Wir danken dem Wellcome Trust und dem ERC für finanzielle Unterstützung. IMGG ist ein EMBO-Fellow. KLH ist ein BBSRC finanzierte Doktorand. Wir danken Philip Rubin und Patrick Tidball für technische und Zellkultur-Unterstützung und Dr. Andrew Doherty für die Wartung und Unterstützung bei den Mikroskopen.

1. Cell Culture, virale Transduktion, und Protein Expression <ol><li> Kultur mit hoher Dichte hippocampalen Neuronen aus embryonalen Tag 18 (E18) Rattenbabys auf Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser für 14-25 Tage in vitro (DIV). </li><li> 6-24 Std. vor der Live-Experimente, transduzieren Zellen mit verminderter Sindbis-Virus enthält, der das Membranprotein von Interesse, mit dem Super-Ekliptik im Gegensatz zu GFP (SEP) markiert. </li><li> In den Pseudovirion-Medium direkt auf das Deckglas mit 1 ml konditioniertes Medium und wieder in den Inkubator. Der Titer und die Zeit für die Proteinexpression nach virale Transduktion wird abhängig von der Charge-Virus und sollte für jede Charge vor Beginn lebenden Zellen ermittelt werden. </li></ol> 2. FRAP-FLIP Live Cell Imaging <ol><li> Gerätesatz-up <ol><li> Übertragen Sie das Deckglas auf dem Imaging-Kammer eines Zeiss Axiovert LSM 510 META konfokalen Mikroskop.Um Leistungsschwankungen während der Bilderzeugung zu minimieren, sicherzustellen, das Mikroskop eingeschaltet ist, mit 100% Laserleistung, für mindestens 20 Minuten vor der Bebilderung. </li><li> Unmittelbar, ersetzen Sie das Kulturmedium mit vorgewärmten (37 ° C) Aufnahme extrazellulären Lösung mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM Glucose, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 mM HEPES (pH eingestellt 7,4 mit NaOH) und platzieren Sie die Kammer auf der vorgewärmten Bühne (37 ° C) des Zeiss Axiovert. Stellen Sie sicher, die Osmolarität der extrazellulären Recording-Lösung, um innerhalb von 10 mOsM Ihrer Kulturmedium eingestellt. Keine wesentliche Verdampfung auftritt während der Zeitverlauf des Experiments, aber dieses CO 2-unabhängige Lösung für kurze Experimente (&lt;10 Stunden). Die Ergänzung mit 1-2 mM Natriumbicarbonat wird empfohlen. </li></ol></li><li> Die Definition der Parameter Image Capturing <ol><li> Zuerst ermitteln die ein Neuron die Expression des rekombinanten ProProtein von Interesse und bringen sie in den Fokus. </li><li> Mit einem 63X Öl widersprochen, erwerben Sie ein Bild der gesamten Zelle mit 488nm Laserlicht Anregung bei geringer Laserleistung. Zur Minimierung von Ausbleichen, verwenden Sie einen schnellen Nenndrehzahl (7-9) und geringen Pixel-Auflösung (512 bis 512) halten insgesamt Scan-Geschwindigkeit &lt;1 Sekunde. </li><li> Wählen Sie einen Teil der Dendriten zu Bild und Zoom, um einen Rahmen mit dem ROI (~ 1,5 bis 2,5 x optischen Zoom) zu erfassen. Wo möglich, sicherzustellen, das Gesichtsfeld enthält mehrere Prozesse, so dass Messungen von Referenz-Dendriten erhalten werden kann, um festzustellen, ob nicht-spezifische Photobleichen aus dem Erwerb auftritt. </li><li> Veränderung der Filter aus, Pinhole, Scan-Geschwindigkeit und-Verstärkung, um maximale Fluoreszenz von minimal Laseranregung aber mit begrenzter Sättigung ermöglichen. Ein großer Durchmesser der Blende wird empfohlen, um Photon Sammlung zu maximieren (2 &amp;mgr; m eignet sich für die Stacheln und ternären Dendriten). Der Detektor Gain sollte stark genug sein, um kleinen Schritten Fluoreszenz zu erkennen,derart, dass die allerersten Bilder, vor dem Ausbleichen nicht überwunden 10% aus gesättigten Pixel. </li><li> Speichern Sie diese Konfiguration, um für die Pre-/ Post-Bleich-und Erholungsphasen des Experiments genutzt werden. </li><li> Weiter definieren die Photobleichmittels