Die Arbeit hier berichtet wird, wurde durch Zuschüsse von der Auburn University und AUDFS USAF CRADA 07-277-60MDG-01 unterstützt. Die in diesem Artikel sind die der Autoren und spiegeln nicht die offizielle Politik oder Position der United States Air Force, Department of Defense, oder die US-Regierung.

1. Einstellen der Stage <ol><li> Erhalten Typstamm S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 und Bacillus subtilis ATCC 6051. Methicillin-resistente Stämme von S. aureus - MRSA1, MRSA 2, 5 MRSA, MRSA 13, 26 MRSA, MRSA 34, 45 MRSA, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Das lytische Phagen 12600. </li><li> Erhalten PBP 2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen. </li><li> Bereiten NZY Medium wie beschrieben 21. </li><li> Erhalten Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Bereiten VE-Wasser als Subphase für Langmuir-Blodgett (LB)-Monoschicht Abscheidung. </li></ol> 2. Bakteriophagen Vermehrung und Titration <ol><li> Inkubieren 5 ml Übernachtkultur von S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 8 Kolonie bildenden Einheiten (KBE) / ml) mit 500 ul Phagen (3 x 10 9 &lt;/ Sup&gt; PFU / ml) in 500 ml Medium in NZY 2 L Flack auf Schüttler-Inkubator bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Zentrifuge bei 4.424 xg Kultur für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Re zentrifugierten Überstand bei 11.325 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Filter Überstand durch ein 0,22 um Millipore-Filter. </li><li> Das Filtrat bei 75.395 xg für 1,5 Stunden. </li><li> Anschließend das Pellet in 100 ul destilliertem Wasser. </li><li> Bereiten 10fache Verdünnungen von Phagensuspension in NZY Medium. </li><li> Plate 1 ml über Nacht (ON) Kultur von S. aureus ATCC 12600 auf je 2 Platten mit NZY Agar sicherstellen, dass alle Oberfläche bedeckt ist. Entfernen Sie den Überschuss an Kultur und lassen die Oberfläche trocken für 30 min. </li><li> Spot eine Probe (10 ul) geeigneter Phagenverdünnung auf die Oberfläche der Platte und Inkubation bei 37 ° C für 18-24 Std. </li><li> Untersuchen Sie die Bildung von Plaques und die Berechnung der Phagentiter. Bakteriophagen-Titer (T) auf der Grundlage der Anzahl von p geschätztLaques (N) je 10 ul Volumen (V) des Phagen Suspension und der Verdünnungsfaktor (F) gebildet ist. . T = N / (vxf) Beispiel für die Anzahl der Plaques 75 bei der Verdünnung 10 -7 und das Volumen 10 ul (10 x 10 -3 ml), ist der Titer gleich 75 /: Der Titer wurde durch Formel (10 x 10 -3 x 10 -7) = 7,5 x 10 10 Plaque-bildende Einheiten (PFU) pro ml Suspension. </li></ol> 3. Gold-immobilisierten Phagen <ol><li> Saubere goldbeschichteten Quarz Stück (60 mm 2) durch Plasma-Ätzen in Argon für 10 min und dann für 6 Stunden sterilisieren unter UV-Licht in einem sterilen Gehäuse. </li><li> In 50 Mikroliter von 1 x 10 9 PFU / ml Phagensuspension an die Goldoberfläche jedes Stückes in eine sterile Petrischale, und dann Inkubation über Nacht in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen und die restlichen titrieren Phagensuspension. </li><li> Waschen Stücke mit gebundenen Phagen 5 mal mit PBS, um ungebundene entfernenPhagen. </li></ol> 4. Testen von immobilisiertem Phageninfektiosität auf eine trockene Oberfläche <ol><li> Verbreiten Sie eine O / N-Kultur von S. Aureus ATCC 12600 auf eine NZY Agarplatte