Diese Methode der in vivo Bildgebung von Netzhautzellen ermöglicht die Untersuchung ophthalmologischer Erkrankungen und das Verständnis normaler Funktionen der Netzhaut. Diese Methode bietet einen einfachen und hochreproduzierbaren Ansatz zur In-vivo-Bildgebung der Netzhaut durch Zwei-Photonen-Mikroskopie. Die richtige Stabilisierung der Maus ist der Schlüssel zur Erzielung qualitativ hochwertiger In-vivo-Bilder.
Üben Sie, die Maus in den Kopfhalter einzustellen, und machen Sie sich mit dem Vorgang vertraut, bevor Sie versuchen, Bilder aufzunehmen. Seedieren Sie das Tier gemäß dem genehmigten Tierverwendungsprotokoll. Tragen Sie eine Pupillenerweiterungslösung auf und lassen Sie die Maus fünf Minuten lang im Dunkeln, damit sich die Pupillen erweitern können.
Befestigen Sie den unteren Gehörgangsstift in der nach innen ausgestreckten Position und den oberen Gehörgangsstift in der zurückgezogenen Position. Drehen Sie den Hauptarm des Kopfhalters, bis die Ohrmuschelleiste in einem 60-Grad-Winkel unter der Horizontalen geneigt ist. Wenn die Maus zum Bissbalken zeigt, montieren Sie ein Ohr auf den verlängerten unteren Stift, wobei der Stift in den Gehörgang eingeführt wird.
Nachdem Sie die Schraube gelöst haben, die den oberen Gehörgangsstift sichert, verlängern Sie den Stift in den anderen Gehörgang und ziehen Sie die Schraube wieder fest, um den Kopf zu sichern. Stellen Sie sicher, dass die Maus sicher in der Kopfhalterung sitzt. Drücken Sie auf die Oberseite des Kopfes.
Die Maus sollte sicher in den Ohrstäben bleiben und ihr Kopf sollte sich frei um die Achse der Gehörgänge drehen. Wenn die Bissstange in Richtung des Mauskopfes positioniert ist, heben Sie den Kopf der Maus vorsichtig an, damit die Oberkieferschneidezähne in den Bissleistenhalter abgesenkt werden können, und ziehen Sie die Bissstange mit sanfter Kraft zurück, um den Kopf zu sichern. Verwenden Sie die Schraube, um die Bissstange in Position zu bringen, und legen Sie Maus und Halter auf den Mikroskoptisch.
Gleitmittel-Augentropfen auf beide Augen der Maus auftragen. Drehen Sie den Hauptarm des Kopfhalters, bis die Pupille eines Auges in Übereinstimmung mit dem Lichtpfad ausgerichtet ist, und legen Sie ein Deckglas der Nummer 1,5 in den kompakten Filterhalter. Nachdem Sie den Halter am Mikroskoptisch befestigt haben, senken Sie das Deckglas ab, bis es das schmierende Augengel berührt, ohne die Hornhaut zu berühren, und stellen Sie den Tisch in der X-Y-Dimension und der objektiven Z-Position ein, bis das Weitfeld-Anregungslicht die Hornhaut vollständig bedeckt.
Verwenden Sie das Okular, um die Z-Position weiter einzustellen, bis die fluoreszierenden Zellen oder Strukturen in der Netzhaut in den Fokus kommen, und erhöhen Sie den Epifluoreszenzstrahler nach Bedarf, um einzelne Zellen oder Strukturen von Interesse aufzulösen. Feinabstimmung der Netzhaut mit dem abbildenden Lichtpfad. Passen Sie den Kopfwinkel so lange an, bis beim Ändern der Fokusebene nur noch eine Ausdehnung oder Kontraktion des unscharfen Lichts auftritt, um X-Y-Verzerrungen zu minimieren.
Schalten Sie dann die Epifluoreszenzbeleuchtung aus und schließen Sie den Verschluss der Beleuchtung. Befolgen Sie für die Zwei-Photonen-Bildgebung alle institutionellen Lasersicherheitsprotokolle. Schalten Sie das gesamte Umgebungslicht aus und decken Sie es ab und schalten Sie den Anregungslichtpfad zum Laser und den Emissionslichtpfad zu den PMTs.
