Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI Grant-Nummern 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536, und 17 K 07086, MEXT KAKENHI Grant-Nummern 25110737 und 23110525, AMED Grant Nummer JP18ek0109311, und der SENSHIN Medical Research Foundation und der Japan unterstützt. Epilepsie-Forschungsgemeinschaft.

Animal Care und Use Committee des Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science stimmten alle experimentelle Verfahren. Postnatale 8 - 16 Wochen alten Mäusen empfohlen. Jede Inzucht Belastung ist akzeptabel für das Experiment. C57BL/6 Mäusen sind widerstandsfähiger gegen PTZ, während BALB/c und Swiss Albino-Mäuse für PTZ empfindlicher sind. C57BL/6 wurden in dieser Studie verwendet. Anfälligkeit für PTZ hängt auch vom Alter der Maus. Im Vergleich zu jüngeren Mäusen, sind ältere Mäuse mehr refraktär gegenüber PTZ-35. Die Zahl der Versuchstiere für diese Methode kann variieren, aber mindestens 6-10 Tiere sind für jede Bedingung erforderlich.
1. Vorbereitung des PTZ
<ol><li>2 mg/mL PTZ in steriler 0,9 % (w/V) NaCl auflösen. Bereiten Sie PTZ am Tag der Nutzung.</li>
</ol>2. Injektion von PTZ
<ol><li>Alle Experimente zwischen 09:00 und 12:00 (Mittag) durchführen.</li>
	<li>Körpergewicht des Tieres zu messen.</li>
	<li>Legen Sie das Tier in eine Beobachtung Kammer für Gewöhnung.</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen der PTZ-Lösung basierend auf das Körpergewicht des Tieres und die zuvor ermittelte Injektion Dosis Injektionslösung, zur Zeit der Gewöhnung (3 min). Hinweis: zum Beispiel bei 35 mg/kg PTZ wird 0,875 mg des PTZ ist erforderlich für eine Maus mit einem Gewicht von 25 g (35 mg / kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Daher sollte 437.5 μL einer PTZ-Lösung 2 mg/mL injiziert werden (0,875 mg/2 mg / mL = 0,4375 mL). Die Injektion Dosis von PTZ hängt von der Maus Genotyp und Belastung. Für Wildtyp C57BL/6 Mäusen empfiehlt sich eine Dosis von 30-35 mg PTZ/kg Körpergewicht für den ersten Versuch. Sensibilität für PTZ hängt die Maus verwendete Stamm36,37. Die Injektion Dosis variiert je nach dem Zweck des Experiments.</li>
	<li>Injizieren Sie PTZ intraperitoneal mit einer 1-mL-Spritze, ein 27-Gauge-Nadel in den linken oder rechten Quadranten des Abdomens des Tieres befestigt. Vermeiden Sie die Injektion an der Mittellinie.<ol>
<li>Vermeiden Sie wiederholte Injektionen an der gleichen Stelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tierische Verhaltensweisen für 30 min nach PTZ Verabreichung (Abbildung 1A), zu beobachten und klassifizieren und abnormale Verhalten der Gäste, wie unten gezeigt. Halten Sie die Tiere unter Beobachtung für 24 h oder mindestens eine zusätzliche 6-10 h nach der Injektion, wenn möglich, vor allem, wenn die Beschlagnahme schwere Partitur 3 erreicht oder höher.<ol>
<li>Hinweis: jede milde Anfälle oder Verhaltensänderungen bei den Tieren über den Beobachtungszeitraum von 30 Minuten. Dies verlängert die Beobachtung, dass Zeit eine besonders wichtige und vollständige Wirkung einer subconvulsive Dosis von PTZ in der Generation der chronischen unprovozierten Anfälle bei Epilepsie wenden kann.</li>