Regionen; Auswahl eines ROI für die anfängliche Photobleichmittels und flankierenden Regionen für die nachfolgende Phase wiederholende Ausbleichen. Sicherstellen, dass die flankierenden Bereiche sind breit genug, um Recovery durch Diffusion zwischen den Scans (typischerweise 5 um, siehe Abb. 2) zu verhindern. </li><li> Passen Sie die Parameter sowohl für Bleich-ROIs Photobleichmittels. Die anfängliche schnelle Photobleichmittel sollte (0,1-0,5 s) zwischen 1-5 Iterationen erforderlich, abhängig von der optischen Zoom und das Volumen des ROI sein. Für den flankierenden Regionen, sollte die Laseranregung eingestellt, um kontinuierliche Ausbleichen der flankierenden Regionen zu gewährleisten, aber ohne phototoxische Schäden. </li><li> Als Anhaltspunkt gilt, verwenden wir 100% Laser-Anregung für die anfängliche Photobleichmittels, und 10% für die sich wiederholenden Photobleaching phase. </li></ol></li><li> Bildaufnahme <ol><li> Nachdem alle Parameter eingestellt sind, führen Sie die FRAP-FLIP-Experiment als Variable Zeitraffer-Bildfolge, in den 4 Blöcken im Folgenden erläutert: Block 1: 10.03 Vorbleiche Basis-Images, bei niedrigen Laserleistung, keine Zeitverzögerung Block 2: Photobleichmittel die zentrale ROI bei voller Laserleistung, 1-5 Iterationen Block 3: 10.03 Post-Bleiche Recovery Images Block 4: Repetitive Photobleichmittels der flankierenden Bereiche mit mittlerer Laserleistung mit der Aufnahme von Bildern in einer typischen Verzögerung von 1 - 5 Sekunden, abhängig von der Recovery Rate des Proteins untersucht. </li><li> Schließlich ersetzen die extrazelluläre Recording-Lösung mit Recording-Lösung bei pH 6 mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM Glukose, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 mM MES (zu löschen Fluoreszenz) oder ergänzt mit 50 mM gepufferten NH4Cl mit 90 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM Glucose, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mMMgCl 2, 20-25 mM HEPES, pH 7,4 (um die Proteine ​​im niedrigen pH-Wert intrazellulären Speichern verraten), (siehe Abb. 2). </li><li> Sammeln von mindestens 10 bis 20 Datensätze für jede rekombinanten Proteins, die statistische Analyse zu ermöglichen. Um Voreingenommenheit Ergebnisse zu vermeiden, achten Imaging Bedingungen eingehalten werden konsistent repliziert. Entsorgen Sie Datensätze in denen eine unvollständige Bleichen, signifikante Brennebene Drift oder phototoxische Zellschädigung beobachtet werden. </li></ol></li></ol> 3. Datenanalyse <ol><li> Öffnen Sie die Bilder mit ImageJ-Software. </li><li> Richten Sie die Stapel auf Rechnung für kleine Schwankungen in der xy-Ebene, die im gesamten Zeitserie im Stackreg Plugin (Plugins → stackreg → Transformation aufgetreten sein könnten: starrer Körper → <ok> ). </ok></li><li> Für Bilder auf konfokalen Zeiss genommen, verwenden Sie die LSM-Toolbox-Plugin, um die Zeitwerte als Textdatei (Plugins → LSM-Toolbox → Show LSM-Toolbox Bericht → <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> ),und importieren Sie diese Werte in einer Analyse Tabellenkalkulation. </apply></apply></li><li> Um die Schwankungen bei der Fluoreszenz-FRAP-FLIP-Experiment zu messen, teilen die photogebleicht Segment in einzelne Pixel-Bereiche (~ 20pixels) und messen die mittlere Fluoreszenz von dieser ROIs zu jedem Zeitpunkt (F). Um schnell diese Werte zu erhalten, wählen Sie mehrere ROIs mit der ImageJ &quot;ROI-Manager&quot;-Analyse-Tool (Analyze → Extras → ROI-Manager) und melden Sie den mittleren Fluoreszenz pro Pixel unter Verwendung des &#39;Plot Z-Achse Profil &quot;-Befehl (Bild → Stapel → Plot Z Profil-Achse). </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt, um die