Stellen Sie in der Bilderfassungssoftware die Bildgröße auf 512 x 512 und den Bilddurchschnitt auf drei ein. Stellen Sie das Z-Stepping so ein, dass es an der Spitze des Stapels beginnt und nach unten fortschreitet, wodurch die Zwei-Photonen-Laseraktivierung der Photorezeptoren minimiert wird. Schalten Sie die PMTs ein, aktivieren Sie sie, und stellen Sie die Spannung auf 680 Volt ein.
Aktivieren Sie die Bild- und Emissionsverschlüsse. Starten Sie eine Live-Bildvorschau des Zielgewebes, beginnend mit einer Laserleistung von 1%, und passen Sie die Displayhelligkeit automatisch an, um die Zellen oder Strukturen von Interesse zu visualisieren. Wenn das Zielgewebe schwach oder unklar ist, erhöhen Sie den Prozentsatz der Laserleistung, bis Strukturen sichtbar werden, ohne 45 Milliwatt zu überschreiten.
Manövrieren Sie den Mikroskoptisch in X-Y-Richtung, um sich auf einen gewünschten Bildbereich zu konzentrieren, und navigieren Sie zur Z-Ebene mit den interessierenden Strukturen im Fokus. Öffnen Sie für ein chronisches Zeitrafferexperiment ein zuvor erhaltenes Bild, um es als Referenz für die interessierenden Zellen zu verwenden, und achten Sie darauf, dass der Bildwinkel im aktuellen Bild dem der vorherigen Bilder ähnelt. Navigieren Sie dann zur obersten und untersten Z-Ebene, um die Z-Grenzen des Abbildungsstapels festzulegen und das Bild zu erfassen.
Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, deaktivieren Sie die PMTs und den Laserverschluss. Schalten Sie den Anregungslichtpfad auf Epifluoreszenzbeleuchtung und den Emissionslichtpfad zurück zum Okular. Beenden Sie dann die Bilderfassungssoftware, schalten Sie den Laser in der Computerschnittstelle aus und fahren Sie die Hardware in umgekehrter Startreihenfolge herunter, mit Ausnahme der ständig eingeschalteten Geräte.
Am Ende der Analyse entfernen Sie die Maus aus dem Kopfhalter und verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um das Augengel vorsichtig zu entfernen. Tragen Sie dann eine Gleitmittel-Augensalbe auf beide Augen auf und legen Sie die Maus auf ein 37 Grad Celsius warmes Wärmekissen mit Überwachung bis zum vollständigen Liegen, bevor Sie die Maus in ihr Gehäuse zurückbringen. Bei VGlut-2-Cre-Mäusen sind retinale Ganglienzellsomas deutlich erkennbar und häufig Axonsaszikel erkennbar.
Die Flugbahn der Axone und das negative Bild des Gefäßsystems erleichtern die Identifizierung des Sehnervenkopfes bei VGlut-2-Cre-Mäusen, was als Meilenstein in chronischen bildgebenden Experimenten nützlich ist. Im Gegensatz zu retinalen Ganglienzellen werden Amakrinzellneurite häufiger in den inneren plexiformen Schichten beobachtet. Einen Tag nach der intraokularen NMDA-Injektion zeigen retinale Mikroglia kurze Prozesse oder eine amöboide Morphologie gemäß früheren Berichten.
Die Verabreichung von Evans-Blaufarbstoff über eine einzige intraperitoneale Injektion 30 bis 60 Minuten vor der Bildgebung induziert eine starke Markierung der Blutgefäße, die vom Sehnervenkopf ausgeht und mindestens sieben Tage anhält. Nach der Fixierung kann der wahre Abstand zwischen Zellpaaren innerhalb abgeflachter retinaler ganzer Montierungen in konfokalen Scans gemessen und mit In-vivo-Pixelabständen abgeglichen werden, um die durchschnittliche Pixelgröße von In-vivo-Bildern zu bestimmen. Fluoreszierende Mikrokugeln, die in die Augen von Mäusen injiziert werden, ermöglichen die Messung des Mikrokugeldurchmessers in vivo, was eine etwas größere Pixelgrößenschätzung ergibt, jedoch mit mehr Varianz.
In-vivo-Bildgebung kann mit histologischen Analysen wie Immunfärbung und In-situ-Hybridisierung kombiniert werden. Diese Methoden können spezifische Zelltypen identifizieren und die Genexpression von abgebildeten Zellen untersuchen.
