We thank the imaging platform of the Institut de la Vision. We acknowledge the French Muscular Dystrophy Association (AFM) for a PhD fellowship to O.V. and Allergan INC. This work performed in the frame of the LABEX LIFESENSES [reference ANR-10-LABX-65] was supported by French state funds managed by the ANR. We thank Peggy Barbe, and M&#233;lissa Desrosiers for technical assistance with AAV preparations. We are grateful to St&#233;phane Fouquet for excellent technical assistance in confocal microscopy and his expert input with the interpretation of the results.

Alle Tiere in dieser Studie verwendet wurden entsprechend der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research betreut und behandelt. 1. Herstellung der rekombinanten AAV (rAAV) durch transiente Transfektion von HEK-293-Zellen 17,18 HINWEIS: Siehe McClure C, JoVE (2011) 19. <ol><li> Reinigung einer großen Plasmidpräparation (mindestens 1 mg / ml) der AAV-Vektor-Plasmide. Verwenden Sie 3-Plasmiden. Die AAV-Helferplasmid trägt, die Replikation und Capsidgene ohne AAV invertierte terminale Wiederholungen ITRs, die Transgen-Expressionskassette trägt die AAV ITR bezeichnet als die Transfer-Plasmid, und das Plasmid Zuführen der Adenovirus-Helfergene E2, E4 und VA RNA-Gene genannten als pHELPER. </li><li> Transfektion von 293-Zellen mit diesen Plasmiden 3 mit Polyethylenimin (oder andere Transfektionsreagenz). Über 80% der Transfektionseffizienz für gute vi erforderlichral Erträge. </li><li> Reinige rekombinanten AAV von 293 Zelllysate auf eine Iodixanol Gradienten. 15%, 25%, 40% und 60% Iodixanol wird verwendet, um den Gradienten zu erhalten. Sammle 40% Iodixanol Fraktion AAV-Partikel enthält, konzentrieren die Fraktion nach Ultrazentrifugation bei 500.000 · g für 1 Stunde und Pufferwechsel gegen PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) mit 0,001% Pluronic. </li><li> Um festzustellen, virale genomische Titer 20, führen Sie eine DNAse ProteinaseK Digest gefolgt von QPCR. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer verstärken die 62 bp-Region im AAV2 ITR entfernt. Für die Plasmid-Standard wird die Sonde mit FAM bezeichnet und hat ein schwarzes Loch Löscher (BHQ). </li><li> Durchführung qPCR (quantitative Polymerase-Kettenreaktion) in einem Endvolumen von 25 ul mit 340 nM Rückwärtsprimer ITR, 100 nM Vorwärtsprimer ITR, 100 nM AAV2 ITR Sonde, 0,4 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq-Puffer, 1HE Platinum Taq und 5 ul Template (Standard, Probe und Leerwert-Kontrolle). </li><li> Fürder Standard, mit dem Plasmid für die Transfektion in 7 x 10-fachen seriellen Verdünnungen (5 &amp; mgr; l jeweils von 2 · 10 &amp; sup9 bis 2 × 10 3 Genome / ml, was zu einer Endkonzentration von Oktober 10.-Oktober 4. Genome / ml). </li><li> Beginnt das Programm mit einer anfänglichen Denaturierung bei 95 ° C für 15 min, gefolgt von 40 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 1 min und Annealing / Extension bei 60 ° C für 1 min. Lagerung bei 4 ° C für eine kurzzeitige Lagerung oder bei -20 ° C für lange Lagerzeiten. </li></ol> 2. Die intravitreale Injektion von AAV- <ol><li> Anesthetize C57BL6J Mäuse mit Ketamin (50 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) und überprüfen Sie die Verlust des Stellreflexes, Rückzugsreflex und Schwanz Pinch-Antwort, die eine angemessene Betäubung. Erweitern sich die Schüler von der Hornhaut Anwendung Neosynephrin 5% und mydriaticum 0,5% Augentropfen. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Übergeben Sie eine ultrafeine 30 G disposable Nadel durch den Äquator und neben dem Limbus in die Glaskörperhöhle (siehe Chiu K, JoVE (2007) 21). Injizieren 1 ul Lager mit 1 bis 4 x 10 11 vp ShH10-GFP oder AAV5-GFP mit der direkten Beobachtung der Nadel in der Mitte der Glaskörperhöhle (Abbildung 1). Verwenden Sie ein Auge als Kontrolle für ILM-Experimente. Spritzen Sie beide Augen für BRB Experimente. Tragen Sie eine entzündungshemmende und antibakterielle die topische Behandlung auf injizierten Augen. </li><li> Erweitern sich die Schüler mit Neosynephrin und mydriaticum Augentropfen für die Bildgebung. Führen Fundusuntersuchungen mit einer Augenhintergrundkamera mit GFP (Green Fluorescent Protein) Ausdruck 1 Woche, 2 Wochen, 1 Monat und 2 Monate nach