Fluoreszenz-Mikroskopie auf einem Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Forschung

Biotechnik

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical environment. During this process, mechanosensitive osteocytes regulate the opposing responses between the catabolic osteoclasts and anabolic osteoblasts. To better understand the highly intricate signaling pathways that regulate this process, our lab has developed a foundationary lab-on-a-chip (LOC) platform for analyzing functional outcomes (formation and resorption) of bone remodeling within a small scale system. As bone remodeling is a lengthy process that occurs on the order of weeks to months, we developed long-term cell culturing protocols within the system. Osteoblasts and osteoclasts were grown on functional activity substrates within the LOC and maintained for up to seven weeks. Afterward, chips were disassembled to allow for the quantification of bone formation and resorption. Additionally, we have designed a 3D printed mechanical loading device that pairs with the LOC platform and can be used to induce osteocyte mechanotransduction by deforming the cellular matrix. We have optimized cell culturing protocols for osteocytes, osteoblasts, and osteoclasts within the LOC platform and have addressed concerns of sterility and cytotoxicity. Here, we present the protocols for fabricating and sterilizing the LOC, seeding cells on functional substrates, inducing mechanical load, and disassembling the LOC to quantify endpoint results. We believe that these techniques lay the groundwork for developing a true organ-on-a-chip for bone remodeling.

Here, we present protocols for analyzing bone remodeling within a lab-on-a-chip platform. A 3D printed mechanical loading device can be paired with the platform to induce osteocyte mechanostransduction by deforming the cellular matrix. The platform can also be used to quantify bone remodeling functional outcomes from osteoclasts and osteoblasts (resorption/formation).

Eine Lab-On-A-Chip-Plattform zur Stimulierung der Osteozyten-Mechanotransduktion und zur Analyse der funktionellen Ergebnisse des Knochenumbaus

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, and chemoresistance. Although several in vitro models have been developed to study hypoxia-related cancer pathology, the complex interplay of the cancer microenvironment observed&#160;in vivo has not been reproduced yet owing to the lack of precise spatial control. Instead, 3D biofabrication approaches have been proposed to create microphysiological systems for better emulation of cancer ecology and accurate anticancer treatment evaluation. Herein, we propose a 3D cell-printing approach to fabricate a hypoxic cancer-on-a-chip. The hypoxia-inducing components in the chip were determined based on a computer simulation of the oxygen distribution. Cancer-stroma concentric rings were printed using bioinks containing glioblastoma cells and endothelial cells to recapitulate a type of solid cancer. The resulting chip realized central hypoxia and aggravated malignancy in cancer with the formation of representative pathophysiological markers. Overall, the proposed approach for creating a solid-cancer-mimetic microphysiological system is expected to bridge the gap between in vivo and in vitro models for cancer research.

Hypoxia is a hallmark of tumor microenvironment and plays a crucial role in cancer progression. This article describes the fabrication process of a hypoxic cancer-on-a-chip based on 3D cell-printing technology to recapitulate a hypoxia-related pathology of cancer.

3D-zellgedruckter hypoxischer Krebs-on-a-Chip zur Rekapitulation des pathologischen Verlaufs von solidem Krebs

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Generierung eines vereinfachten dreidimensionalen Skin-on-a-Chip-Modells in einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target joint disorders are mostly palliative. The unmet need for effective disease-modifying OA drugs (DMOADs) has been primarily caused by the absence of appropriate models for studying the disease mechanisms and testing potential DMOADs. Herein, we describe the establishment of a miniature synovial joint-mimicking microphysiological system (miniJoint) comprising adipose, fibrous, and osteochondral tissue components derived from human mesenchymal stem cells (MSCs). To obtain the three-dimensional (3D) microtissues, MSCs were encapsulated in photocrosslinkable methacrylated gelatin before or following differentiation. The cell-laden tissue constructs were then integrated into a 3D-printed bioreactor, forming the miniJoint. Separate flows of osteogenic, fibrogenic, and adipogenic media were introduced to maintain the respective tissue phenotypes. A commonly shared stream was perfused through the cartilage, synovial, and adipose tissues to enable tissue crosstalk. This flow pattern allows the induction of perturbations in one or more of the tissue components for mechanistic studies. Furthermore, potential DMOADs can be tested via either &#34;systemic administration&#34; through all the medium streams or &#34;intraarticular administration&#34; by adding the drugs to only the shared &#34;synovial fluid&#34;-simulating flow. Thus, the miniJoint can serve as a versatile in vitro platform for efficiently studying disease mechanisms and testing drugs in personalized medicine.

We provide detailed methods for generating four types of tissues from human mesenchymal stem cells, which are used to recapitulate the cartilage, bone, fat pad, and synovium in the human knee joint. These four tissues are integrated into a customized bioreactor and connected through microfluidics, thus generating a knee joint-on-a-chip.

Erstellung eines Kniegelenk-on-a-Chips zur Modellierung von Gelenkerkrankungen und zur Erprobung von Medikamenten

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...