O trabalho aqui relatado foi apoiada por doações da Auburn University AUDFS e USAF CRADA 07-277-60MDG-01. As opiniões expressas neste artigo são de responsabilidade dos autores e não refletem a política oficial ou a posição da Força Aérea dos EUA, Departamento de Defesa, ou do Governo dos EUA.

1. Ajustando o estágio <ol><li> Obter estirpe S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 e Bacillus subtilis ATCC 6051. Cepas resistentes à meticilina de S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13 de MRSA 26 de MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13.882, o fago lítico 12600. </li><li> Obter anticorpos de PBP 2a de pérolas de látex conjugadas. </li><li> Prepara NZY meio como descrito 21. </li><li> Obter uma solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Prepare água deionizada como subfase de Langmuir-Blodgett (LB) deposição monocamada. </li></ol> 2. Propagação bacteriófago e Titulação <ol><li> Incubar 5 ml de cultura de uma noite de S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 unidades formadoras de colónias (CFU) / ml) com 500 ul de fagos (3 x 10 9 &lt;/ Sup&gt; UFP / ml) em 500 ml de meio NZY em 2 L em agitador Flack-incubadora a 37 ° C durante a noite. </li><li> Centrifugar cultura em 4424 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Sobrenadante re-centrifugado a 11.325 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Filtrar o sobrenadante através de um filtro Millipore de 0,22. </li><li> Centrifugar o filtrado a 75.395 g durante 1,5 horas. </li><li> Dissolve-se o pellet em 100 ul de água destilada. </li><li> Preparar diluições de 10 vezes de suspensão de fagos em meio NZY. </li><li> Placa 1 ml de cultura overnight (ON) de S. aureus ATCC 12600 em cada uma das duas placas com agar NZY para certificar-se toda a superfície é coberta. Remover o excesso de cultura e deixe seca a superfície durante 30 minutos. </li><li> Manchar uma amostra (10 ul) da diluição de fago apropriado sobre a superfície da placa e incubar a 37 ° C durante 18-24 horas. </li><li> Examinar a formação de placas e calcular o título do fago. Os títulos de bacteriófagos (t) são calculadas na base da quantidade de pLaques (N) formada por 10 mL de volume (v), da suspensão de fagos e o factor de diluição (F). O título foi calculado pela fórmula:. T = N / (VXF) Por exemplo, para o número de placas de diluição de 75 a 10 -7 e o volume de 10 ul (10 -3 x 10 ml), a titulação é igual 75 / (10 x 10 x 10 -3 -7) = 7,5 x 10 10 unidades formadoras de placas (PFU) por ml de suspensão. </li></ol> 3. O fago imobilizado e ouro <ol><li> Limpeza peças de quartzo revestidos com ouro (60 mm 2) no plasma por gravura em atmosfera de árgon durante 10 min e, em seguida esterilizar por 6 horas sob luz UV num armário estéril. </li><li> Adicionar 50 microlitros de 1 x 10 9 UFP / ml de suspensão de fago com a superfície de ouro de cada peça numa placa de Petri estéril e incubar durante a noite numa câmara húmida à temperatura ambiente. </li><li> Remover e titule a suspensão de fagos restantes. </li><li> Lave as peças com fago ligado 5 vezes com PBS para remover desacopladofago. </li></ol> 4. Ensaio de infecciosidade do fago imobilizado sobre uma superfície seca <ol><li> Espalhe uma cultura de O / N de S. Aureus ATCC 12600 em uma placa de ágar NZY e permitir secagem. </li><li> Coloque um pedaço de ouro com fago imobilizada sobre a face da placa para baixo. </li><li> Observar uma zona de lise após 12 horas de incubação a 37 ° C que indica a infectividade. </li><li> Use peças cobertas de ouro sem fago em experimentos de controle. </li></ol> 5. Testes de atividade lítica de Phage livre e ligada em líquido <ol><li> Adicionar uma cultura ON da S. aureus ATCC 12600-10 ml de NZY em cada dos quatro balões de 300 ml sidearm (6 x 10 6 CFU / mL em cada frasco). </li><li> Adicionar Em dois frascos de 2 x 10 6 PFU / ml de fago livre. </li><li> Use os outros dois frascos como controles. </li><li> Monitorizar a evoluo no tempo de S. lise celular aureus para 570 min por medição da densidade óptica (DO 600) em intervalos de 30 min para todos os frascos.