der intravitrealen Injektion (Abbildung 1) zu folgen. Opfern Mäuse durch CO 2 Inhalation 1 bis 2 Monate nach der Injektion. </li></ol> 3. Immunhistochemie <ol><li> Für Netzhautgefrierschnitten (Abbildung 1), sezieren entkernte Augen l entfernenens und der Hornhaut, und Tauch fix in 4% Paraformaldehyd für 1 Stunde. <ol><li> Cryoprotect Die vorher fest Augen in 10% Sucrose für 1 h bei Raumtemperatur, 20% Saccharose für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur. Cryoprotect in 30% Saccharoselösung, über Nacht bei 4 ° C. Einzufrieren und in Einbettmittel wie Cryo-Matrix einbetten Augenmuscheln. Stellen Sie 10 um Gefrierschnitten und montieren Sie auf Folien speziell für Gefrierschnitte behandelt werden und dass Gewebehaftung zu verbessern während der Färbung. </li><li> Permeabilisieren Abschnitte mit 0,1% Triton X100 in PBS pH 7,4 für 5 min. 2 x Waschen in PBS und Block für 1 h bei Raumtemperatur in PBS mit 1% BSA, 0,1% Tween 20. </li></ol></li><li> Für retinalen Flatmounts (Abbildung 1), fix entkernte Augen in 4% Paraformaldehyd für 15 Minuten, um die Präparation zu erleichtern. <ol><li> In 15 bis 30 min, sezieren die Augen, um die Hornhaut und Linse zu entfernen. Trennen Sie die Netzhaut vom retinalen Pigmentepithel (RPE) und Lederhaut, indem auf der Ora serrata undder Sehnerv. Tauchen Sie ein in 4% Paraformaldehyd für weitere 30 Minuten, um die Netzhaut und das fluoreszierende Protein in transduzierten Zellen der Netzhaut (Fixierung muss 24 Stunden nicht überschreiten) zu beheben. Waschen 5 min in sterilem PBS, pH 7,4. </li><li> Ändere die PBS Blockierungspuffer (PBS mit 1% BSA, 2% normales Ziegenserum, Esel, 0,5% Triton X-100), und Inkubation in Blockierungspuffer für entweder 4 Stunden bei Raumtemperatur oder 4 ° C über Nacht. </li></ol></li><li> Gewebe mit primären Antikörpern inkubieren in Blockierungspuffer für entweder 4 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C über Nacht. Jeweils 3x mit PBS. HINWEIS: Die verwendeten Antikörper sind wie folgt: Anti-Laminin (1 / 1.000) Beschriftung der ILM, anti-Rhodopsin Klon 4D2 (1/500) Kennzeichnung Stangen, Anti-Glutamin-Synthetase-Klon GS-6 (1 / 1.500) Kennzeichnungsmüllerzellen , PNA-Lektin (1/40) Kennzeichnung Kegel. </li><li> Gewebe mit 1 inkubieren: 500 Verdünnung von Alexa Fluor konjugierte sekundäre Antikörper in Blocking-Puffer für 1 Stunde (Gefrierschnitte) bzw. 2 h (Flatmounts) bei Raumtempetur und vor Licht geschützt. Jeweils 3x mit PBS. </li><li> Machen die Linderung Schnitte an der Retina und Flatmount sie auf einen Objektträger entweder mit der Photorezeptor oder retinaler Ganglionzellen (RGCs) Seite nach oben. In wässrigen mountingmedium gelten Deckglas und bei 4 ° C. </li><li> Führen Sie die konfokale Mikroskopie auf Laserscanning konfokalen Mikroskop. Bilder nacheinander Zeile für Zeile zu erwerben, um Anregungs- und Emissionsübersprechen zu reduzieren. Definieren Schrittgröße nach dem Nyquist-Shannon-Abtasttheorem. Verwenden Sie die Belichtungseinstellungen, die übersättigt Pixel in den letzten Bildern zu minimieren. Prozess-12-Bit-Bilder mit FIJI, Projekt Z-Profile in einer Ebene mit maximaler Intensität unter Z-Projektfunktion und schließlich konvertieren 8-Bit-RGB-Farbmodus. </li></ol> 4. PCR-Analyse von Maus Blutproben <ol><li> Injizieren 100 ul Lager mit 1 bis 4 x 10 11 Partikel eines AAV-GFP in die Penisvenen betäubter C57BL6J Mäusen (5% IsofluranInduktion in einer engen Kammer und 2,5% Isofluran über einen Nasenkegel während der Operation) mit einer Insulinspritze mit einer ultrafeinen 6 mm Nadel. Das Tier wird als positive Kontrolle des zirkulierenden AAV-Partikel dienen. </li><li> Beispiel Blut von Maus Schwanz vor der Injektion und 3 Stunden, 24 Stunden, 2 Tage, 3 Tage nachdem ShH10 intravitreale Injektion oder nach intrapeniler Injektion (Abbildung 1). Über 10 bis 20 &amp; mgr; wird in Heparin-Röhrchen gesammelt. Opfern Mäuse durch CO 2 Inhalation nach Abschluss des Verfahrens. </li><li> Extrahieren genomischer DNA aus Blutproben mit dem Extraktions-Kit Ihrer Wahl. </li><li> Führen der PCR-Amplifikation von genomischer DNA. Aus diesem Protokoll verwenden Sie die folgende Primerpaar: GFP, spüren 5&#39;-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 &#39;, 