		<li>Darüber hinaus messen die Beschlagnahme Dauer jeder beobachteten Anfall als Änderungen in der Dauer der Beschlagnahme beziehen sich auf die Beschlagnahme schwere. Darüber hinaus ist die Latenz, der erste Anfall nach der PTZ-Injektion eine weitere wichtige Maßnahme zu sammeln. Überwachung der Beschlagnahme Häufigkeit, Dauer und Latenz ist entscheidend für jede Post-Beschlagnahme Molekulare Studien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injizieren Sie PTZ jeden zweiten Tag (Abbildung 1A). Die Anzahl der Injektionen richtet sich nach dem Ziel des Experiments. Repräsentative Beispiele sind wie folgt.<ol>
<li>Um vollständig angeheizte Tiere erzeugen, sobald ein Tier einen Anfall mit einer Punktzahl von 5 (Tonika-klonischen Anfall) Erfahrungen, beenden Sie die Injektion innerhalb von weiteren drei Verwaltungen. In diesem Fall erhöhen Sie die Injektion-Dosis, wenn die Beschlagnahme Punktzahl nicht für drei aufeinander folgende Verwaltungen steigt. Jedes Tier kann eine unterschiedliche Anzahl und Dosis der PTZ-Injektionen erhalten.</li>
		<li>Befestigen Sie die Anzahl und Dosis der PTZ-Injektion in jeder Bedingung, die Anfälligkeit für PTZ, einschließlich Bewertungen der Anti-Epilepsie-Medikamente und Untersuchungen des Phänotyps von genetisch veränderten Mäusen zu bewerten. Alle Tiere die gleiche Anzahl von PTZ-Injektionen zu geben; insgesamt 8 bis 12 Injektionen wird empfohlen. Wenn ein Tier stirbt, sollte die Beschlagnahme Partitur als 6 bezeichnet werden.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Injektion Dosis notwendig, einen hohen Anfall pflegen score (4 oder 5) für 10 oder mehr Injektionen, die histopathologischen Veränderungen zu studieren, die epileptische Anfälle auftreten. In diesem Fall sollte die Anzahl der gesamten Injektion von 25 bis 30 reichen. Die Injektion-Dosis zu verringern, wenn die Beschlagnahme Punktzahl 5 erreicht. Wenn die Beschlagnahme Partitur auf 3 oder niedriger sinkt, die Injektion-Dosis zu erhöhen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Beschlagnahme Score
<ol><li>Beobachten Sie die tierische Verhaltensweisen zu und zeichnen Sie der Ergebnisse auf.<ol>
<li>Klassifizieren und schieße die epileptischen Verhaltensweisen wie folgt38,39 (Abbildung 1 b): 0: normales Verhalten, keine Anomalie. 1: Immobilisierung, am Bauch liegen. 2: Kopf nicken, Gesichtsbehandlung, vordergliedmaße oder Megalosauridae Myoklonien. 3: kontinuierliche Ganzkörper-Myoklonus, myoklonische wichst, Rute steif gehalten. 4: Kindererziehung, tonische Beschlagnahme, auf seiner Seite nach unten fallen. 5: Tonika-klonischen Anfall, Herunterfallen auf den Rücken, wild hetzen und springen. 6: Tod.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ändern Sie die verhaltensbezogenen Kriterien anhand der Racine Partitur40, abhängig von den experimentellen Bedingungen.</li>
</ol>4. nach dem Anfall Analyse
<ol><li>Immunohistopathological Analyse<ol>
<li>Perfusion Fixierung<ol>
<li>Vorbereitung<ol>
<li>4 % (w/V) Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) auflösen. Erhitzen Sie die Lösung auf etwa 70 ° C mit dem Zusatz von einem Tropfen 1 M NaOH (ca. 1 M NaOH für 50 mL-PFA-Lösung 1 µL).</li>
				<li>Bereiten Sie eiskalte 4 % PFA und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