Intensität der Fluoreszenz aus einem Hintergrund, nicht fluoreszierende Region zu messen. </li><li> Normalisieren der Fluoreszenzintensität zu jedem Zeitpunkt durch Subtrahieren die Hintergrundwerte der experimentellen Rauschen zu entfernen, und teilen alle Werte durch den Mittelwert vorgebleicht Baseline-Messung. </li><li> Messen der Fluoreszenzintensität der benachbarten nicht-photogebleicht Dendriten, die Höhe der nicht-spezifischen BeurteilungAusbleichen während der Akquisition. Korrektur für unspezifische Ausbleichen ist für die Interpretation von &#39;FRAP-Flip&#39; Daten entmutigen und sollte möglichst vermieden werden. </li><li> Um zu berechnen, wenn deutliche Erholung hat Platz in einer ROI genommen, subtrahieren Sie den Mittelwert der letzten 5-10 Maßnahmen der Sequenz aus dem Mittelwert der ersten 5-10 Maßnahmen (AF) und bestimmen die statistische Signifikanz. Kategorisieren Sie die Wiederherstellung und Rückgewinnung von Nicht-ROIs um das Muster der Exozytose (dh Exozytose Hotspots oder Wirbelsäule vs Welle Verwertung) zu beurteilen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Das Ergebnis der typischen FRAP-FLIP-Experiment wird in Abb. 2. Hier wurde eine Expression des Neurons GluA2 Untereinheit von AMPA-Typ Glutamat-Rezeptor, mit SEP markiert selektiv entlang eines Bereichs von Dendriten gebleicht. Abb. 2.A zeigt die Region von Dendriten, die abgebildet wurde, und gibt die ROIs, die für Ausbleichen (White-Box-Regionen) ausgewählt wurden. The große weiße Box-Gebiet wurde einst, gebleicht, gefolgt von sich wiederholenden Bleichen der flankierenden boxed Regionen, mit Doppelkopf blauen Pfeilen markiert. Der rote Pfeil zeigt die gemessene ROI, in starker Vergrößerung in den unteren Platten gezeigt. Abb. 2.B, zeigt die Fluoreszenzintensität in der gemessenen ROI über den Zeitverlauf des Experiments. In diesem Beispiel wurde eine Minute Erholungszeit nach der ersten Photobleichmittel aufgezeichnet, damit rohen Rezeptoren, den ROI durch laterale Diffusion in Kraft. Wenn die flankierenden Regionen gebleicht werden, wird das Fluoreszenzsignal von dieser hoch beweglichen Teil der Rezeptoren vom zentralen Bereich eingeschlossen ist, und die innerhalb der Region ausverdünnt werden. Der Anstieg der Fluoreszenz (AF) über das &quot;Flip&quot;-Sequenz kann daher beobachtet, um das Einsetzen des SEP-GluA2 in der dendritischen Welle zurückgeführt werden. Der niedrige pH-Wasch-und pH 7,4 + NH 4 Cl zusätzlich jeweils bestätigen, dass die gemessene Fluoreszenz von der Oberfläche abgeleitetProteine ​​und zeigen den Anteil der intrazellulären, einsamen Proteine ​​innerhalb der ROI gemessen. Im Gegensatz zu FRAP isoliert dieser Methode Wiederherstellung aufgrund Exozytose, was zu einer stark verringerten Grad der Fluoreszenz Erholung der photogebleicht Region. Um keine zuverlässigen mathematischen Modell bisher wurde entwickelt, um zu passen und zu analysieren, die Erholung aufgezeichneten Traces über diese selektive Bleichen Technik. Es ist jedoch möglich, die Erholung mit einer Mono-Spur exponentiellen Aufschwung fit machen: F (t) = A s - A 0 e (-t / τ) Wobei f (t) Fluoreszenz zum Zeitpunkt t, A s stationären Wert ist, A 0 die zum Zeitpunkt 0 versetzt ist, ist τ die Zeitkonstante. Die Erholung Wachstum mit einer gegebenen Rate festgelegt, um ein Gleichgewicht zu erreichen, entsprechend einem stationären Zustand zwischen Insertion und Diffusion. Wichtig ist, extrahiert die Zeitkonstante aus diesem einnalyse spiegelt nicht die Zeitkonstante der Exozytose und können nur für vergleichbaren Behandlungen für ein einzelnes Protein verwendet werden. Darüber hinaus ist das erwartete Muster von Fluoreszenz wieder wahrscheinlich in Unterbereichen entlang der photogebleicht Bereich beobachtet werden. Analyse von kleinen ROI innerhalb eines photogebleicht Segment wesentlich sein kann, um Exozytose &quot;Hotspots&quot; zu offenbaren und es ist ratsam, Regionen vergleichbarer Länge wie die Variabilität der Dichte dieser Flecken unter den Dendriten analysieren wird die berechnete Rate beeinflussen. 