5&#39;-Antisense-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3&#39;. Das folgende PCR-Programm wurde durchgeführt: 95 ° C 2 min (1 Zyklus); 95 ° C 45 sec, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 sec (30 Zyklen); 72 ° C 5 Minuten (1 Zyklus);4 ° C halten. </li></ol> 5. Optional Evans Blue-Methode HINWEIS: Quantifizieren vaskulären Permeabilität durch Messung Albuminverlust von Blutgefäßen in der Netzhaut mit dem Evans-Blau-Verfahren 10. <ol><li> Bereiten Evans Blue-Farbstoff durch Lösen in einer normalen Kochsalzlösung (6 mg / ml), Ultraschallbehandlung für 5 Minuten in einem Ultraschallreiniger und Filtration durch ein 5 um-Filter. </li><li> Anesthetize C57BL6J Mäuse (Isofluran Einatmen, siehe Schritt 4.1), überprüfen Sie den Verlust des Stellreflexes, Rückzugsreflex und Schwanz Pinch-Antwort, die eine angemessene Betäubung, und injizieren Evans Blau (45 mg / kg) durch den Penis Ader (Abbildung 1). Überprüfen Sie, ob die Pfoten, Schnauze und Ohren von Mäusen werden eindeutig blau nach Evans-Blau-Injektion, bestätigt die Aufnahme und Verteilung des Farbstoffs. </li><li> Anesthetize C57BL6J Mäusen 3 h nach der Injektion des Farbstoffes mit Ketamin (50 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg), und überprüfen den Verlust righting Reflex, der eine angemessene Betäubung. Proben intrakardial etwa 500 ul Blut in Heparinröhrchen und perfundieren Mäusen für 2 min über den linken Ventrikel mit einem Citratpuffer (0,05 M, pH 3,5; aufzulösen 7,8 g Zitronensäure und 3,8 g Natriumcitrat in 1 l destilliertem Wasser) auf 37 ° C vorgewärmt, um Vasokonstriktion zu verhindern. Die Mäuse werden über die Perfusion geopfert. </li><li> Nach Perfusion enucleate und sorgfältig sezieren beide Augen unter einem Operationsmikroskop, um die Netzhaut zu sammeln (siehe Abschnitt 3.2). Dry Netzhaut in einem Zentrifugalverdampfer über Nacht, zu wiegen, und extrahieren Sie die Evans blauen Farbstoff durch Inkubation Netzhaut mit 100 ul Formamid für 18 Stunden bei 65 ° C unter Schütteln (100 · g). Zentrifuge Retina Proben in 30K omega Filterrohre an 20,798.5 g für 2 Stunden bei 4 ° C zentrifugieren Blutproben 20,798.5 g 15 min bei 4 ° C. </li><li> Benutzen Sie beide Überstände, um die Absorption zu messen. Bestimmen Extinktion jeder Probe durch Subtrahieren des Extinktionsmaximum for Evans Blau bei 620 nm zur Extinktion Minimum bei 740 nm. Berechnen Evans Blau-Konzentration im Plasma und der Netzhaut von einer Standardkurve von Evans-Blau in Formamid. Express BRB Lässigkeit in Mikroliter Evans Blau pro Gramm Trocken Retina pro Stunde (ul Plasma / g Netzhauttrockengewicht / Stunde). </li></ol> 6. Optional Fluoreszein-Angiographie HINWEIS: Leakage von retinalen Blutgefäßen in Mäusen durch intraperitoneale Injektion von Natrium Fluorescein visualisiert werden. <ol><li> Anesthetize C57BL6J Mäuse (Isofluran Einatmen, siehe Schritt 4.1) und erweitern die Schüler mit Augentropfen (Neosynephrin und mydriaticum). Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Intraperitoneal injizieren 0,01-0,02 ml 10% Natriumfluorescein in 0,1 ml steriler Kochsalzlösung zur Angiographie. </li><li> Sammeln Sie Bilder beider Augen nach der Injektion mit einem Augenhintergrundkamera. Sacrifice Mäuse durch CO 2 Inhalation nach dem Pro-verfahren. Hinweis: 20 Sekunden sind nötig, dass die Netzhautgefäße auf Angiographie sichtbar werden. Bilder müssen zwischen 3-10 min Maximum nach Fluorescein Einspritzung erfasst werden. Die Leckflecken (falls vorhanden) sind nach 2,5 min zu beobachten. Zu späteren Zeitpunkten wird die Bildqualität aufgrund von Natriumfluorescein Diffundieren in den Glaskörper, also nur Bilder kurz nach für die Analyse verwendet wird, erhalten hat. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die BRB regelt den Austausch von Molekülen zwischen Blut und Netzhaut. Dessen Abbau ist mit verschiedenen Krankheiten, wie diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration (AMD) zugeordnet ist. Wir haben kürzlich gezeigt, dass in einer Dystrophin-Knock-out-Maus, die durchlässig BRB zeigt, wird die Netzhaut zügiger der Genübertragung von Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) vermittelt. Trotz BRB Lässigkeit AAV-Partikel injiziert intraokular mit dem Augenraum in diesem Modell beschränkt bleiben. ...