und trocknen lassen. </li><li> Legen Sie ein Goldstück mit immobilisierten Phagen auf die Platte nach unten. </li><li> Beobachten einer Zone der Lyse nach 12-stündiger Inkubation bei 37 ° C, die angibt Infektiosität. </li><li> Mit Gold bedeckt Stücke ohne Phagen in Kontrollversuche. </li></ol> 5. Prüfung der lytischen Aktivität der freien und gebundenen Phagen in Liquid <ol><li> Hinzufügen eines ON Kultur von S. aureus ATCC 12600 bis 10 ml NZY in jeder von vier 300 ml-Kolben Seitenarm (6 x 10 6 CFU / ml in jeden Kolben). </li><li> Hinzufügen In zwei Kolben 2 x 10 6 PFU / ml des freien Phagen. </li><li> Mit den beiden anderen Kolben als Kontrollen. </li><li> Überwachen Sie den zeitlichen Verlauf der S. aureus Zelllyse für 570 min durch Messung der optischen Dichte (OD 600) bei 30 min-Takt für alle Flaschen.</li><li> Nehmen Sie eine abschließende Messung nach 24 Stunden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.5, sondern verwenden Sie Goldstücke mit gebundenen Phagen anstelle des freien Phagen und Goldstücke ohne Phagen in Kontrolle Kolben. </li></ol> 6. Der Verlust der gebundenen Phagen während der Inkubation <ol><li> In 50 ul 1 x 10 9 PFU / ml Phagen auf der Oberfläche von sterilen Goldstück in einer Petrischale, die in einer feuchten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur gelegt wird. </li><li> Entfernen Sie die Suspension mit ungebundenen Phagen aus der Goldoberfläche und Titer. </li><li> Waschen Sie das Goldstück mit gebundenen Phagen 5 mal mit PBS und in 1 ml NZY Lösung in 15 ml Tube im Shaker-Inkubator bei 37 ° C für 8 Stunden. </li><li> Bestimmen Sie den Titer der abgelösten Phagen wie in 2 beschrieben. </li></ol> 7. Phagen Spheroids Vorbereitung <ol><li> Die Kombination 400 ul stock Phagen 12600 Suspension (10 11 PFU / ml) mit einem gleichen Volumen Chloroform spektrophotometrische Grad in 1 ml Fläschchenbei Raumtemperatur. </li><li> Vortexen die Phagen-Chloroform Suspension 5-6 mal (5 Sekunden-Intervallen) über eine Minute Dauer. </li><li> Erlaubt die Suspension für 30 sec stabilisieren und dann Pipettieren der oberen Phase, die Sphäroide off wurde Monolayer pipettiert. </li><li> Nehmen Sie ein paar Mikroliter der Sphäroide Suspension für die Übertragung und der Rasterelektronenmikroskopie. </li><li> Verwenden Sie einen verbleibenden Sphäroid Aufhängung für Biosensor Fertigung. </li></ol> 8. Biosensor Vorbereitung <ol><li> Saubere QCM-D-Sensoren durch Plasma-Ätzen in Argon für 10 min PDC-32G Harrick Plasma cleaner. </li><li> Spülen Sensor mit Hexan keine organischen Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> Vorbereiten und reinigen einen Trog des Films Gleichgewicht wie in 22 beschrieben. </li><li> Füllen LB Trog mit einer Subphase Lösung und reinigen Sie ihn mit einem Trog Barriere und stabilisieren die Mulde bei 20 ± 0,1 ° C </li><li> Verbreiten Sie 300 ul Aliquot des Phagen 12600 in wässrigen Susauf (10 11 PFU / ml) auf LB Subphase. </li><li> Bereiten Phagen Monoschicht auf LB Subphase Lösung, indem 300 ul Aliquots des Phagen 12600 wässrigen Suspension (10 11 PFU / ml) abzulaufen eine geneigte benetzbaren Glasstab, der teilweise in die Subphase 22,23 eingetaucht ist. </li><li> Stabilisieren Sie die vorbereiteten Monoschicht für 10 min und dann komprimieren mit einer Geschwindigkeit von 30 mm / min (45 cm 2 / min), bis ein konstanter