				<li>Richten Sie eine Peristaltische Pumpe mit Schlauch und Nadel. Laufen Sie etwa 20 mL Wasser durch das Rohr um Rückstände zu löschen. Dann setzen Sie das offene Ende des Röhrchens in eiskaltem PBS.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Transcardial Perfusion und Vorbereitung von festen Gehirn<ol>
<li>Die Maus mit 50 % isoflurane/50% Ethanol in ein kleines Glas tief zu betäuben.</li>
				<li>Halten Sie die Maustaste in Rückenlage durch die Spitzen ihrer Vorderbeine und Hinterbeine festhalten.</li>
				<li>Schneiden der ventralen Mittellinie des Bauches und setzen das Zwerchfell.</li>
				<li>Schneiden Sie die Membran entlang der Küsten. Dann schneiden Sie beide Seiten der Rippen und des Körpers. Xiphoid Prozeß durch die Verriegelung Zange zusammendrücken und evert den Brustkorb. Pflegen Sie die Position des Xiphoid Prozeß durch fixieren es mit einer Nadel oder mit der Pinzette kneifen. Setzen Sie das Herz aus.</li>
				<li>Stechen Sie die Nadel in die linke Herzkammer und machen Sie einen Schnitt in den rechten Vorhof mit einer Schere. Achten Sie darauf, nicht die Nadel ins Herz, zu weit zu treiben, da es eine Innenwand durchbohren kann.</li>
				<li>Beginnen Sie einen stetigen Strom von eiskaltem PBS durch die Nadel das Blut (ca. 15-20 mL/min) zu waschen.</li>
				<li>Wenn das Blut aus dem Körper abgebaut ist, bewegen Sie das Rohr zu einer 4 % Paraformaldehyd Lösung (ca. 60 mL) ohne Zusatz von Luftblasen. Halten Sie dann die Durchblutung.</li>
				<li>Schneiden Sie die hinteren Nacken und Wirbelsäule und die Kopfhaut und die dorsalen Teil des Schädels mit präparierscheren abziehen.</li>
				<li>Schneiden des Zwischenkieferbeins Knochens zwischen den Augen Bahnen und der dorsalen Teil des Schädels vollständig zu entfernen.</li>
				<li>Erstellen Sie eine Lücke zwischen dem Gehirn und jugal Knochen von der hinteren Seite und schneiden Sie die Trigeminal Nerven und Optik Chiasmus unterhalb des Gehirns. Nehmen Sie das Gehirn vorsichtig und legen Sie sie in ein Fläschchen mit 4 % PFA. Nach dem Beheben des Gehirns bei 4 ° C für 12-16 Uhr.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gehirn-Scheibe-Vorbereitung<ol>
<li>Übertragen Sie die feste Gehirn auf 20 % Saccharose/PBS, bis das Gehirn die Lösung versinkt, um Cryoprotection zu ermöglichen.</li>
			<li>Schneiden Sie die feste Gehirn anhand der benötigten Scheibe Orientierung und erforderliche Teil des Gehirns.</li>
			<li>Legen Sie die Cryomicrotome. Setzen Sie das Messer in Position und halten Sie die Mikrotom-Bühne bei einer Temperatur unter-20 ° C.</li>
			<li>Platzieren Sie die vorgeschnittene Gehirn auf der Bühne und das Gehirn mit 20 % Saccharose/PBS Mantel. Die Saccharose/PBS-Lösung wird nach und nach Einfrieren, die das Gehirn auf der Bühne, bis das Gehirn vollständig in gefrorenen 20 % Saccharose/PBS eingebettet ist.</li>
			<li>Schneiden Sie das Gehirn (30 µm Dicke) durch Verschieben der Klinge durch das Gewebe. Übertragen Sie die Scheiben in PBS und halten sie bei 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fluoreszierende immunohistochemistry<ol>
<li>Waschen Sie die notwendigen Scheiben in 0,1 % Triton X-100/PBS (PBST) für 10 min, 3 Mal bei Raumtemperatur (RT).</li>
			<li>Die Scheiben zu blockieren, indem Brüten sie in PBST mit 2 % Ziege Serum oder 5 % Rinderserumalbumin (BSA) für 1-2 h bei RT</li>
