Die Autoren danken den Mitgliedern des Harata für die Diskussionen während der Ausführung dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der American Heart Association, der Dystonie Medical Research Foundation, die Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, der National Science Foundation und der Whitehall-Stiftung finanziert NCH

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wir haben Protokolle für Färben und Entfärben synaptischen Vesikeln in Reaktion auf evozierte, spontan und Miniatur synaptische Aktivität und für die Bildgebung bei der Entfärbung Phase beschrieben. Zusätzlich zu den bestehenden Protokollen, haben wir ein neues Protokoll der Beobachtung der FM Entfärben basierend auf Miniatur synaptische Aktivität enthalten. Mit Hilfe dieser Protokolle, bisher haben wir Anomalien in kultivierten Neuronen aus einem Maus-Modell der Bewegungsstörung Dystonie identifiziert. Im Ver...

Die Funktionalität der synaptischen Vesikeln ist eine wichtige Determinante der synaptischen Übertragung. Diese Vesikel Neurotransmitter freisetzen, wenn sie mit der präsynaptischen Plasmamembran (Exozytose) fusionieren, und sie werden, nachdem sie von der Plasmamembran (Endozytose) regeneriert und neu geladen mit Neurotransmitter bereit für einen weiteren Zyklus der Veröffentlichung. Erforschung der Mechanismen und Dynamik der synaptischen Vesikel Recycling Basiswert hat durch die Einführung von Styryl-Farbstoffe FM 1 beschleunigt. Diese amphipathische Moleküle, die (in 1A, stereo von FM1-43 in Figur 1B mehrere Farbstoffe) positiv geladen sind hydrophile Kopfgruppen und hydrophoben Schwänze, reversibel ein-und aussteigen, ohne Lipidmembranen durchdringt sie. Gruppen FM Farbstoffe haben ähnliche Funktionen, die das Spektrum des Lichts, das sie aussenden beeinflussen. Zum Beispiel, FM2-10, FM1-43 und FM1-84 haben eine Doppelbindung zwischen zwei zyklischen Verbindungen und show grüne Emission. Der Unterschied zwischen ihnen ist die Länge der hydrophoben Schwanz, der seine Hydrophobie bestimmt und daher die Rate des Austritts aus der Membran (departitioning). In den Fällen des FM5-95 und FM4-64, drei Doppelbindungen verbinden die zyklische Verbindungen, und sie rote Emission zeigen. Diese Farbstoffe unterscheiden sich in ihrem hydrophilen Teile. In allen FM-Farbstoffe, die Fluoreszenzintensität erhöht, wenn sie in biologischen Membranen eingesetzt, aufgrund einer Erhöhung der Quantenausbeute in der hydrophoben Umgebung relativ zu dem hydrophilen Umgebung. So werden die Veränderungen in der FM-Intensität stellen die Veränderungen in der Membran Umsatz. Die verschiedenen Farben (Emissionsspektren) und Hydrophobien machen das FM färbt ein vielseitiges Forschungsinstrument in der synaptischen Vesikel-Recycling. Basierend auf diesen Merkmalen werden die FM-Farbstoffe meist nach dem folgenden Schema bei der Analyse der synaptischen Vesikel-Recycling (Fig. 2) verwendet. Neurons sind in einer extrazellulären Lösung, die das FM Farbstoff getaucht, so dass es in die synaptischen Vesikel (SV) genommen werden, da sie über Endozytose (Färbung) zu bilden. Der Farbstoff wird dann durch Aufbringen einer farbstofffreien extrazellulären Lösung gewaschen, dies zeigt die funktionelle Nervenenden, dh nur die aktiv Endozytose wird eine Gruppe von synaptischen Vesikeln, die mit dem Farbstoff (Fig. 2 unten) beladen sind, enthalten. Anschließende Exozytose führt zum Verlust des FM-Farbstoff an den extrazellulären Raum und einem gleichzeitigen Verlust der Fluoreszenz (Entfärbung, sowohl wegen der departitioning zu einer hydrophilen Umgebung und Diffusion weg vom Ort der Exozytose). Daher sind die Veränderungen in der Fluoreszenzintensität FM sind Indikatoren für die synaptischen Vesikel Exo-und Endozytose. FM-Farbstoffe werden verwendet, um zu färben und entfärben die synaptischen Vesikeln in verschiedenen Organismen und Zubereitungen 2,3. Beispiele sind Säugetier neuronal Kulturen 4-9, Säugetiergehirnscheiben 10,11, 12,13 neuromuskulären Verbindungen, Netzhaut bipolaren Neuronen 14,15 und Haarzellen der Cochlea 16. Typischerweise in solchen Experimenten werden sowohl Färbung und Entfärbung von extensiv Stimulierung der Neuronen (evozierte Aktivität) ausgelöst. Kürzlich jedoch synaptischen Vesikel-Recycling in Reaktion auf schwache Stimulation wurde auch untersucht, ebenso wie das Recycling in Abwesenheit eines externen Stimulus (spontan und Miniatur synaptische Aktivität) 9,17-19. Spontanen und Miniatur synaptischen Aktivitäten als diejenigen, die in der Abwesenheit von externen Stimuli auftreten definiert, wobei erstere mit der spontanen Zündung von Aktionspotentialen (Fig. 3). Diese schwachen synaptischen Aktivitäten werden mit kleineren Änderungen in der FM-Signale als die von umfangreichen Stimulation ausgelöst verbunden. Die Messung erfordert, daß die Veränderungen in der FM fluoreszierReferenzintensität genau widerspiegeln synaptischen Vesikel Endozytose oder Exozytose aber nicht artifactual Änderungen in der Intensität. Eine Ursache des Artefakts ist die Anwesenheit von nicht-spezifische Färbung der Plasmamembran durch FM-Farbstoffe. Schrittweise Auswaschung dieser Komponente wird zu einer allmählichen Veränderung der Fluoreszenzintensität gemessen, die fälschlicherweise synaptischen Aktivitäten zugeschrieben wird, zu führen. Dieser Faktor kann durch geeignete Methoden reduziert werden (siehe Protokoll). Die wichtigste Ursache des Artefakts ist das Bleichen von FM-Farbstoff in synaptischen Vesikeln erhalten. Die Photobleaching bedingte Veränderungen FM Intensität im Vergleich zu den biologischen (synaptischen) Änderungen, die gemessen werden klein sein. Die jüngste Entwicklung von empfindlichen Kameras, z. B. die Elektronenvervielfachungsladungsgekoppelte Vorrichtung (EM-CCD)-Kamera, ist es möglich, zu minimieren Bleichen durch Verkürzen Belichtungszeit und die Schwächung der Intensität des Lichts verwendet werden, um die Fluorophore anzuregen. Eine weitere Ursache des Artefakts ist eine Drift in die Fokussierung Niveau der Lichtmikroskop. Die Fokusdrift während eines Bildgebungssitzung kann durch mechanische oder thermische Effekte verursacht werden, und fälschlicherweise zu einer Änderung in der gemessenen Fluoreszenzintensität führen. Hier beschreiben wir Protokolle und Geräte, die es möglich, UKW-Farbstoffe verwenden, um synaptische Vesikel-Recycling auch im Rahmen von schwachen oder gar keine Stimulation zu analysieren, insbesondere das Miniatur synaptische Aktivität zu machen. Wir zeigen Beispiele für die Färbung und Entfärbung von Vesikeln während evozierte und spontane synaptische Ereignisse, mit kultivierten Hippocampus-Neuronen Nagetier, und die Abbildung der Entfärbung Phase. Wir zeigen auch, wie der Grad der FM Farbstoff Bleichen zu bewerten, in Abwesenheit von jedem FM-Farbstoffverlust durch synaptische Aktivitäten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pulse generator</td>
			<td>AMPI</td>
			<td>Master-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>DS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>This is used for assessing the cell morphology at low magnification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TiE</td>
			<td>This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. &#62;10 &#956;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032509</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032809</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXon EM+ DU-860</td>
			<td>This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid recirculating chiller</td>
			<td>Solid State Cooling Systems</td>
			<td>Oasis 160</td>
			<td>This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80&#176;C, and thereby reducing noise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>CoolLED-Custom Interconnect</td>
			<td>490 nm&#160;</td>
			<td>This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Solis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-21BRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast perfusion system</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-77B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D,L-AP5</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1069</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T35356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F35355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; balanced salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>51200-038</td>
			<td>This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities

Synaptische Vesikel in Nervenfunktionsterminals unterziehen Exozytose und Endozytose. Diese synaptischen Vesikel-Recycling kann mit FM Styryl-Farbstoffe, die Membran Umsatz offenbaren effektiv analysiert. Herkömmliche Protokolle für die Verwendung von FM-Farbstoffe wurden für die Analyse von Neuronen nach stimulierte (hervorgerufen) synaptische Aktivität entwickelt. Kürzlich Protokolle werden für die Analyse der FM-Signale, die schwächer synaptischen Aktivitäten, wie spontane oder Miniatur synaptischen Ereignisse begleiten verfügbar. Analyse dieser kleine Änderungen in FM-Signale erfordert, dass das Abbildungssystem ist empfindlich genug, um kleine Änderungen in der Intensität zu erfassen, doch ist ein Artefakt Änderungen mit großer Amplitude unterdrückt werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll, die angewendet werden, um hervorgerufen, spontan, und Miniatur-synaptischen Aktivitäten, und verwenden Sie kultivierten Hippocampus-Neuronen als Beispiel werden. Dieses Protokoll enthält auch ein Mittel zur Bewertung der Rate der Photobleichung des FM-Farbstoffe, da dies eine erheblicheQuelle von Artefakten bei der Abbildung von kleinen Änderungen in der Intensität.

Als Beispiel zeigen wir repräsentative Ergebnisse für die Entfärbung Zeitverlauf der synaptischen Vesikel (Abbildung 4). Hippokampalen Neuronen wurden mit FM4-64 angefärbt mit der spontanen synaptischen Aktivität (Schritt 2.3) und mit Farbstoff-freie Lösung (Spüllösung 2) gewaschen. Die Abbildungs ​​zeigt die Anfangs Entfärben Zeitverlauf mit Spontanaktivität (Schritt 5.3) (Anfangsteil der durchgehenden Linie, 4A). Dies wird durch die Entfärbung Zeitkurs mit drei Runden d...

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Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Wir beschreiben die Verwendung von Styryl FM Farbstoffe Bild synaptischen Vesikel-Recycling in der funktionellen Nervenenden. Dieses Protokoll kann nicht nur beschworen, sondern auch spontan und Miniatur synaptischen Tätigkeiten angewendet werden. Das Protokoll erweitert die Vielzahl von synaptischen Ereignisse, die effektiv ausgewertet werden können.

Die Untersuchung der synaptischen Vesikel Recycling Verwenden des UKW-Farbstoffe Während evozierte, spontan, und Miniatur Synaptic Aktivitäten

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

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20.9K Aufrufe.  University of Iowa Carver College of Medicine.  Wir beschreiben die Verwendung von Styryl FM Farbstoffe Bild synaptischen Vesikel-Recycling in der funktionellen Nervenenden. Dieses Protokoll kann nicht nur beschworen, sondern auch spontan und Miniatur synaptischen Tätigkeiten angewendet werden. Das Protokoll erweitert die Vielzahl von synaptischen Ereignisse, die effektiv ausgewertet werden können. 