Müller-Zellen sind die Haupt glial Komponente der Netzhaut. Morphologisch pannen sie die Netzhaut und ihre radial Endfüßen, in Kontakt mit dem Glaskörper vor der ILM und geheime Komponenten des letzteren. Die ILM ist eine Basalmembran von etwa zehn unterschiedlichen extrazellulären Matrixproteinen (Laminin, Agrin, Perlecan, Nidogen, Kollagen und mehrere Heparinsulfatproteoglykanen) zusammen. Während der Entwicklung ist die Präsenz für die Netzhaut Histogenese, Navigations optischer Axone, und das Überleben von Ganglienzellen 1-3 unverzichtbar. Allerdings ist ILM unwesentlich bei erwachsenen Netzhaut und kann chirurgisch in bestimmten Krankheitsbildern entfernt werden, ohne dass Netzhautschäden 4. Bei der Gentherapie wird diese Membran eine physikalische Barriere für eine effiziente Transduktion der Retina mit AAVs durch intravitreale Injektion 5. Durch die umfangreiche Verzweigung ihrer Prozesse, Müllerzellen bieten Ernährungs- und regulatorischen support, um sowohl retinale Neuronen und vaskulären Zellen. Müller-Zellen werden auch in die Regulation der retinalen Homöostase beteiligt sind, bei der Bildung und Aufrechterhaltung der BRB 6. Tight Junctions zwischen retinalen Endothelzellen, Müllerzellen, Astrozyten und Perizyten bilden die BRB. BRB verhindert bestimmte Substanzen aus der Eingabe der retina.In vielen Krankheiten wie diabetische Retinopathie, Netzhautvenenverschluss und respiratorischen Erkrankungen, Hypoxie der Retina führt zu Leckagen durch die BRB 7-9. Dieser Bruch wird mit einer Erhöhung der vaskulären Permeabilität, die zu vasogenes Ödem, Netzhautablösung und retinale Schädigung verbunden. Müller-Zellen sind dicht mit Blutgefäßen und der Basalmembran zugeordnet und spielt eine wichtige Rolle sowohl bei der BRB und ILM Integrität. Folglich Beschriftung Müller Gliazellen ist besonders relevant für die Untersuchung der physikalischen Zustand dieser Netzhautbarrieren. KlassikerAlliierten wird BRB Lässigkeit unter Verwendung des Evans-Blau-Assays, die aus der systemischen Injektion von Evans-Blau-Farbstoff, der nicht-kovalent an Plasmaalbumin bindet gemessen. Dieser Test misst die Albuminverlusts (Protein mittlerer Größe, ~ 66 kDa) von Blutgefäßen in der Netzhaut (siehe Protokolle Abschnitt 5) 10. Alternativ kann die Gefäßdurchlässigkeit durch Fluoreszenz retinalen Angiographie Bescheinigung für Leckage von Fluorescein visualisiert werden (kleines Molekül, ~ 359 Da; siehe Protocols Abschnitt 6) 11. Dennoch sind beide Verfahren ermöglichen die Bewertung der BRB Lässigkeit für kleine Moleküle und Proteine, aber sie bieten keine Informationen über das ILM Integrität. Daher, um BRB Lässigkeit zu untersuchen, verwendeten wir ein AAV basierte Methode, die Informationen über die BRB Permeabilität zu größeren Molekülen (zB AAV-Partikel, 25 nm Durchmesser) einbringt. In der Tat kann unsere Methode Vorhandensein von AAV Transgen im Blut zu erkennen, was vermuten lässt, dass ~ Partikel 25 nm Durchmesser würdein der Lage, in den Blutstrom einzudringen. Dieses Verfahren liefert auch Informationen über die Struktur des ILM und extrazellulären Matrixproteinen in pathologischen Zuständen. Zwei AAV-Varianten eignen sich für eine solche Studie: AAV5 und ShH10. Subretinal injiziert hat AAV5 einen natürlichen Tropismus für Photorezeptoren und retinale Pigmentepithel 12, aber es kann, wenn es in den Glaskörper in Wildtyp-Retina mit intakten ILM 5,13 verabreichten nicht quer zu der äußeren Netzhaut zu erhalten. ShH10 ist ein AAV-Variante, die konstruiert wurde, um gezielt Gliazellen über Neuronen 14,15. ShH10 selektiv Etiketten Müller-Zellen sowohl in gesunden und erkrankten Netzhaut mit erhöhter Effizienz in der Netzhaut mit eingeschränkter Barrieren 16. Diese viralen Tools gepaart mit immuhistochemistry und Blut-DNA-Analysen geben Auskunft über den Zustand der Netzhaut-Barrieren und ihre Beteiligung an Krankheit (Bild 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:193px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">C57BL6J mice strain</td>
			<td style="width:107px;">JANVIER LABS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Ketamine 500</td>
			<td style="width:107px;">Virbac France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Xylazine Rompun 2%</td>
			<td style="width:107px;">Bayer Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Neosynephrine 5% Faure</td>
			<td style="width:107px;">Europhta</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dilatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Mydriaticum 0,5%</td>
			<td style="width:107px;">Thea</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>dilatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Sterdex</td>
			<td style="width:107px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>anti-inflammatory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Cryomatrix embedding resin</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Superfrost Plus Adhesion Slides</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10143352</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">anti-laminin&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9393</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">anti-rhodopsin clone 4D2&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MABN15</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">anti-glutamine synthetase clone GS-6&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB302</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein</td>
			<td style="width:107px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">334</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">PNA Lectin&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L32459</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Alexa fluor conjugated secondary antibodies&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Fluorsave reagent</td>
			<td style="width:107px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">345789</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">QIAmp DNA Micro Kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">56304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">GoTaq DNA polymerase</td>
			<td style="width:107px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Evans Blue dye&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E2129&#160;</td>
			<td>dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">5 &#181;m filter&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Sodium Citrate&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Citric acid&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1909-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Formamide spectrophotometric&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">295876-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2456&#160;</td>
			<td>dye</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:225px;">Micron III</td>
			<td style="width:107px;">Phoenix Research Labs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:193px;">Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Insulin Syringes</td>
			<td style="width:107px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS30M3109&#160;</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Syringe 10 &#181;l Hamilton</td>
			<td style="width:107px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">74487</td>
			<td>Seringue 1701</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Needle RN G33, 25 mm, PST 2&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11530332</td>
			<td>Intravitreal Injection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:225px;">UltraMicroPump UMP3</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">UMP3</td>
			<td style="width:193px;">Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller</td>
			<td style="width:119px;">UMP3-1</td>
			<td>Digital controller</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:225px;">Binocular magnifier SZ76</td>
			<td style="width:107px;">ADVILAB</td>
			<td style="width:119px;">ADV-76B2</td>
			<td style="width:193px;">Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Spring scissors straight - 8,5cm</td>
			<td rowspan="3" style="width:107px;">Bionic France S.a.r.l</td>
			<td style="width:119px;">15003-08</td>
			<td rowspan="3" style="width:193px;">Retinas dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Micro-ciseaux de Vannas courbe</td>
			<td style="width:119px;">15004-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Pince Dumont 5</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Veriti 96-Well Thermal Cycler</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td>Thermocycler</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Ultrasonic cleaner&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Laboratory Supplies</td>
			<td style="width:119px;">G1125P1T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Nanosep 30k omega tubes&#160;</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Speedvac</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SC 110 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Spectrofluorometer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">TECAN&#160;</td>
			<td style="width:119px;">infinite M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using adeno-associated virus as a tool to study retinal barriers in disease