			<li>Inkubieren Sie die Scheiben in einer Antikörperlösung mit der geeigneten Konzentration der Primärantikörper in PBST mit 2 % Ziege Serum oder 5 % BSA für 1 bis 7 Übernachtungen bei 4 ° c</li>
			<li>Waschen Sie die Scheiben in PBST für 10 min, 3 Mal bei RT</li>
			<li>Inkubieren Sie die Scheiben in eine sekundäre Antikörper-Lösung mit der geeigneten Konzentration der Sekundärantikörper in PBST 1-2 h bei RT, lichtgeschützt.</li>
			<li>Montieren Sie die Scheiben auf Objektträger und mit Eindeckmittel und Deckglas abdecken.</li>
			<li>Beobachten Sie die Scheiben mit Fluoreszenz-Mikroskopie.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Drei-Kammer-test<ol>
<li>Vorbereitung<ol>
<li>Bereiten Sie mindestens 2 2-6-Monate-alten 129/Sv Mäuse des gleichen Geschlechts wie das Thema Mäuse, die "fremde Maus." Alle Mäuse in den Käfig vor der Analyse zu gewöhnen. Platzieren Sie für jede Trainingseinheit den Mauszeiger in den Käfig und lassen Sie die Maus für 15 Minuten.</li>
			<li>Reinigen Sie vor jeder Gewöhnung Phase mit dem Thema Maus den gesamten Apparat und beide Käfige durch Abwischen der Oberfläche mit 70 % Ethanol.</li>
			<li>Legen Sie die leere Käfige in den beiden seitlichen Kammern der 3-Kammer-Vorrichtung und öffnen Sie die Türen zwischen den Kammern.</li>
			<li>Um das Thema Maus gewöhnen, legen Sie eine Thema Maus in der Mitte der Kammer und lassen Sie die Maus, um frei zu bewegen, während das Gerät, bis die Maus die beiden Käfige untersuchte, plus eine zusätzliche 5 min. Thema Tiere, die ängstlich des Käfigs möglicherweise nicht untersuchen Sie den Käfig für 20 min und sollte nicht für diese Analyse verwendet werden. Solche Tiere vermeiden Sie den Käfig und kommen nur selten in der Nähe des Käfigs.</li>
			<li>Nachdem das Tier bewegt sich in die Mitte der Kammer, schließen Sie die Türen und lassen Sie die Maus in die Mitte-Kammer für 5 min frei bewegen. Während dieser Zeit legte eine der 129/Sv Mäuse in einem Käfig, in den Käfig zu gewöhnen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sozialität Analyse<ol>
<li>Diese Analyse unmittelbar nach der Gewöhnung Periode der Thema Maus durchführen.</li>
			<li>Legen Sie den Käfig mit einem 129/Sv-Maus, bezeichnet die "fremden 1 Käfig", in einem der Nebenräume und legen Sie die leeren Käfig, genannt den "Objekt-Käfig", in die andere Seite-Kammer.</li>
			<li>Öffnen Sie die Tür und überwachen Sie das Verhalten der Maus Thema zu.</li>
			<li>Erlauben Sie die Thema Maus frei für 10 min bewegen und zeichnen die folgenden verhaltensbezogene Parameter. Wenn die Thema Maus die Maus in der fremde 1 Käfig fürchtet wie angegeben mit der Maus den fremden 1 Käfig zu vermeiden und in der Ecke einer der Kammern bleiben, sollte das Tier nicht für die Analyse verwendet werden. (a) Zeit in jeder Kammer, der fremde 1 Kammer, Objekt Kammer und Zentrum Kammer. (b) Zeit jeder Käfig, den fremden 1 Käfig und der Objekt-Käfig zu untersuchen. (Die Maus gilt als den Käfig zu untersuchen, wenn die Maus schnüffeln ist oder Toughing Maus oder Käfig) (c) die Anzahl der Eingänge in jeder Kammer (optional) (d) insgesamt zurückgelegte Strecke (optional)</li>
			<li>Nachdem die Maus in die Mitte der Kammer bewegt, schließen Sie die Türen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Analyse der sozialen Neuheit<ol>