</li><li> Dê uma medição final às 24 horas. </li><li> Repita os passos de 5,1-5,5, mas usar peças de ouro com fagos ligados ao invés de fagos livres, e peças de ouro sem fago em frascos de controle. </li></ol> 6. Perda de fagos ligados durante a incubação <ol><li> Adicionar 50 ul de 1 x 10 9 UFP / ml de fago na superfície do pedaço de ouro estéril numa placa de Petri que está colocado numa câmara húmida durante a noite à temperatura ambiente. </li><li> Retirar a suspensão de fagos não ligados com a superfície de ouro e titulação. </li><li> Lava-se a peça de ouro com os fagos ligados cinco vezes com PBS e coloque em 1 ml de solução de NZY em tubo de 15 ml, agitador em incubadora a 37 ° C durante 8 horas. </li><li> Determinar o título do fago isolada como descrito em 2. </li></ol> 7. Fago Spheroids Preparação <ol><li> Combinando 400 ul de estoque de fago 12600 suspensão (10 11 UFP / ml) com um volume igual de clorofórmio espectrofotométrica grau em 1 ml frascoà temperatura ambiente. </li><li> Gentilmente vórtice a suspensão de fagos-clorofórmio 5-6 vezes (intervalos de 5 seg) ao longo de um minuto de duração. </li><li> Permitiu a suspensão para estabilizar por 30 segundos e, em seguida, pipeta da fase superior contendo esferóides foi pipetado off para a preparação monocamada. </li><li> Dedique alguns microlitros da suspensão esferóides para a transmissão e microscopia eletrônica de varredura. </li><li> Use uma suspensão esferóide restante para a fabricação de biossensores. </li></ol> 8. Preparação Biosensor <ol><li> Limpe os sensores QCM-D por plasma de gravura em argônio por 10 min PDC-32G Harrick limpo plasma. </li><li> Lavar o sensor com hexano para remover as impurezas orgânicas. </li><li> Preparar e limpar a calha do saldo filme conforme descrito em 22. </li><li> Preencha através LB com uma solução subfase e limpá-lo com uma barreira de cocho e estabilizar a calha a 20 ± 0,1 ° C </li><li> Espalhe aliquota de 300 ul de fago 12600 em suspensi aquosoem (10 11 PFU / ml) na subfase LB. </li><li> Prepare monocamada fago para solução subfase LB, permitindo que 300 mL alíquota de fago suspensão aquosa 12.600 (10 11 PFU / ml) de atropelar um bastão de vidro wettable inclinado que está parcialmente submerso na subfase 22,23. </li><li> Estabilizar a monocamada preparada durante 10 minutos e, em seguida comprimi-lo a uma velocidade de 30 mm / min (45 cm 2 / min), a uma pressão constante até que 19 N / m é atingido. </li><li> Executar uma película de deposição vertical sobre o sensor posicionado perpendicular QCM-D a uma velocidade de 4,5 mm / min por meio de imersão do sensor sucessivamente dentro e fora da monocamada de sete vezes. A microscopia electrónica de depositadas monocamadas de fagos antes da exposição a bactérias amostras mostrou que as camadas eram contínuos, homogéneo e uniforme (dados não mostrados). </li><li> Repita os passos de 4,5-4,8 com uma suspensão de esferóide fago que é preparada em 3. </li><li> Use biossensores fago fabricados para detecção de MRSA, o elétronA microscopia e elipsometria. </li></ol> 9. Teste Biosensor, Discriminação de resistente à meticilina e bactérias Staphylococcus sensíveis <ol><li> Neste protocolo, biossensores com fago não modificada e modificada e esferóides fago estão preparados. Um microbalança de cristal de quartzo, com quatro câmaras de fluxo do sensor é usado para monitorar a ligação de bactérias para o fago imobilizados na superfície do sensor de QCM. PBP 2a de pérolas de látex de anticorpos conjugados são utilizados para discriminar entre resistente à meticilina (MRSA), estafilococos e bactérias sensíveis. Todas as medições são realizadas em modo de fluxo (50 ul / min) a 5 MHz. </li><li> Estabelecer uma freqüência de ressonância linha de base do sensor QCM em água (~ 30 min). </li><li> Desenhar uma suspensão das células vivas de estafilococos sensíveis à meticilina bacterianas em água (10 9 CFU / ml) através da célula de teste. </li><li> Monitorar continuamente as mudanças na freqüência de ressonância sensores e dissipação de energia para o primeiro harmônico, using o software Q-Soft. </li><li> Quando as mudanças na freqüência de ressonância sensores e dissipação atingiu níveis de saturação, adicionar a suspensão de esferas de látex PBP anticorpos conjugados (6,77 x10 10 contas / ml) para o fluxo durante o monitoramento contínuo da freqüência e dissipação. </li><li> Repita os passos de 9,2-9,5 para células de bactérias estafilococos resistentes à meticilina (MRSA). </li><li> Definir uma mudança de frequência através da variação da massa, devido à ligação de pelo Sauerbrey 24,25 equação Af =-Dm xn / C, onde C é a sensibilidade de uma massa constante (C = 17,7 ng x cm x Hz -2 -1 de 5 MHz, bactérias ), m é a massa e o símbolo n representa o número harmónico (n = 1). </li><li> Definir uma mudança de dissipação de energia (Δ D) a partir da gravação do decaimento exponencial de oscilação (frequência e amplitude de amortecimento, que permitiu a quantificação da energia dissipada e armazenadas durante um período de oscilação,E e E dissipada armazenados, respectivamente: D = E Δ dissipada / 2 πE armazenado. Δ D é medido em unidades de dissipação (DU), um DU = 10 -6 unidades relativas). </li></ol>