Druck 19 N / m erreicht wird. </li><li> Führen einer vertikalen Schichtabscheidung auf senkrecht positioniert QCM-D-Sensor mit einer Geschwindigkeit von 4,5 mm / min durch aufeinanderfolgendes Eintauchen Sensor in die und aus der Monoschicht siebenmal. Elektronenmikroskopie abgeschieden Phagen Monoschichten vor der Exposition gegenüber bakteriellen Proben zeigten, daß die Schichten kontinuierliche, homogene und einheitliche (Daten nicht gezeigt) waren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,8 mit einem Phagen Sphäroid Suspension in 3 hergestellt wird. </li><li> Verwenden hergestellt Phagen Biosensoren für die MRSA-Erkennung, ElektronenMikroskopie und Ellipsometrie. </li></ol> 9. Biosensor Testing, Diskriminierung von Methicillin-resistenten Staphylococcus Bakterien und Sensitive <ol><li> In diesem Protokoll werden Biosensoren mit unmodifizierten und modifizierten Phagen und Phagen-Kügelchen hergestellt. Quarzkristall-Mikrowaage mit vier Sensor Strömungskammern dient zur Überwachung Bindung von Bakterien an die Phagen auf QCM Sensoroberfläche immobilisiert. PBP 2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen werden verwendet, um zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Alle Messungen werden in der Flow-Modus (50 ml / min) bei 5 MHz durchgeführt. </li><li> Stellen Sie eine Basislinie Resonanzfrequenz der QCM Sensor in Wasser (~ 30 min). </li><li> Zeichnen einer Suspension lebender Methicillin sensitive Staphylococcus Bakterienzellen in Wasser (10 9 CFU / ml) durch die Testzelle. </li><li> Kontinuierliche Überwachung Änderungen in der Resonanzfrequenz und Sensoren Energiedissipation zum ersten Oberton, using der Q-Soft Software. </li><li> Wenn die Änderungen in der Resonanzfrequenz Sensoren und Dissipation Sättigung erreicht, fügen Sie die Aussetzung der PBP-Antikörper, konjugiert Latexkügelchen (6,77 x10 10 Perlen / ml) auf die Strömung während der kontinuierlichen Überwachung von Frequenz und Verlustleistung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 9,2-9,5 für Methicillin-resistenten Staphylococcus Bakterienzellen (MRSA). </li><li> Definieren Sie einen Frequenzwechsel durch die Masse Änderung durch Bakterien-Bindung durch die Sauerbrey-Gleichung Af = 24,25-Dm xn / C, wobei C die Masse Empfindlichkeit konstant (C = 17,7 ng x cm -2 x Hz -1 bei 5 MHz ) m Masse und n die Anzahl Oberton (n = 1). </li><li> Definieren einer Energiedissipation Änderung (Δ D) von der Aufnahme der exponentiellen Abklingen der Schwingung (Frequenz und Amplitude dämpft, welche erlaubt die Quantifizierung der Energie abgeführt und während einer Periode der Oszillation gespeichert,E abgeführt und E jeweils gespeichert: Δ D = E abgeführt / 2 πE gespeichert. Δ D ist in Verlustleistung Einheiten (DU), eine DU = 10 -6 relative Einheiten) gemessen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Es ist bekannt, dass Phagen als Biosensor Sonden für bakterielle Erreger 28 verwendet werden. Es wird in dieser Arbeit gezeigt, dass Phagen zusammen mit PBP 2a Antikörper genutzt werden, um das alte Problem zu lösen: schnelle Diskriminierung antibiotikaresistenten und empfindliche Stämme. Es wurde gefunden, jedoch diese normale unveränderte Staphylokokken Phagen nicht geeignet sind für Bakterien Detektion mit QCM Geräte, obwohl sie Bakterien binden. Die Phagen-Schwanz ist s...