<li>Diese Analyse unmittelbar nach der Sozialität Analyse durchführen.</li>
			<li>Wischen Sie beide Käfige mit 70 % Ethanol.</li>
			<li>Setzen Sie eine andere 129/Sv-Maus in einem der Käfige, bezeichnet den "Fremden 2 Käfig" und Ort der fremden 2 Käfig in einer der Kammern. Platzieren Sie die fremden 1 Maus in den anderen Käfig, genannt den "fremden 1 Käfig", und legen Sie den fremden 1 Käfig in die andere Kammer.</li>
			<li>Öffnen Sie die Tür und überwachen Sie das Verhalten der Maus Thema zu.</li>
			<li>Ermöglichen Sie die Thema Maus frei für 10 min bewegen und Messen Sie die gleichen Verhaltensstörungen Parameter für die Sozialität Analyse beschrieben. Hinweis: Die fremde 1 und 2 fremden Maus sollte nach dem Zufallsprinzip gewählt werden. Der fremde 1 Kammer und Objekt Kammer sowie der fremden 1 Kammer und fremder 2 Kammer sollte nach dem Zufallsprinzip bestimmt werden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Kontextbezogene Angst vor Diskriminierung<ol>
<li>Klimaanlage<ol>
<li>Vor jeder Prüfung Klimaanlage Reinigen der experimentellen Apparat durch Abwischen der Oberfläche mit 70 % Ethanol.</li>
			<li>Legen Sie eine Maus in einer Klimaanlage-Apparatur mit besonderen Bedingungen (Apparat Form, Wandfarbe, Bodenmaterial, Geruch, Beleuchtung und Lautstärke Hintergrund vorab festgelegt werden). Zum Beispiel war die Klimaanlage Vorrichtung verwendet hier einen quadratischen Apparat mit klare Plexiglas Wände, ein Metallgitter-Boden, ein Ethanol Geruch 100 Lux Helligkeit und 65 dB Hintergrund weißes Rauschen.</li>
			<li>Zustand die Maus durch Fuß-Schock mit pseudo-zufällige Timing von 0,1 mA Elektroschocks für 2 s X 3 Mal im Laufe von 5 Minuten.</li>
			<li>Die Maus nach Klimaanlage nach Hause Käfig zurück.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Speicher-Bewertung<ol>
<li>Reinigen Sie vor jeder Bewertung den experimentellen Apparat durch Abwischen der Oberfläche mit 70 % Ethanol.</li>
			<li>Am nächsten Tag folgende Klimaanlage, platzieren Sie den Mauszeiger in der gleichen Apparatur als Schock-Zustand und die Gefrierzeit im Laufe von 5 min zu messen.</li>
			<li>Später platzieren Sie am selben Tag, den Mauszeiger in einem neuartigen Apparat und Messen Sie die Gefrierzeit während einer 5-min-Bewertung. Hier wurde eine dreieckige Apparat mit weißem Plexiglas Wände, Platte Boden, kein Geruch, 30 Lux Helligkeit und 70 dB weißes Rauschen verwendet.</li>
			<li>Die Gefrierzeit zwischen den gleichen Zustand und neuartige Zustand zu vergleichen. Die Mäuse mit einer normalen Speicher-Fähigkeit werden mehr in dem gleichen Zustand als im Roman Zustand einfrieren. Das Einfrieren ist definierten Unbeweglichkeit des Tieres für mehr als 2 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Hier präsentieren wir Ihnen eine allgemein zugängliche Protokoll für die Errichtung einer pharmakologischen Tiermodell der Epilepsie. PTZ-vermittelten chemischen anzünden hat eine lange Geschichte und ist ein allgemein anerkanntes Modell für die Untersuchung der Histopathologie und Cellular Pathologie von Epilepsie41. Das chemische anzünden-Modell der Epilepsie wurde zuvor von Suzdak und Jansen, 199542geprüft. Pharmakologische Beschlagnahme Induktion, vor allem mit P...