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	<li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+detection+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+using+lytic+phage+probes.">Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).</li><li>Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+identification+of+methicillin+resistant+and+sensitive+strains+of+Staphylococcus+aureus+using+tandem+measurements.">Detection and identification of methicillin resistant and sensitive strains of Staphylococcus aureus using tandem measurements.</a> J. Microbiol. 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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

É bem sabido que os fagos podem ser usados ​​como sondas de biossensor para 28 agentes patogénicos bacterianos. Foi demonstrado neste trabalho que, juntamente com os anticorpos de fago PBP 2a podem ser utilizadas para resolver o problema antigo: discriminação estirpes resistentes e sensíveis a antibióticos rápidos. Verificou-se no entanto os fagos não modificados estafilocócicas normais não são adequados para a detecção de bactérias com dispositivos QCM, embora e...

Cepas resistentes de Staphylococcus aureus meticilina têm sido apontados como um fator essencial nas infecções e surtos nosocomiais 4-8. Formas comuns de reconhecimento de resistência à meticilina, tais como o ensaio de difusão em disco de agar oxacilina tela ou de microdiluição em caldo, dependem das condições de cultivo adaptadas para aumentar a expressão da resistência. As alterações incluem a utilização de oxacilina, incubação a 30 ou 35 ° C em vez de 37 ° C, e a inclusão de NaCl ao meio de crescimento. Além disso, para a detecção correcta por estes tipos de técnicas, um longo período de incubação de 24 horas em vez de 16 a 18 horas é necessário. Técnicas rápidos com o nível adequado (&gt; 96%) de sensibilidade para a identificação da resistência à meticilina incluem técnicas de microdiluição automatizados tais como o GPS Vitek-SA cartão, o sistema rápido de ATB estafilococo, e o sistema de painel Microscan rápida que produzem resultados após 3-11 hr 9-11. The Crystal MA RSA é um sistema de identificação de método rápido baseado no reconhecimento de crescimento de S. aureus na presença de 2% de NaCl e 4 mg de oxacilina por litro, com um sensor de fluorescência sensíveis ao oxigénio. Sensibilidades reivindicados variam entre 91 a 100% após 4 horas de incubação 12-14. Estes métodos fenotípicos estão limitados nas suas precisões pelo impacto de estirpes prevalentes que expressam resistência heterogénea. Portanto, os métodos mais amplamente aceito para o reconhecimento da resistência à meticilina é PCR ou hibridização DNA do gene mecA 15. No entanto, esta técnica requer que o ADN purificado e é extremamente sensível a vários aditivos (impurezas), que incluem fragmentos de células 16. Além disso, estas técnicas de precisar de um tempo para executar. Estratégias para o reconhecimento do produto do gene mecA, a proteína PBP 2a, pode ser utilizado para determinar a resistência e podem ser mais fiáveis ​​em comparação com as técnicas de ensaio padrão 17. de Staphylococcus aureus, incluindo aqueles que têm resistência à meticilina 1,2,18. Neste trabalho, proposta uma nova técnica para o reconhecimento específico e detecção de MRSA, tais como o reconhecimento de bactéria juntamente com a conformação de MRSA em tempo real. Para este fim específico a S. bacteriófago aureus com um amplo espectro de hospedeiros (incluindo MRSA), combinada com o anticorpo monoclonal contra a proteína (PBP 2as) têm sido utilizados. PBP 2a é uma proteína de parede celular, e é a causa de resistividade antibiótico de MRSA. No entanto anticorpo PBP 2a não é específico para S. aureus, uma vez que algumas bactérias possuem outras proteínas de ligação aos antibióticos com similaridade de sequência com o PBP 2a 19,20. Por conseguinte, neste trabalho, S. bacteriófago aureus e anticorpos contra a proteína PBP 2a têm sido utilizados. Para ser capaz de desenvolver um biossensor para especificamente detectar e identificar SARM um dispositivo com uma acção em dois passos foi utilizado. O passo inicial usou um S. aureus bacteriófago monocamada como uma sonda de sensor, enquanto que o segundo passo de PBP 2a empregues anticorpos específicos. Portanto, o primeiro passo será reconhecer S. bactéria Staphylococcus, como o outro irá ser sensível à proteína de ligação ao antibiótico. Quando os sinais recebidos a partir de dois passos são positivas, isso indica a detecção específica de MRSA.