3 zeigt eine Erweiterung des Protokolls, die Anwendung des Photobleichmittels zu großer Teil ROI mit mehreren Dendriten in dem Sichtfeld, gefolgt von einer selektiven wiederholende Bleichen von nur einem Dendriten. Dieser Ansatz ermöglicht traditionellen &quot;FRAP&quot; und &quot;FRAP-FLIP&quot; Daten parallel erfasst werden. In diesem Beispiel haben hippocampalen Neuronen durch ein Glutamat-Rezeptor-Untereinheit der Klasse Kainat infiziert; GluK2 SEP-markiert. Prior, um Bildgebung, wurden diese mit Neuronen-cylcohexamide (2 Std. bei 200μg/ml), um die Proteinsynthese blockieren behandelt. Als solche Fluoreszenz Erholung in der jeweiligen gemessenen ROIs (Abb. 3.B) zeigt den Anteil der Wiederherstellung aufgrund laterale Diffusion und Recycling in der Standard-FRAP Dendriten im Vergleich zu Recycling allein in den Dendriten unterzogen, um die &#39;FRAP-Flip&#39; Protokoll. Vergleicht man die Werte aus der &amp;Dgr; FRAP versus &#39;FRAP-FLIP &quot;Verwertung Kurven, die jeweiligen Beiträge des Recyclings (AF rec = 11,05%) versus laterale Diffusion (AF diff = 9,35%) geschlossen werden kann. Im Gegensatz zu Abbildung 2, die Erholung nicht halten einen stabilen Zustand Ebene, sondern aufgrund der Hemmung der Proteinsynthese, zeigt ein vorübergehender Anstieg und nachfolgende Drop-off in Signal, entsprechend Erschöpfung des zur Verfügung stehenden Rezeptor-Pool (ca. 20% Rückgang beobachtet über die Aufnahme Zeitraum). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></p&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der Prinzipien der FRAP vs FRAP-FLIP-Protokolle Dieses Diagramm veranschaulicht die Ergebnisse einer regelmäßigen FRAP im Vergleich zu einem &#39;FRAP-Flip&#39; Protokoll, mit SEP-markierten Rezeptoren. Fluorescence Recovery in traditionellen FRAP ist auf der linken Seite gezeigt. Gemessen Fluoreszenzerholung im zentralen ROI ist eine Kombination der lateralen Diffusion f nicht photogebleicht SEP-markierten Rezeptoren von außerhalb der ROI photogebleicht und Einsetzen von Rezeptoren durch Recycling und / oder De-novo-Exozytose in die dendritische Welle zurückzuführen. Dagegen ist die sich wiederholende photogebleicht der flankierenden ROIs in der rechten Seite dargestellt ist, zeigt, wie diesem modifizierten &quot;FRAP-Flip &#39;Protokoll Schweigen Erholung durch laterale Diffusion. Als solches kann jede gemessene Fluoreszenz wieder auf direkte Insertion in der ROI zurückgeführt werden. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> Abbildung 2.Einfügen von SEP-GluA2 in die Plasmamembran auf der dendritischen Welle A) Eine Hippocampus exprimiert SEP-GluA2, selektiv entlang eines Bereichs von Dendriten gebleicht. Die Darstellung zeigt die Region von Dendriten, die abgebildet wurde, während der obere linke Panel unterstreicht die ROIs, die für Photobleaching ausgewählt wurden. Das große weiße Box-Gebiet wurde einst, gebleicht, gefolgt von sich wiederholenden Bleichen der flankierenden boxed Regionen, mit Doppelkopf blauen Pfeilen markiert. Diese Tafel zeigt die Dendriten vor Ausbleichen. Der rote Pfeil zeigt die gemessene ROI, in starker Vergrößerung in den unteren Platten gezeigt. B) zeigt die Fluoreszenzintensität in der gemessenen ROI über den Zeitverlauf des Experiments, dargestellt als Graupegel in dem ROI (nicht normalisiert). Der schwarze Pfeil markieren Sie den Zeitpunkt der ursprünglichen Photobleichmittels und grüne Pfeil zeigt den Beginn der repetitiven Ausbleichen. &amp;Dgr; Zeigt the Anstieg der Fluoreszenz über der Erholungsphase beobachtet werden, durch Einsetzen der September-GluA2 in den dendritischen Schaft. Nachfolgende niedrigen pH-Wert und pH 7,4 + NH 4 Cl Wäschen bestätigen, dass die Fluoreszenz wieder zu exprimierten Rezeptoren Oberfläche bezieht. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> Abbildung 3. Recycling &amp; laterale Diffusion vs Recycling von SEP-GluK2 auf der dendritischen Schaft nach Cyclohexamid Behandlung A) Ein Hippocampus ausdrückt SEP-GluK2, selektiv photogebleicht mit parallelen FRAP und &#39;FRAP-FLIP &quot;Verwertung Protokolle entlang getrennten dendritischen ROIs durchgeführt. Dieses Neuron war Gegenstand einer Vorbehandlung mit Cycloheximid, um die Proteinsynthese (2 Stunden bei 200 ug / ml) zu blockieren. Die Darstellung zeigt die Region von Dendriten, die abgebildet wurde, während die linke Hand Panel Hervorhebung der ROIs, die für Photobleaching ausgewählt wurden. The große weiße Box-Gebiet wurde einst, gebleicht, gefolgt von sich wiederholenden Bleichen der flankierenden Regionen boxed, der unteren Dendriten nur mit zwei Spitzen blauen Pfeilen markiert. Diese Tafel zeigt die Dendriten vor dem Ausbleichen. Rote Pfeile markieren die ROIs in hoher Vergrößerung in B gezeigt), welche die Fluoreszenz Erholung im traditionellen FRAP gegenüber dem &#39;FRAP-Flip&#39; Protokoll. Ein Vergleich der Werte der Fluoreszenzintensität in der späten Phase der Rückgewinnung (dritte Feld) für den Beitrag der lateralen Diffusion und Recycling gegenüber Recycling allein. C) zeigt die Fluoreszenzintensität in der gemessenen ROIs über den Zeitverlauf des Experiments, dargestellt als normierte Intensität Werte. Der schwarze Pfeil markieren Sie den Zeitpunkt der ursprünglichen Photobleichmittels und grüne Pfeil zeigt den Beginn der repetitiven Ausbleichen. &amp;Dgr; Rec zeigt den Einschwingvorgang durch Rezeptor-Recycling, von der FRAP / FLIP Dendriten bestimmt, während &amp;Dgr;Unterschied wird der Beitrag des lateralen Diffusion von SEP-GluK2 in den dendritischen Welle in der &quot;FRAP nur &#39;Return on Investment. Die vorübergehende Erhöhung wird durch allmählichen Rückgang der Signal entsprechend dem Herunterfahren der verfügbaren Rezeptoren durch Cycloheximid-Behandlung. Die anschließende niedrigen pH-Wert und pH 7,4 + NH 4 Cl Wäschen bestätigen, dass die Fluoreszenz wieder zu exprimierten Rezeptoren Oberfläche bezieht.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir beschreiben eine innovative Strategie, um die Komponenten des Plasmas Membranproteinen visualisieren. Der kombinatorische Ansatz von Photobleaching Techniken mit SEP-markierte Protein ermöglicht selektiv Plasmamembran Einfügung Ereignisse zu beurteilen. Durch die kontinuierliche Bleichen die Membranproteine ​​in flankierenden Regionen während der Genesung, beurteilt die &quot;FRAP-Flip &#39;Methode der Beitrag der Vesikeltransport zur Fluoreszenz Erholung. Dieser neue Ansatz ermöglicht die direkte Aufnahme von Protein Membraninsertion, so dass sowohl die Anzahl der Sub-Laderäumen, in denen Erholung beobachtet wird und die Amplitude der Erholung (AF) im stationären Zustand bestimmt werden. Ferner ermöglicht den Vergleich von FRAP mit und ohne FLIP der Anteil der Verwertung zurückzuführen laterale Diffusion zu berechnen. Darüber hinaus, im gleichen Experiment können Bereiche von nicht-photogebleicht Dendriten benachbart zu den flankierenden Regionen photogebleichtwährend der Erholungsphase qualitativ beurteilt; Fluoreszenz Verlust in diesen Regionen zu