Epilepsie ist eine chronische neurologische Erkrankung, die zeichnet sich durch wiederkehrende Anfälle und betrifft etwa 1 % der Menschen. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Epileptogenesis und Beschlagnahme Generation bei Epilepsiepatienten können nicht vollständig in den klinischen Studien geklärt werden. Daher ist einem geeigneten Tiermodell zur Erforschung der Epilepsie1erforderlich.
Eine Vielzahl von Tiermodellen der Epilepsie haben verwendet worden, zu untersuchen, die Physiologie der Epilepsie und Antiepileptika Medikamente2,3zu identifizieren. Unter diesen Modellen ist die pharmakologische Beschlagnahme Induktion eine gängige Methode zur Erzeugung von einem Tiermodell zur Untersuchung von der Pathologie des Epilepsie-4. Diese Methode ist kostengünstig und einfach. Elektrode-vermittelten anzünden ist auch eine häufig verwendete Methode, aber die Kosten dieses Verfahrens sind höher, und die Methode erfordert chirurgische und elektrische Fähigkeiten, sich wiederholende Anfälle5zu induzieren.
Pharmakologische Induktion ist auch vorteilhaft, da das Timing und die Zahl der Sicherstellungen von leicht gesteuert werden. Genetischer Mausmodelle, die spontanen Anfälle aufweisen sind auch in der Studie von Epilepsie verwendet. Vorhersagen, wann und wie oft die Anfälle in diesen genetischen Modellen auftreten kann jedoch unmöglich6sein. Ein monitoring-System ist erforderlich, um das epileptische Verhalten von genetisch veränderten Mäusen6zu beobachten.
Kainic Säure, Pilocarpin und Pentylenetetrazole (PTZ) sind als Beschlagnahme-induzierende Medikamente7verbreitet. Kainic Säure ist ein Agonist für Glutamat-Rezeptoren und Pilocarpin cholinerge Rezeptoren aktiviert. PTZ ist ein Gamma-Aminobuttersäure (GABA)-ein Rezeptor-Antagonist-8. PTZ unterdrückt die hemmenden Synapsen-Funktion führt zu erhöhter neuronaler Aktivität. Dieser Verordnung verursacht Generalisierte Anfälle in Tiere9. Eine einmalige Injektion von Kainic Säure und Pilocarpin induzieren kann akute Anfälle, vor allem Status Epilepticus (SE)10,11 und Kainic Säure - oder Pilocarpin-vermittelten SE fördert chronische spontane und wiederkehrende Anfälle12 , 13. EEG (EEG) Aufnahmen und Verhaltensanalyse haben gezeigt, dass spontane wiederkehrende Anfälle pro Monat nach einer einzigen Injektion12,13eingehalten werden. Eine einmalige Injektion einer konvulsiven Dosis von PTZ induziert auch akuten Anfall. Chronische spontane Anfälle nach einer einzelnen Injektion des PTZ sind jedoch schwer zu fördern. Chronische Verabreichung von PTZ ist erforderlich, um sich wiederholende Anfälle14zu induzieren. Bei beiden Methoden ist die Generation der sich wiederholende Anfälle in der Lage, eine Pathologie der menschlichen Epilepsie ähnlicher als die Generation der akute Anfälle auslösen. Bei PTZ jeder Injektion erinnert an einen Anfall, und Beschlagnahme Schweregrad wird in gewissem Sinne schrittweise bei jeder Injektion schwerer. Zu guter Letzt induziert eine niedrig dosierte PTZ Injektion einen schweren Tonikum-klonischen Anfall. In dieser Phase ruft jeder Injektion schwere Anfälle. Darüber hinaus ändern die Beschlagnahme Latenz und Dauer auch im Laufe der Injektionen. Die Latenz zu tonischen Anfall wird oft in der Spätphase der kindling15verkürzt. Darüber hinaus ist eine verlängerte Beschlagnahme Dauer16Beschlagnahme Verschlimmerung begleitet. Untersuchen die molekulare Mechanismen zur Regulierung der Beschlagnahme schwere, ist Latenz und Dauer nützlich für das screening von Antiepileptika Medikamente17,18,19.
Anfälle sind häufig durch eine einzelne systemische Verabreichung von PTZ induziert, und die Erholung ist sehr schnell, innerhalb von 30 min4,5. So ist die Zahl der Sicherstellungen im PTZ-anzünden-Modell besser kontrollierbar. Allerdings hat das EEG Überwachung angedeutet, dass generalisierte Spikes bis zu 12 h nach PTZ-vermittelten Beschlagnahme20gesehen werden können. Tiere sollten daher vorzugsweise unter Beobachtung für 24 h nach der Tonika oder myoklonische Anfall21 für eine genauere Analyse der Mechanismen, Kleinholz bleiben.
Die Verabreichung von Medikamenten Antiepileptika, z. B. Ethosuximide, Valproat, Phenobarbital, Vigabatrin und retigabin3, vor oder nach der Injektion PTZ mildert die Verschlimmerung der Beschlagnahme Schweregrad3,22, 23. Ebenso zeigten Knockout-Mäusen, dass Beschlagnahme Exazerbation, wie Matrix-Metalloproteinase-9-24, FGF-2225 und Neuritin26, fehlende Gene beteiligt zu reduzierten Beschlagnahme Schweregrad nach PTZ Mehrfacheinspritzungen aufweisen. Darüber hinaus beobachten histopathologische Veränderungen nach epileptische Anfällen ist mit dieser Methode möglich. Bei Patienten mit Temporallappen-Epilepsie gibt es typische histologische Veränderungen im Gehirn, wie moosige Faser sprießen,27,28, abnorme Granulat Neuron Migration29, Astrogliosis30, neuronale Zelle Tod im Hippocampus31,32und hippocampale Sklerose33. Ähnliche Veränderungen sind bei epileptischen Modell Tieren beobachtet. Unter den verfügbaren Methoden ist PTZ-vermittelten chemischen anzünden eine gute, reproduzierbare und kostengünstige Methode, einem Tiermodell der Epilepsie zu produzieren. In einem Pilocarpin-vermittelten SE Modell Anfallskontrolle ist schwierig und viele Mäuse sterben oder nicht SE34weiterentwickeln. Im Gegensatz dazu sind Sterblichkeit und schwere Anfall besser kontrollierbar im PTZ Modell. Darüber hinaus PTZ ist weniger teuer als Kainic Säure und Maus Gehirnchirurgie sind nicht für die Medikamentengabe erforderlich.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pentylenetetrazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>MANAC</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>CLEA Japan</td>
			<td></td>
			<td>C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle(27G x 3/4&#34;) (0.40 x 19 mm)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scale</td>
			<td>Mettler</td>
			<td>PE2000</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&#38;D company.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristatic pump</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>SJ1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>30404-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-700</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-synaptoporin antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>102 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ZnT3 antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>197 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-doublecortin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contextual fear discrimination test apparatus</td>
			<td>O&#39;hara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three chamber test apparatus</td>
			<td>Muromachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pentylenetetrazole-induced kindling mouse model