Müller-Zellen sind die Haupt gliale Zellen der Retina. Ende ihrer Füße bilden die Grenzen der Netzhaut auf der äußeren und inneren Begrenzungsmembranen (ILM) und in Verbindung mit Astrozyten Perizyten und Endothelzellen sie die Blut-Retina-Schranke (BRB) herzustellen. BRB begrenzt Materialtransport zwischen dem Blutstrom und der Netzhaut, während das ILM wirkt als Basalmembran histologisch die Grenze zwischen der Netzhaut und des Glas Hohlraum definiert. Beschriftung Müller-Zellen ist besonders relevant für den physikalischen Zustand der Netzhautbarrieren zu studieren, da diese Zellen sind ein integraler Bestandteil des BRB und ILM. Sowohl BRB und ILM werden häufig in Netzhauterkrankungen verändert und sind für die Krankheitssymptome verantwortlich. Es gibt mehrere gut etablierte Verfahren, um die Integrität des BRB studieren, wie die Evans Blau-Assay oder Angiographie. Allerdings sind diese Verfahren nicht auf das Ausmaß der BRB Lässigkeit t informiereno größere Moleküle, im Nanometerbereich. Außerdem liefern sie keine Informationen über den Zustand anderer retinaler Barrieren wie die ILM. Um BRB Permeabilität neben retinalen ILM zu untersuchen, verwendeten wir ein AAV basiertes Verfahren, das Informationen über Permeabilität BRB zu größeren Molekülen während sie den Zustand der ILM und extrazellulären Matrixproteinen in Krankheitszuständen. Zwei AAV-Varianten eignen sich für eine solche Studie: AAV5 und ShH10. AAV5 hat einen natürlichen Tropismus für Photorezeptoren, aber es kann, wenn es in den Glaskörper verabreicht wird, wenn das ILM intakt ist (dh, in Wildtyp-Retina) nicht quer zu der äußeren Netzhaut zu erhalten. ShH10 hat eine starke Tropismus hin Gliazellen und selektive Markierung Müller Glia in gesunden und erkrankten Netzhaut. ShH10 bietet effizientere Genübertragung in Netzhaut, wo ILM gefährdet ist. Diese viralen Tools gepaart mit Immunhistochemie und Blut-DNA-Analyse Aufschluss auf den Zustand der Netzhautbarrieren in Krankheit.