Methicillin-resistente Stämme von Staphylococcus aureus haben als ein Faktor in wesentlichen Infektionen und nosokomiale Ausbrüche 4-8 vorgeschlagen worden. Gemeinsame Wege der Anerkennung von Methicillin-Resistenz, wie die Scheibe Diffusion Oxacillin Agar Probeaufnahmen oder Bouillonmikrodilutions auf maßgeschneiderte Kulturbedingungen verlassen, um den Ausdruck des Widerstands zu verbessern. Änderungen umfassen die Verwendung von Oxacillin, Inkubation bei 30 oder 35 ° C statt 37 ° C, und die Aufnahme von NaCl zu dem Wachstumsmedium. Weiterhin für korrekte Erkennung durch diese Art von Techniken, eine lange Inkubationszeit von 24 h statt 16 bis 18 h erforderlich. Schnelle Techniken mit entsprechenden (&gt; 96%) Empfindlichkeit für die Identifizierung von Methicillin-Resistenz sind automatisierte microdilution Techniken wie die Vitek GPS-SA-Karte, die Rapid-ATB Staph-System und Rapid Microscan Systemsteuerung System, Ergebnisse zu produzieren nach 3-11 h 9-11. The Crystal MRSA ID-System ist ein schnelles Verfahren auf Anerkennung des Wachstums von S. basierend aureus in Gegenwart von 2% NaCl und 4 mg Oxacillin pro Liter mit einem Sauerstoff-sensitive Fluoreszenz-Sensor. Beansprucht Empfindlichkeiten im Bereich zwischen 91 bis 100% nach 4 h Inkubation 12-14. Diese phänotypische Methoden sind in ihrer Genauigkeit durch die Auswirkungen der herrschenden Stämme, die heterogene Widerstand auszudrücken begrenzt. Daher ist die beste weithin akzeptierte Verfahren für die Anerkennung von Methicillin-Resistenz PCR oder DNA-Hybridisierung des mecA Gens 15. Allerdings erfordert diese Technik gereinigt DNA und ist äußerst empfindlich gegenüber verschiedenen Beimischungen (Verunreinigungen), die Zelltrümmer 16 umfassen. Darüber hinaus müssen diese Verfahren eine lange Zeit durchzuführen. Strategien, um die Anerkennung des mecA Genprodukt Protein PBP 2a, könnte genutzt werden, um den Widerstand zu bestimmen und kann zuverlässiger im Vergleich zu Standard-Test-Techniken 17. Staphylococcus aureus-Stämme, einschließlich solche, die Methicillin-Resistenz 1,2,18 verwendet werden. In dieser Arbeit haben wir vorgeschlagen, eine neue Technik in der spezifischen Erkennung und Erkennung von MRSA, wie die Anerkennung von Bakterien zusammen mit Konformation von MRSA in Echtzeit. Für diesen speziellen Zweck ein S. aureus Bakteriophagen mit einem breiten Wirtsspektrum (einschließlich MRSA) mit einem monoklonalen Antikörper gegen Protein kombiniert (PBP 2a) verwendet wurden. PBP 2a eine Zellwandprotein und ist die Ursache von antibiotischen Widerstand von MRSA. Allerdings PBP 2a Antikörper ist nicht spezifisch für S. aureus seit einigen anderen Bakterien Antibiotika-bindende Proteine ​​mit Sequenzähnlichkeit zu PBP 2a 19,20. Folglich in dieser Arbeit, S. aureus Bakteriophagen und Antikörper gegen PBP 2a Protein verwendet wurden. Um einen Biosensor zu entwickeln spezielltisch erkennen und zu identifizieren MRSA Ein Gerät mit einem zwei Schritten genutzt wurde. Der erste Schritt verwendet ein S. aureus Bakteriophagen Monoschicht als Sensor-Sonde, während der zweite Schritt PBP 2a spezifischen Antikörpern verwendet. Daher Schritt wird man erkennen, S. aureus Bakterien, als der andere empfindlich gegen das Antibiotikum-Bindungsprotein. Wenn Signale von zwei Schritten erhalten positiv sind, gibt es den spezifischen Nachweis von MRSA.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) </td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>P4417 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>spectrophotometric-grade chloroform </td>