beobachten sein wird durch laterale Diffusion photogebleicht Rezeptoren in diesen nicht-photogebleicht Segmente des Dendriten. Diese selektive Photobleichen Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von zellulären Transports Verfahren, wie die Charakterisierung excocytosis in der Plasmamembran in definierten Teilbereichen (z. B. Dendriten oder Stacheln) oder die Bewertung des Beitrags der lateralen Diffusion vs Einsetzen durch die parallele FRAP und &quot;FRAP untersuchen -Flip &#39;Protokolle entlang benachbarten Dendriten (Abb. 3). Klar, während spezifische Leitlinien präsentiert wurden, wird jedes Labor benötigen Optimierung der Bildparameter nach bestimmten Proben und Ausrüstungen. Wichtig ist, dass alle Oberflächen-Rezeptoren in der ROI zu photogebleicht, unabhängig von der z-Achse Brennebene, jedoch ohne signifikante Beschädigung oder phototoxische unspezifische Ausbleichen. UnsERS sollten Vorsicht walten lassen, wenn versucht wird dieses Protokoll in der Zelle soma, wie den hohen Anteil an relativ niedrigen pH intrazelluläre Kompartimente führt in der Regel hohe Hintergrundfluoreszenz in diesen Regionen. Darüber hinaus, während wir haben gezeigt, wie diese Technik angewendet werden kann in unterschiedlich Wege, vor Beginn der selektiven Bleichexperimenten auf eine neue September-Tag bauen, empfehlen wir, dass eine erste Charakterisierung der ersten markierten Rezeptoren durchgeführt wird, wie von Ashby et al 2. Insgesamt ist diese Methode eine leistungsstarke und vielseitige Anpassung der Standard-FRAP-Protokoll, die das Einsetzen Ereignisse in Plasmamembran, um nahezu in Echtzeit ausgewertet werden.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Name des Reagenzes</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Kommentare (optional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24mm Deckgläsern</td&gt;<td&gt; VWR International</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poly-L-Lysin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td&gt; 1 mg in Boratpuffer zu beschichten Deckgläser</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasalmedium</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2% in neuronalen Plattieren und Nährmedium</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicillin Streptomycin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; 1% in neuronalen Plattieren und Nährmedium</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-Glutamin</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<td&gt; 2 mm / 0,8 mm in Ausplattieren / Fütterung Medium</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pferdeserum</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td&gt; 10% in neuronalen Plattierungsmedien nur</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PSIN ReP5 Klonierungsvektor</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; Für Sindbisvirus Produktion</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 META Konfokalsystem</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Image J Software</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Open-Access-Software. Alle hier beschriebenen Plugins sind verfügbar unter<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching

<p class="jove_content"&gt; Membranproteine ​​wie Rezeptoren und Ionenkanäle unterziehen aktiven Handel mit Neuronen, die stark polarisiert und morphologisch komplex sind. Diese gerichtete Menschenhandel ist von fundamentaler Bedeutung zu liefern, zu erhalten oder zu entfernen synaptischer Proteine.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Super-Ekliptik im Gegensatz zu GFP (SEP) ist eine pH-sensitive Derivat des eGFP wurde ausgiebig für Live Cell Imaging von Plasmamembranproteinen verwendet<sup&gt; 1-2</sup&gt;. Bei niedrigen pH-Wert sinkt Protonierung September Photonen-Absorption und Fluoreszenz-Emission eliminiert. Da die meisten intrazellulären Transport Ereignisse in Fächer mit niedrigem pH-Wert, wo September Fluoreszenz wird verfinstert, die Fluoreszenz-Signal vom September-markierte Proteine ​​auftreten, ist in erster Linie von der Plasmamembran, wo der September auf einen neutralen pH extrazelluläre Umgebung ausgesetzt ist. Bei einer hohen Intensität September beleuchtet, wie jeder Fluoreszenzfarbstoff, ist irreversibel lichtgeschädigter (photogebleicht)<sup&gt; 3-5</sup&gt;. Wichtig ist, weil niedrige pH-Photonen-Absorption löscht, nur ausgedrückt Oberfläche gebleicht September können während intrazelluläre September ist unbeeinflusst von der hohen Intensität Beleuchtung werden<sup&gt; 10.06</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) von September-markierten Proteinen ist eine komfortable und leistungsfähige Technik für die Beurteilung der Dynamik von Proteinen an der Plasmamembran. Wenn fluoreszierend markierten Proteine ​​in einem Bereich von Interesse sind gebleicht (ROI) die Rückgewinnung der Fluoreszenz tritt aufgrund der Bewegung des rohen SEP-markierte Proteine ​​in der gebleichten Region. Dies kann durch laterale Diffusion und / oder von Exozytose nicht photogebleicht Rezeptoren entweder durch zugeführt auftreten<em&gt; De-novo-</em&gt; Synthese oder Recycling (siehe Abb. 1). Der Anteil der bewegliche und unbewegliche Proteins bestimmt werden und die Mobilität und die Kinetik des diffusionsfähigen Fraktion kann unter basalen und stimulierten Bedingungen wie Agonisten Anwendung oder neuronale Aktivierung Reize wie NMDA oder KCl-Anwendung abgefragt werden<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Wir beschreiben Photobleaching Techniken entwickelt, um selektiv visualisieren die Erholung der Fluoreszenz zuzuschreiben Exozytose. Kurz gesagt, wird ein ROI einmal als mit Standard-Protokollen FRAP gebleicht, gefolgt, nach einer kurzen Erholung, durch wiederholtes Bleichen der flankierenden Regionen. Diese &quot;FRAP-Flip &#39;Protokoll, in unserem Labor entwickelt, wurde genutzt, um AMPA-Rezeptor-Handel bei dendritischen Dornen charakterisieren<sup&gt; 10</sup&gt;, Und ist anwendbar auf eine Vielzahl von Studien zur Bekämpfung den intrazellulären Transport und der Exozytose zu bewerten.</p

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Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Dieser Bericht beschreibt die Verwendung von Live Cell Imaging und Photobleichmittels Techniken, um die Oberfläche Ausdruck, Transportwege und-handel Kinetik der exogen exprimiert, pH-sensitiven GFP-markierten Proteine ​​an der Plasmamembran von Nervenzellen zu ermitteln.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

82.9K Aufrufe.  University of Bristol. Dieser Bericht beschreibt die Verwendung von Live Cell Imaging und Photobleichmittels Techniken, um die Oberfläche Ausdruck, Transportwege und-handel Kinetik der exogen exprimiert, pH-sensitiven GFP-markierten Proteine ​​an der Plasmamembran von Nervenzellen zu ermitteln.

Serie: Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Forschung

Neurowissenschaften

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Quantitative Analyse der synaptischen Vesikel Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Nervenzellen Granulat mit FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Vorbereitung der synaptischen Plasmamembran und Postsynaptische Dichte Proteinen mit einer diskontinuierlichen Saccharosegradienten

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...