Wir erwarten mehr retinalen Transduktion Müller Gliazellen mit ShH10 wenn das Tiermodell zeigt Störungen in der Struktur des ILM (2A - B). Zum Beispiel haben wir in Abwesenheit von DP71 gezeigt, ShH10 Targets spezifisch aber effizienter Müller Gliazellen durch intravitreale Injektion, was auf eine erhöhte Durchlässigkeit der ILM in diesem Mauslinie im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen 16 (2C - F). AAV5 kann auch a...

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Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

using-adeno-associated-virus-as-tool-to-study-retinal-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

14.9K Aufrufe.  Sorbonne Universtés, UPMC Univ Paris 06, UMR_S 968. To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Serie: Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

High-Efficiency Transduktion von Liver Cancer Cells von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 3 Vektoren

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Forschung

Medizin

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being analyzed 1, 2. This classical banding technique, however, is not reliable in identifying complex chromosomal aberrations such as those associated with cancer. To overcome the limitations of the banding technique, Spectral Karyotyping (SKY) is introduced to provide much reliable information on chromosome abnormalities.
SKY is a multicolor fluorescence in-situ hybridization (FISH) technique to detect metaphase chromosomes with spectral microscope 3, 4. SKY has been proven to be a valuable tool for the cytogenetic analysis of a broad range of chromosome abnormalities associated with a large number of genetic diseases and malignancies 5, 6. SKY involves the use of multicolor fluorescently-labelled DNA probes prepared from the degenerate oligonucleotide primers by PCR. Thus, every chromosome has a unique spectral color after in-situ hybridization with probes, which are differentially labelled with a mixture of fluorescent dyes (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC and Cy5.5). The probes used for SKY consist of up to 55 chromosome specific probes 7-10.
The procedure for SKY involves several steps (Figure 1). SKY requires the availability of cells with high mitotic index from normal or diseased tissue or blood. The chromosomes of a single cell from either a freshly isolated primary cell or a cell line are spread on a glass slide. This chromosome spread is labeled with a different combination of fluorescent dyes specific for each chromosome. For probe detection and image acquisition,the spectral imaging system consists of sagnac interferometer and a CCD camera. This allows measurement of the visible light spectrum emitted from the sample and to acquire a spectral image from individual chromosomes. HiSKY, the software used to analyze the results of the captured images, provides an easy identification of chromosome anomalies. The end result is a metaphase and a karyotype classification image, in which each pair of chromosomes has a distinct color (Figure 2). This allows easy identification of chromosome identities and translocations. For more details, please visit Applied Spectral Imaging website (<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a>).
SKY was recently used for an identification of chromosome segregation defects and chromosome abnormalities in humans and mice with Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD), a genetic disease characterized by dysfunction in primary cilia 11-13. Using this technique, we demonstrated the presence of abnormal chromosome segregation and chromosomal defects in ADPKD patients and mouse models 14. Further analyses using SKY not only allowed us to identify chromosomal number and identity, but also to accurately detect very complex chromosomal aberrations such as chromosome deletions and translocations (Figure 2).