			<td>Sigma-Aldrich, 
				St. Louis, MO </td>
			<td>154733 </td>
			<td>(99.8% A.C.S.) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hexane-Anhydrous </td>
			<td>Sigma-Aldrich, 
				St. Louis, MO</td>
			<td>29609-0</td>
			<td>(95%)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethyl Alcohol </td>
			<td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT </td>
			<td>64-17-5</td>
			<td>190 Proof</td>
		 </tr>	
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBP 2a antibody conjugated latex beads</td>
			<td>Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan</td>
			<td>The MRSA-Screen test</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from </td>
			<td>American Type Culture Collection (Manassas, VA);</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 </td>
			<td>The culture collection of Auburn University, Auburn, AL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-90K
				Ultra Centrifuge</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>KSV 2200 LB film balance</td>
			<td>KSV Chemicals, Finland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Light microscope optical system </td>
			<td>CitoViva Technology Inc., Auburn, AL </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>QCM-D</td>
			<td>Q-Sense AB, V&auml;stra Fr&ouml;lunda, Sweden </td>
			<td>E4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scanning electron microscope (SEM)</td>
			<td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td>
			<td>JEOL-7000F SEM </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmitting electron microscopy (TEM)</td>
			<td>JEOL USA Inc., Peabody, MA</td>
			<td>JEOL, JEM 2010 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stericup, Presterilized</td>
			<td>Millipore Corporation, Billerica, MA</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>0.22 &mu;m, GP Express PLUS membrane</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bio-Assay dish</td>
			<td>NUNC A/S, Denmark</td>
			<td>240835</td>
			<td>Dimensions(mm), 245 x 245 x 25</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson, Pipetman, France</td>
			<td>P100, P200, P1000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>C24 Incubator Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific, CT</td>
			<td>Classic C24</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gold-coated quartz pieces</td>
			<td>Auburn University, AL</td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Brand, USA</td>
			<td>0875713</td>
			<td>100 mmX15 mm </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SterilGard III Advance</td>
			<td>The Baker Company, ME</td>
			<td>SG403</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Culture Growing Flasks</td>
			<td>Corning Incorporated, NY</td>
			<td>4995</td>
			<td>PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optical Spectrometer</td>
			<td>Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.</td>
			<td>4001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma, USA</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Millipore water purification system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Direct-Q</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Ellipsometer</td>
			<td>Accurion, USA</td>
			<td>nanofilm_ep3se
			</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software </td>
			<td>Q-Sense AB, Sweden</td>
			<td>QSoft, QTools</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