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) </td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P4417 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>spectrophotometric-grade chloroform </td>
			<td>Sigma-Aldrich, 
				St. Louis, MO </td>
			<td>154733 </td>
			<td>(99.8% A.C.S.) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hexane-Anhydrous </td>
			<td>Sigma-Aldrich, 
				St. Louis, MO</td>
			<td>29609-0</td>
			<td>(95%)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethyl Alcohol </td>
			<td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT </td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>190 Proof</td>
		 </tr>	
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBP 2a antibody conjugated latex beads</td>
			<td>Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>The MRSA-Screen test</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from </td>
			<td>American Type Culture Collection (Manassas, VA);</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 </td>
			<td>The culture collection of Auburn University, Auburn, AL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K
				Ultra Centrifuge</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>KSV 2200 LB film balance</td>
			<td>KSV Chemicals, Finland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Light microscope optical system </td>
			<td>CitoViva Technology Inc., Auburn, AL </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>QCM-D</td>
			<td>Q-Sense AB, V&auml;stra Fr&ouml;lunda, Sweden </td>
			<td>E4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scanning electron microscope (SEM)</td>
			<td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td>
			<td>JEOL-7000F SEM </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmitting electron microscopy (TEM)</td>
			<td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td>
			<td>JEOL, JEM 2010 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stericup, Presterilized</td>
			<td>Millipore Corporation, Billerica, MA</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>0.22 &mu;m, GP Express PLUS membrane</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bio-Assay dish</td>
			<td>NUNC A/S, Denmark</td>
			<td>240835</td>
			<td>Dimensions(mm), 245 x 245 x 25</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson, Pipetman, France</td>
			<td>P100, P200, P1000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>C24 Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, CT</td>
			<td>Classic C24</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gold-coated quartz pieces</td>
			<td>Auburn University, AL</td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Brand, USA</td>
			<td>0875713</td>
			<td>100 mmX15 mm </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SterilGard III Advance</td>
			<td>The Baker Company, ME</td>
			<td>SG403</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Culture Growing Flasks</td>
			<td>Corning Incorporated, NY</td>
			<td>4995</td>
			<td>PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optical Spectrometer</td>
			<td>Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.</td>
			<td>4001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, USA</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Millipore water purification system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Direct-Q</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Ellipsometer</td>
			<td>Accurion, USA</td>
			<td>nanofilm_ep3se
			</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software </td>
			<td>Q-Sense AB, Sweden</td>
			<td>QSoft, QTools</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