Spectral Karyotyping (SKY) is an advanced cytogenetics technique to identify genomic and chromosomal aberrations. This technique takes advantage of chromosome painting probes, which allow classification of all chromosomes. SKY can also identify complex chromosome aberrations and segregation defects in mice and humans with various diseases, including polycystic kidney disease.

Spektrale Karyotypisierung zu Chromosomenanomalien in Menschen und Mäusen mit Kidney Disease Study

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Osteopathic Manipulative Treatment as a Useful Adjunctive Tool for Pneumonia

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in the hospitalization of 1.1 million patients2. With an average length of in-patient hospital stay of five days2, pneumonia and influenza comprise significant financial burden costing the United States $40.2 billion in 20053. Under the current Infectious Disease Society of America/American Thoracic Society guidelines, standard-of-care recommendations include the rapid administration of an appropriate antibiotic regiment, fluid replacement, and ventilation (if necessary). Non-standard therapies include the use of corticosteroids and statins; however, these therapies lack conclusive supporting evidence4. (Figure 1)

Osteopathic Manipulative Treatment (OMT) is a cost-effective adjunctive treatment of pneumonia that has been shown to reduce patients&#8217; length of hospital stay, duration of intravenous antibiotics, and incidence of respiratory failure or death when compared to subjects who received conventional care alone5. The use of manual manipulation techniques for pneumonia was first recorded as early as the Spanish influenza pandemic of 1918, when patients treated with standard medical care had an estimated mortality rate of 33%, compared to a 10% mortality rate in patients treated by osteopathic physicians6. When applied to the management of pneumonia, manual manipulation techniques bolster lymphatic flow, respiratory function, and immunological defense by targeting anatomical structures involved in the these systems7,8, 9, 10.

The objective of this review video-article is three-fold: a) summarize the findings of randomized controlled studies on the efficacy of OMT in adult patients with diagnosed pneumonia, b) demonstrate established protocols utilized by osteopathic physicians treating pneumonia, c) elucidate the physiological mechanisms behind manual manipulation of the respiratory and lymphatic systems. Specifically, we will discuss and demonstrate four routine techniques that address autonomics, lymph drainage, and rib cage mobility: 1) Rib Raising, 2) Thoracic Pump, 3) Doming of the Thoracic Diaphragm, and 4) Muscle Energy for Rib 1.5,11

Pneumonia is one of the top ten leading causes of death in the U.S. Osteopathic manipulative techniques (OMT) may be utilized as an adjunctive therapy in the treatment of pneumonia to enhance biomechanical and immune function; and ultimately, to reduce hospital stay, duration of antibiotics, incidence of respiratory failure, and mortality. In this video-article, we will review randomized controlled studies on the use of OMT in pneumonia patients, as well as demonstrate specific hands-on techniques that are routinely practiced by osteopathic physicians when treating pulmonary infections.

Osteopathic Manipulative Treatment als nützliches Werkzeug für Adjunctive Lungenentzündung

Pneumonia, the inflammatory state of lung tissue primarily due to microbial infection, claimed 52,306 lives in the United States in 20071 and resulted in ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an important role in maintaining cardiovascular health. The retina is a tissue that lines the interior of the eye and it is the only tissue that allows for a non-invasive analysis of the microvasculature. Nowadays, high-quality fundus images can be acquired using digital cameras. Retinal images can be collected in 5 min or less, even without dilatation of the pupils. This unobtrusive and fast procedure for visualizing the microcirculation is attractive to apply in epidemiological studies and to monitor cardiovascular health from early age up to old age.
Systemic diseases that affect the circulation can result in progressive morphological changes in the retinal vasculature. For example, changes in the vessel calibers of retinal arteries and veins have been associated with hypertension, atherosclerosis, and increased risk of stroke and myocardial infarction. The vessel widths are derived using image analysis software and the width of the six largest arteries and veins are summarized in the Central Retinal Arteriolar Equivalent (CRAE) and the Central Retinal Venular Equivalent (CRVE). The latter features have been shown useful to study the impact of modifiable lifestyle and environmental cardiovascular disease risk factors.
The procedures to acquire fundus images and the analysis steps to obtain CRAE and CRVE are described. Coefficients of variation of repeated measures of CRAE and CRVE are less than 2% and within-rater reliability is very high. Using a panel study, the rapid response of the retinal vessel calibers to short-term changes in particulate air pollution, a known risk factor for cardiovascular mortality and morbidity, is reported. In conclusion, retinal imaging is proposed as a convenient and instrumental tool for epidemiological studies to study microvascular responses to cardiovascular disease risk factors.

Retinal image analysis is an unobtrusive procedure for visualizing the microcirculation. The impact of cardiovascular disease risk factors can result in changes of retinal vessel calibers. The procedures to acquire fundus images and the steps for calculating the vessel calibers are described.