biosensor for detection of antibiotic resistant staphylococcus bacteria

Eine konstruktiv transformiert lytischen Bakteriophagen mit einem breiten Wirtsbereich von Staphylococcus aureus und Penicillin-Bindungsprotein (PBP 2a)-Antikörper, konjugiert Latex-Kügelchen wurden verwendet, um einen Biosensor zur Diskriminierung von Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindlich (MSSA) S ausgelegt zu erstellen . aureus Arten 1,2. Die lytische Phagen in Phagen Sphäroide wurde durch Kontakt mit Wasser-Chloroform-Schnittstelle umgewandelt. Phagen Sphäroid Monoschichten haben auf einem Biosensor Oberfläche wurde durch Langmuir-Blodgett (LB)-Technik 3 bewegt. Die angelegten Biosensoren nach einem Quarzkristall mit Dissipationsmessung Verfolgung (QCM-D), um Bakterien-Phagen-Wechselwirkungen auswerten untersucht. Bakterien-Sphäroid Wechselwirkungen zu reduzierten Resonanzfrequenz und einem Anstieg in Dissipationsenergie sowohl für MRSA und MSSA Stämmen führte. Nach der bakteriellen Bindung haben diese Sensoren wurde weiter auf die Penicillin-bindende Protein Antikörper Latexperle ausgesetzts. Sensoren mit MRSA untersucht reagierte auf 2a Antikörper Perlen PBP, obwohl Sensoren mit MSSA inspiziert gab keine Antwort. Diese experimentelle Unterscheidung bestimmt eine eindeutige Unterscheidung zwischen Methicillin-resistenten und sensiblen S. aureus-Stämme. Ebenso gebundenen und ungebundenen Bakteriophagen unterdrücken das Wachstum von Bakterien auf Oberflächen und in Wasser-Suspensionen. Sobald lytischen Phagen in Sphäroide geändert werden, behalten sie ihre starke lytische Aktivität und zeigen eine hohe bakterielle Capture-Funktion. Die Phagen und Phagen Sphäroide können für die Prüfung und Sterilisation von Antibiotika-resistenten Mikroorganismen verwendet werden. Andere Anwendungen können die Verwendung in Bakteriophagen-Therapie und antimikrobielle Oberflächen.

Die Phagen zeigte lytische Aktivität gegen alle getesteten Stämme von S. aureus, einschließlich MRSA-Stämme, wie die Phagen-Spot-Test angegeben. Plaque Größen Regel reichten von 5 bis 15 mm. Wurde keine Aktivität gegen andere Test-Kulturen (Tabelle 1). Ein normales Wachstum von S. aureus ATCC 12600 in NZY Mediums auf Schüttler-Inkubator bei 37 ° C ist in Abbildung 1A (eine Kurve durch leere Kreise gekennzeichnet) gezeigt. Die Anzah...

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Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Lytic Phagen Biosensoren und Antikörper Perlen sind in der Lage, zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Die Phagen wurden durch ein Langmuir-Blodgett-Technik auf einer Oberfläche einer Quarzkristall-Mikrowaage Sensor immobilisiert und arbeitete als breites Staphylococcus Sonden. Antikörper erkennen Perlen MRSA.

Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

biosensor-for-detection-antibiotic-resistant-staphylococcus

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.9K Aufrufe.  Auburn University. Lytic Phagen Biosensoren und Antikörper Perlen sind in der Lage, zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Die Phagen wurden durch ein Langmuir-Blodgett-Technik auf einer Oberfläche einer Quarzkristall-Mikrowaage Sensor immobilisiert und arbeitete als breites Staphylococcus Sonden. Antikörper erkennen Perlen MRSA.

Serie: Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

Herstellung von Kohlenstoff-Nanoröhrchen Hochfrequenztechnik Nanoelectronic Biosensor für Sensing in hoher Ionenstärke Lösungen

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Forschung

Biotechnik

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

Stressinduzierte Antibiotika-Anfälligkeitstests auf einem Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Hochdurchsatz-Identifizierung von Bakterien abstoßenden Polymere für medizinische Geräte

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

Die Verwendung eines β-Lactamase-basierte Conductimetric Biosensor-Assays, biomolekulare Wechselwirkungen zu erkennen

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

Biosensor-basierte Hochdurchsatz-Biopanning- und Bioinformatik-Analysestrategie zur globalen Validierung von Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Proteinen

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to develop practical technologies that couple microscopic cell screening with cell isolation at high purity for downstream genetic analysis. Here, the use of photodegradable poly(ethylene glycol) hydrogels for screening and isolation of bacteria with unique growth phenotypes from heterogeneous cell populations is described. The method relies on encapsulating or entrapping cells with the hydrogel, followed by culture, microscopic screening, then use of a high-resolution light patterning tool for spatiotemporal control of hydrogel degradation and release of selected cells into a solution for retrieval. Applying different light patterns allows for control over the morphology of the extracted cell, and patterns such as rings or crosses can be used to retrieve cells with minimal direct UV light exposure to mitigate DNA damage to the isolates. Moreover, the light patterning tool delivers an adjustable light dose to achieve various degradation and cell release rates. It allows for degradation at high resolution, enabling cell retrieval with micron-scale spatial precision. Here, the use of this material to screen and retrieve bacteria from both bulk hydrogels and microfabricated lab-on-a-chip devices is demonstrated. The method is inexpensive, simple, and can be used for common and emerging applications in microbiology, including isolation of bacterial strains with rare growth profiles from mutant libraries and isolation of bacterial consortia with emergent phenotypes for genomic characterizations.