Pentylenetetrazole (PTZ) ist ein GABA-A-Rezeptor-Antagonist. Eine intraperitoneale Injektion von PTZ in ein Tier induziert einen akuten, schweren Anfall bei einer hohen Dosis während sequenzielle Injektionen einer subconvulsive Dosis für die Entwicklung von chemischen kindling, eine Epilepsie-Modell verwendet wurden. Eine niedrig dosierte Injektion des PTZ induziert einen leichten Anfall ohne Krampf. Jedoch verringern sich wiederholende niedrig dosierte Injektionen von PTZ die Schwelle um einen krampfartigen Anfall hervorrufen. Kontinuierliche niedrig dosierte Verabreichung von PTZ induziert schließlich einen schweren Tonikum-klonischen Anfall. Diese Methode ist einfach und vielseitig einsetzbar, die Pathophysiologie der Epilepsie, die ist definiert als eine chronische Erkrankung, die sich wiederholende Anfälle beinhaltet zu untersuchen. Diese Chemikalie Anfeuerholz Protokoll verursacht wiederkehrende Anfälle bei Tieren. Mit dieser Methode schätzte Anfälligkeit für PTZ-vermittelten Anfälle oder der Grad der Erschwerung von epileptischen Anfällen. Diese Vorteile führten zu die Verwendung dieser Methode für das screening von Antiepileptika Medikamente und Epilepsie-Genen. Darüber hinaus wurde diese Methode zur neuronalen Schaden nach epileptischen Anfällen zu untersuchen, weil die histologischen Veränderungen in den Gehirnen von epileptischen Patienten auch in den Gehirnen der Chemikalie angezündet Tiere erscheinen. Somit eignet sich dieses Protokoll für die Herstellung von bequem Tiermodellen der Epilepsie.