biosensor for detection of antibiotic resistant staphylococcus bacteria

Um bacteriófago lítico estruturalmente transformadas tendo uma ampla gama de hospedeiros de estirpes de Staphylococcus aureus e uma proteína de ligação à penicilina (PBP 2A) contas de látex de anticorpos conjugados têm sido utilizados para criar um biossensor para a discriminação concebido resistente à meticilina (MRSA) e sensível (MSSA) S . espécies aureus 1,2. Os fagos foram convertidos em esferóides fago pelo contato com a interface água-clorofórmio. Fago monocamadas esferóides foram movidos para uma superfície de biosensor por Langmuir-Blodgett (LB) técnica 3. Os biossensores criados foram examinados por uma microbalança de cristal de quartzo com dissipação de rastreamento (QCM-D) para avaliar as interações bactéria-fago. Interações bactéria-esferóides levou a freqüência de ressonância reduzida e um aumento na dissipação de energia, tanto para MRSA e MSSA isolados. Após a ligação de bactérias, esses sensores têm sido ainda mais exposto ao anticorpo a proteína de ligação à penicilina esférula de látexs. Sensores analisados ​​com MRSA respondeu a PBP 2a contas de anticorpos, embora sensores inspecionados com MSSA não deu nenhuma resposta. Esta distinção experimental determina uma discriminação clara entre resistente à meticilina e S. sensível aureus. Igualmente vinculados e bacteriófagos não ligados suprimir o crescimento de bactérias nas superfícies e em suspensões de água. Uma vez fagos são transformados em esferóides, eles mantêm a sua atividade lítica forte e mostram alta capacidade de captação bacteriana. O fago e o fago esferóides pode ser utilizado para teste e de esterilização de microorganismos resistentes aos antibióticos. Outras aplicações podem incluir a utilização em terapia de bacteriófago e superfícies antimicrobianas.

O fago demonstrou atividade lítica contra todas as cepas testadas de S. aureus, incluindo as estirpes MRSA, como indicado pelo teste de mancha de fago. Tamanhos de placas geralmente variou de 5 a 15 mm. Sem atividade foi encontrada contra outras culturas-teste (Tabela 1). Um crescimento normal de S. aureus ATCC 12600 em meio NZY em agitador-incubadora a 37 ° C é mostrada na Figura 1A (uma curva marcados por círculos vazios). O número d...

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Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Biossensores fagos líticos e contas de anticorpos são capazes de discriminar entre resistente à meticilina (MRSA) e bactérias estafilococos sensíveis. Os fagos foram imobilizadas por um método de Langmuir-Blodgett sobre uma superfície de um sensor de microbalança de cristal de quartzo e trabalhado como de largo espectro de estafilococos sondas. Contas de anticorpos reconhecer MRSA.

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

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Bioengineering

23.9K visualizações.  Auburn University. Biossensores fagos líticos e contas de anticorpos são capazes de discriminar entre resistente à meticilina (MRSA) e bactérias estafilococos sensíveis. Os fagos foram imobilizadas por um método de Langmuir-Blodgett sobre uma superfície de um sensor de microbalança de cristal de quartzo e trabalhado como de largo espectro de estafilococos sondas. Contas de anticorpos reconhecer MRSA.