Fundusfotografie als geeignetes Mittel, um mikrovaskuläre Antworten zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen Risikofaktoren in epidemiologischen Studien Studieren

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Adapting Human Videofluoroscopic Swallow Study Methods to Detect and Characterize Dysphagia in Murine Disease Models

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating translational dysphagia research. Successful outcomes are dependent upon three critical components: test chambers that permit self-feeding while standing unrestrained in a confined space, recipes that mask the aversive taste/odor of commercially-available oral contrast agents, and a step-by-step test protocol that permits quantification of swallow physiology. Elimination of one or more of these components will have a detrimental impact on the study results. Moreover, the energy level capability of the fluoroscopy system will determine which swallow parameters can be investigated. Most research centers have high energy fluoroscopes designed for use with people and larger animals, which results in exceptionally poor image quality when testing mice and other small rodents. Despite this limitation, we have identified seven VFSS parameters that are consistently quantifiable in mice when using a high energy fluoroscope in combination with the new murine VFSS protocol. We recently obtained a low energy fluoroscopy system with exceptionally high imaging resolution and magnification capabilities that was designed for use with mice and other small rodents. Preliminary work using this new system, in combination with the new murine VFSS protocol, has identified 13 swallow parameters that are consistently quantifiable in mice, which is nearly double the number obtained using conventional (i.e., high energy) fluoroscopes. Identification of additional swallow parameters is expected as we optimize the capabilities of this new system. Results thus far demonstrate the utility of using a low energy fluoroscopy system to detect and quantify subtle changes in swallow physiology that may otherwise be overlooked when using high energy fluoroscopes to investigate murine disease models.

This study successfully adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating translational dysphagia research.

Anpassung Menschen Videofluoroscopic Swallow Studienmethoden nachgewiesen und charakterisiert Dysphagie in Murine Krankheitsmodelle

This study adapted human videofluoroscopic swallowing study (VFSS) methods for use with murine disease models for the purpose of facilitating ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor,

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Retinale Bildgebung bei der Demenz zu studieren

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

The Dyspepsia Educational Tool As a Novel Aid in Dyspepsia Management

Digital educational tools have a well-established role in current healthcare. In particular, disorders that are managed non-pharmacologically benefit from this development, as it enables patient engagement in self-management. Dyspepsia is a condition thought to arise from gastric and duodenal perturbations, brain-gut axis disturbances, and dietary factors. Behavioral interventions are a major part of dyspepsia treatment, hence patient engagement and motivation through education is essential. Protocols that describe the development process of such educational tools are scarce. We provide a methodology describing development of a dyspepsia educational tool. Assessment of users' needs is the first step, followed by a literature search. The content is developed based on the main themes and entered into a content management system, to build the program. Final adjustments are made after a pilot test of the tool. The presented protocol can be used as a guide for development of a digital dyspepsia educational tool or as a tool for similar situations.

This protocol describes the development process of a digital dyspepsia educational tool. Assessment of unmet needs and literature, content development, and building of the tool are presented. The methodology can be used as a guide for future development of digital educational tools.

Das Dyspepsia-Bildungstool als neuartige Hilfe im Dyspepsie-Management

Digital educational tools have a well-established role in current healthcare. In particular, disorders that are managed non-pharmacologically benefit from ...

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ease of accessibility via multiple administration routes. Subconjunctival (SCJ) injections offer advantages over other intraocular administration routes as they are simple, safe, and usually performed in an outpatient setting. SCJ injections in small animals usually require the assistance of an operating microscope due to the size of the eye. Previous work has demonstrated that SCJ injection of specific adeno-associated virus (AAV) serotypes is a valid gene delivery strategy for targeted transduction of the ocular surface, eye muscle, cornea, and optic nerve, providing a potential approach for the treatment of many ocular diseases.
Herein, a detailed protocol is presented for SCJ injections in a mouse model using an injection system consisting of a programmable infusion/withdrawal syringe pump (which allows for consistent and precise injection speed and pressure) and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. The injection system is also adaptable for other intraocular administration routes such as intrastromal, intracameral, intravitreal, and subretinal injections in small animals. Although the delivery of adeno-associated viral vectors for ocular gene therapy studies is described, the protocol herein can also be adapted for a variety of ophthalmic solutions in small animal models. The key practical steps in the administration route, setup for the injection platform, preparation of the injection, and tips from direct experience will be discussed in detail. In addition, common validation techniques for AAV delivery confirmation to the desired tissues will also be briefly discussed.

In this manuscript, subconjunctival injection is demonstrated as a valid vector delivery method for ocular tissues in mice using an injection system consisting of an infusion/withdrawal syringe pump and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. This injection system is also adaptable for other intraocular administration routes.

Subkonjunktivale Verabreichung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Kleintiermodellen

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...