Wiederholte Injektion von PTZ induziert eine Steigerung im Anfall Schweregrad. Sechs C57BL/6 Mäusen mit PTZ behandelt wurden, und ein weiteres 6 Mäuse mit Kochsalzlösung als Kontrollgruppe behandelt wurden. Die PTZ-Dosis betrug 35 mg/kg und 10 Injektionen verabreicht wurden. Die Beschlagnahme Punktzahl stieg allmählich mit PTZ-Injektionen, während keine Anfälle oder abnormen Verhaltensweisen durch Kochsalzlösung Injektionen (Abbildung 2) hervorgerufen ...

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Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des chemischen anzünden mit Pentylenetetrazole und bietet einem Mausmodell der Epilepsie. Dieses Protokoll kann auch zur Anfälligkeit für Beschlagnahme Induktion und Pathogenese nach epileptischen Anfällen bei Mäusen zu untersuchen.

Pentylenetetrazole-induzierten anzünden-Maus-Modell

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

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Neuroscience

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Pharmacotherapy of the Epilepsies

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Serie: Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Nachweis von neuritischen Plaques bei Alzheimer-Maus-Modell

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Methoden zur intravenösen Selbstverwaltung in einem Maus-Modell

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex three-dimensional retinal blood vessels and capillaries by creating a two-dimensional flat-mount of the interconnected vascular channels after digestion of the non-vascular components of the retina. This allows one to study various pathologic vascular changes, such as microaneurysms, capillary degeneration, and abnormal endothelial to pericyte ratios. However, the method is technically challenging, especially in mice, which have become the most widely available animal model to study the retina because of the ease of genetic manipulations 6,7. In the mouse eye, it is particularly difficult to completely remove the non-vascular components while maintaining the overall architecture of the retinal blood vessels. To date, there is a dearth of literature that describes the trypsin digest technique in detail in the mouse. This manuscript provides a detailed step-by-step methodology of the trypsin digest in mouse retina, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Trypsin digest is one of the most commonly used methods to analyze retinal vasculature. This manuscript describes the method in detail, including key alterations to optimize the technique and remove the non-vascular tissue while preserving the overall architecture of the vessels.

Trypsin Digest Protokoll zum Analysieren des retinalen Gefäßsystem eines Maus-Modell

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

Die Hornhaut-Mikrotest: Ein Modell der Angiogenese bei der Maus Augen

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Mess Progressive neurologische Behinderungen in einem Mausmodell der Multiplen Sklerose

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

Neurobehavioral Bewertungen in einem Mausmodell der Neugeborenen hypoxisch-ischämische Hirnschädigung

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

In Vivo Multimodale Bildgebung und Analyse der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation Mausmodell

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

Die Maus Hinterhirn als Modell für die Erforschung embryonaler Neurogenese

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique VGAT-Cre mice were used in developing spontaneous recurring seizures (SRS) after kindling and a likely mechanism - insertion of Cre into the VGAT gene - disrupted its expression and reduced GABAergic tone. The present study extends these observations to a larger cohort of mice, focusing on key issues such as how long the SRS continues after kindling and the effect of the animal's sex and age. This report describes the protocols for the following key steps: making headsets with hippocampal depth electrodes for electrical stimulation and for reading the electroencephalogram; surgery to affix the headset securely on the mouse's skull so that it does not fall off; and key details of the electrical kindling protocol such as duration of the pulse, frequency of train, duration of train, and amount of current injected. The kindling protocol is robust in that it reliably leads to epilepsy in most VGAT-Cre mice, providing a new model to test for novel antiepileptogenic drugs.

This report describes the methods to generate a model of temporal lobe epilepsy based on the electrical kindling of transgenic VGAT-Cre mice. Kindled VGAT-Cre mice may be useful in determining what causes epilepsy and for screening novel therapies.

Präparation und Implantation von Elektroden für elektrisch anzündende VGAT-Cre-Mäuse zur Erstellung eines Modells für Temporallappenepilepsie

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...