The use of photodegradable hydrogels to isolate bacterial cells by utilizing a high-resolution light pattering tool is reported. Essential experimental procedures, results, and advantages of the process are reviewed. The method enables rapid and inexpensive isolation of targeted bacteria showing rare or unique functions from heterogeneous communities or populations.

Photodegradierbare Hydrogel-Grenzflächen für Bakterienscreening, -selektion und -isolierung

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Measurement of the Acid-Resistant Fluorescent Reporter Protein mCherry2

Pick any colony from the MRS agar plate containing electroporated L.reuteri cells and inoculate into a 96 well microplate containing filter sterilized MRS broth per well and an appropriate selection antibiotic. Incubate aerobically for 24 hours at 37 degrees Celsius without shaking. The next day, L.reuteri will precipitate out of the media in the stationary phase.Resuspend the culture by pipetting. Add 200 microliters of culture into a flat, clear, bottom 96 well plate. Transfer the plate to a plate reader and measure the optical density and fluorescence of M cherry two and other relevant reporters.Colony morphology noticeably changes in the presence of oxygen. Under low oxygen conditions colonies appear white, opaque, smooth and round. Under partial or leaky conditions, colonies appear undulate, and umbanet.Whereas under atmospheric oxygen levels colonies always appear low bait, round and dry. In wild Type L.rueteri, growth and reporter protein expression vary between colonies making accurate deductions difficult. Plasmid curing, and re-transformation can result in more stable expression but it is an uncommon and unique occurrence reliant on more stable mutant phenotypes spontaneously occurring.

Messung des säureresistenten fluoreszierenden Reporterproteins mCherry2

<meta charset="utf8"></head><body>Antibakterielle Graphenoxid/Kupfer-Nanokomposite für resistente Bakterien

Fabrication of Antibacterial Graphene Oxide/Copper Nanocomposites

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to antibiotics. Developing&#160;antimicrobial agents that can replace existing antibiotics is essential because antibiotic-resistant bacteria have resistance mechanisms for all current antibiotics and can promote nosocomial infections. To address this challenge, in this study, we propose graphene oxide/copper (GO/Cu) nanocomposites as antibacterial materials that can replace the existing antibiotics. GO/Cu nanocomposites are characterized by transmission electron microscopy and scanning electron microscopy. They show that copper (Cu) nanoparticles are well-grown on the graphene oxide sheets. Additionally, a microdilution broth method is used to confirm the efficacy of the antimicrobial substance against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), which are frequently implicated in nosocomial infections. Specifically, 99.8% of MRSA and 84.7% of P. aeruginosa are eliminated by 500 &#181;g/mL of GO/Cu nanocomposites. Metal nanocomposites can eradicate antibiotic-resistant bacteria by releasing ions, forming reactive oxygen species, and physically damaging the bacteria. This study demonstrates the potential of antibacterial GO/Cu nanocomposites in eradicating antibiotic-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Metallische Nanokomposite zur Eliminierung antibiotikaresistenter Bakterien

Herein, we introduce graphene oxide/copper (GO/Cu) nanocomposites as an antibacterial nanomaterial. The antibacterial effectiveness of the GO/Cu nanocomposites was evaluated against both antibiotic-resistant gram-positive and gram-negative bacteria.

Herstellung von antibakteriellen Graphenoxid/Kupfer-Nanokompositen

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to ...